专利名称：：用于阿特拉津降解的混合细菌培养物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及使用来自s-三嗪(s-triazine)污染土壤的专一性生长和分解代谢特性的混合细菌培养物降解阿特拉津和其他s-三嗪化合物的微生物方法。
背景技术：
：阿特拉津(6-氯-N-乙基-N，异丙基-[1，3,5]三嗪-2，4-二胺)是不仅在农用地而且在更广泛的土地上用于阔叶草控制的s-三嗪除草剂。阿特拉津超过30年的广泛使用和在土壤中相对较高的流动性已经导致其在地表水和地下水中以超过最大允许水平的浓度(在美国为3ppb,在欧洲为l-2ppb)以日益增加的频率检测到。这种事实和对其生物毒性和生态毒性的增加的担忧已经激起了阿特拉津生物降解性的研究，其目的是发展微生物学方法来加速阿特拉津污染的地方的生物降解过程。迄今为止已经出版许多论文来处理来自阿特拉津污染土壤的微生物培养物的分离，它们在转化或者将阿特拉津完全降解成无机化合物方面具有显示了活性(BehkiRM和KhanSU1986J.Agric.FoodChem.34:746-749;BehkiRM和KhanSU1994J.Agric.FoodChem.42:1237-1241;RadosevichM,HaoY-L，TrainaSJ和T丽inenOH1995Appl.Environ.Microbiol.61:297-302;MandelbaumRT,AllanBH和WackettLP1995Appl.Environ.Microbiol.61:1451-1457;Yanze-KontchouC和GschwindN1995J.Agric.FoodChem.43:2291-2294;BouquardC，0uazzaniJ，P，JC，Miche卜BriandY&PlesiatP1997Appl.Environ.Microbiol.63:862-866;SparlingG，DragtenR，AisabieJ和FraserR1998Aus.J.SoilRes.36:557-570;ToppE，ZhuH,NourSM，HouotS，LewisM和CuppelsD2000Appl.Environ.Microbiol.66:2773—2782;MartinezB，Tomkins,WackettLP,WingR和SadowskyML2001J.Bacteriology19:5684-5697;RalebitsoTK,SeniorE和VerseveldHW2002，Biodegradation13:11-19)。通过所研究的阿特拉津降解培养物，单培养物或者混合培养物，革兰氏阴性杆状细菌被报道为最具活性。但是，存在曰益增加数量的有关一些革兰氏阳性菌(特别是那些属于化"r力'wVw和^r^wfe"er属的细菌)的报道，它们能够降解阿特拉津和其他s-三嗪化合物并显示在含有这些物质作为碳源和氮源的矿物培养基中生长的能力。(StrongLC,RosendahlGJohnsonG，SadowskyMJ和WackettLP2002Appl.Environ.Microbiol.68:5973-5980)。通过纯化培养，到目前为止/^eycto/70朋s菌株ADP已经成为最广泛研究的细菌菌种。该菌株是在需氧和厌氧条件下被广泛研究的阿特拉津分解代谢的参考菌株，具有编码阿特拉津转化成氰尿酸的被测定分解代谢基因序列(虫A-deSouzaML，SadowskyMJ,WackettLP1996J.Bacteriol.178:4894-4900;"』-Boundy-Mi1IsK,deSouzaML,MandelbaumRM，WackettLP和SadowskyMJ1997Appl.Environ.Microbiol.63:916-923以及"SadowskyMJ,TongZ,deSouzaML和WackettLP1998Bacteriology180:152-158)以及编码氰尿酸随后降解成二氧化碳、铵离子和氯离子的其他三个基因(^力EF)(Garcia-GonzalezV，GovantesF,PerruaO和SanteroE2005J.Bacteriol187:155-167)。在美国专利US5508193中，描述了用于i^ej^o/如w印.菌株ADP分离的方法，以及用于其最佳生长和阿特拉津矿化活性的条件。该细菌被显示在作为少量污染特性的相当低的阿特拉津浓度("0ppb)下以及高阿特拉津浓度(2000ppb)下(诸如在溢出部位)(来自集约农业流掉的水，除草剂处理位置和农业化学经销位置)或者在来自阿特拉津和其他含有s-三嗪化合物的制备车间的工艺废水通常发生的那些)都表现分解代谢活性。/^e/^/7朋^ADP在含有0.4mM阿特拉津作为唯一氮源和15mM合适碳源(柠檬酸盐琥珀酸盐)的矿物培养基中显示了持续生长。在这些条件下，即在氮限制(碳氮摩尔比C/恥45)下，Aey6to/^/2"ADP显示了最大分解代谢效率，反之在另外的氮源(硝酸铵、磷酸铵)存在下阿特拉津降解被高度抑制。考虑到大多数土壤没有氮限制；事实上取决于施肥模式它们或多或少富于有机和无机氮，并考虑到生产废水含有各种氮化合物，尸se;^加o加sA1)P作为生物增效剂以加速阿特拉津矿化过程以及被污染位置补救的使用不能频繁地提供预期结果。在美国专利US5429949中描述了以勘/i7朋/s^W/e/w/i"M91-3(GebendingerN和RadosevichM1999Appl.MicrobiolBiotechnol.51:375-381)为特征的革兰氏阴性菌M91-3的分离和分解代谢活性。与/^e/^/o/7MADP相似，M91-3在存在阿特拉津作为唯一氮源的情况下生长，并在最佳条件下(C/N>30)降解阿特拉津产生最终产物C02和NH/。在阿特拉津浓度为O.lmM(大约21.5mgr1)并添加了葡萄糖(2.2-5.5mM)作为碳源的液体培养基中进行了研究。此外，与使用Aey"朋朋"ADP的情况相似，由M91-3进行的阿特拉津矿化在有机或无机来源的添加氮源存在下被抑制。氮化合物对阿特拉津分解代谢路径调节的影响已经被许多研究所聚焦(Garcia-Go腦lezV，GovantesF，Perrua0和SanteroE2005J.Bacteriol.187:155-167),并且氮改善已经显示对由绝大多数已知的阿特拉津降解细菌进行的阿特拉津降解具有负面影响。因此，阿特拉津分解代谢的氮控制可将具有分解代谢活性的细菌完全限制为有效地被用于由于日常施肥富含有机或无机氮的农业土壤中阿特拉津降解。由于有关在环境中引入遗传修改的微生物的禁止，这种禁止在绝大多数国家都是强制的，使用具有被调控阿特拉津分解代谢即不考虑氮控制的细菌突变株作为用于富氮阿特拉津污染的土壤补救的生物增效剂的尝试也得到了有限的成功。关于具有分解代谢活性的单个或混合细菌培养物用于处理含有高浓度的这种除草剂的废水的商业应用都没有报道。总而言之，虽然已经认识到微生物，特别是细菌对于阿特拉津和其他s-三嗪化合物的转化来说是非常有效的生物试剂，但迄今为止提供的用于从自然环境(即用于污染位置补救)中除去这些化合物的微生物学方法在商业上都是不可靠的。因此，仍然存在对于发展微生物学方法的需要，在该方法中细菌的分解代谢潜能将被开发，在变化的常常非常特殊的环境条件下迅速并完全降解阿特拉津。图i.通过使用环标记的["c]-阿特拉津(-▲-)和乙基-链标记的-阿特拉津(-■-)的放射呼吸测量法测定的培养物AtzMix1的阿特拉津矿化活性。图2.在培养物AtzMix1在含有不同s-三嗪化合物的培养基中培养开始和7天之后的HPLC-DAD(213nm)色谱CA氰尿酸;DIA-0H羟基去异丙基阿特拉津；DDA去乙基去异丙基阿特拉津；DEA-OH羟基去乙基阿特拉津；DIA去异丙基阿特拉津；AT-0H羟基阿特拉津和DEA去乙基阿特拉津。图3.在不同温度下培养物AtzMix1(由600nm的光密度确定)的生长和以降解中间产物的定量分析(通过HPLC法)的阿特拉津降解。图4.在含有不同阿特拉津浓度(30mgr1-5000mgr1)作为唯一氮源和柠檬酸钠(1g匸)作为碳源的培养基中培养物AtzMix1生长过程中以降解中间产物的定量分析(通过HPLC法)的阿特拉津降解(图"C/N=3;图4BC/N=10.5;图4CC/N-2.5并且图4DC/N-l.8)。图5.在以阿特拉津(100mgI—1)作为唯一氮源(图5A)的培养基中培养过程中和在添加了不同氮化合钩(2.3mM):尿素(图5B);(NH4)2S04(图5C)和KN03(图5D)的同一培养基中培养物AtzMix1的生长和阿特拉津降解(通过HPLC法测定)。
发明内容本发明提供了被标记为AtzMix1的混合细菌培养物，所述AtzMix1来自天然环境(被s-三嗪化合物污染的土壤)并表现降解阿特拉津以及其他s-三嗪化合物的能力，诸如西玛津(6-氯-N，N，-二乙基-[1，3,5]三吖嗪-2，4-二胺),扑灭津(6-氯-N，N，-二异丙基-[1，3，5]三吖嗪-2,4-二胺)，terbutilazine(6-氯-N-叔丁基-N，-乙基-[l，3，5]三吖嗪-2,4-二胺)，去乙基阿特拉津(6-氯-N-异丙基-[l，3，5]三吖嗪-2，4-二胺)，去异丙基阿特拉津(6-氯-N-乙基-[1,3,5]三吖嗪-2，4-二胺)，羟基阿特拉津(6-羟基-N-乙基-N，异丙基-[l，3，5]三吖嗪-2，4-二胺),羟基去异丙基阿特拉津(6-羟基-N-乙基-[1,3，5]三吖嗪-2，4-二胺)，羟基去乙基阿特拉津(6:羟基-N-异丙基-[1，3,5]三吖嗪-2，4-二胺)，羟基去异丙基去乙基阿4;拉津(6-羟基-[1，3，5]三吖嗪-2，4-二胺)和氰尿酸(2，4，6-三羟基-1，3,5-三吖嗪)。本发明还提供了用于阿特拉津和其他s-三嗪化合物的微生物方法，其以培养物AtzMix1的特定分解代谢和其他特征为基础。到本发明之前，没有其他混合或者纯净的细菌培养物被报导在与那些在杀虫剂污染的土壤(碳限制、优先氮源的存在、低C/N比，低温、高阿特拉津浓度)中常常发生的情况类似的条件下迅速或者完全降解阿特拉津。培养物成分的互补分解代谢活性提供了阿特拉津的完全降解(矿化)，而分解代谢的普遍性和培养物成分之间的相互作用可有助于更好地使混合培养物AtzMix1适于改变环境条件和不利于分解代谢活性细菌生长和分解代谢活动的条件下分解代谢活性细菌的存活。培养物AtzMix1本发明的混合培养物已经存放在NationalCollectionofAgriculturalandIndustrialMicroorganisms,Budapest,Hungary,保藏号NCAIM(P)B0013292005-12-09。培养物AtzMix1已经通过在含有阿特拉津作为唯一碳源和氮源的矿物质培养基中连续培养而从暴露在被s-三嗪化合物长期污染的土壤中富积。阿特拉津矿物质培养基的成分和连续培养条件在例1中描述。培养物AtzMixl在不同条件下培养过程中(例如存在或不存在辅助碳源，在各种阿特拉津浓度和各种温度下)显示了持续生长和阿特拉津降解活性。在阿特拉津降解过程中的平板计数检查表明，混合培养物的结构基于条件而变化；但是存在最频繁的四个形态学上不同克隆类型。培养物AtzMix1的其他特征显示阿特拉津矿化是培养物成分的互补分解代谢活动的结果，其中一些成分将阿特拉津降解成氰尿酸(经鉴别属于Arthrobacter属)，一部分其他成分继续将氰尿酸降解产生C02和NH4+。培养物AtzMix1在l(TC到3(TC即在并不总是利于其生长的条件下的范围内表现出阿特拉津降解活性。最快的培养物生长和阿特拉津降解率被记录为在温度为3(TC的时候；但是，虽然生长率在更低温度下明显降低，诸如在自然环境下常常发生的那些情形，但培养物AtzMixl保持了其显著的专一性降解活性，即便在温度为l(TC时也是如此。证明温度对培养物AtzMix1的生长和分解代谢活性的影响的实验在例2中显示，而不同初始阿特拉津浓度下(不同碳氮比)的生长动力学和阿特拉津降解实验在例3中显示。动力学实验结果显示尽管在初始阿特拉津浓度为30mgr1和lOOmgr1(碳氮摩尔比C/N=31.1和C/N10.5)时培养物AtzMix1的生长率几乎相同，但在更高的阿特拉津浓度时阿特拉津降解率更高。此外，当阿特拉津的浓度增加到lOOOmg1(-1)和5000mg1(-1)而不增加碳源(C/N=2.5和C/N1.8)并承受高阿特拉津浓度(高达10g1(-1))时培养物AtzMix1显示了等同的降解能力(在每小时每克生物量1.4-1.8mM的范围内阿特拉津降解的最大专一性比例)。动力学实验结果还显示，阿特拉津降解不受其他氮源诸如尿素、硫酸铵或者硝酸钾存在的影响。取决于这些生长和分解代谢特定，可以预期本发明的混合培养物在阿特拉津和其他三嗪化合物降解方面将比迄今为止描述的阿特拉津降解细菌培养物更为有效，尤其是当存在优选氣源(例如含氮丰富的土壤)以及在非常大的污染位置(例如溢出位置)和含有高阿特拉津浓度的生长废水中时的阿特拉津污染环境中。还可设想培养物成分之间的专一性分解代谢、营养和其他合成相互作用可诱导混合培养物成分的变化。出于这种原因，本发明包括基本上具有培养物AtZMix1的相同分解代谢和其他鉴别特性的所有培养物变体。用于降解阿特拉津和其他s-三嗪化合物的方法
技术领域：
：本发明的微生物学方法提供用于三嗪化合物的降解，即用于加速被污染环境(土壤、地下水，地表水等)中这些化合物的生物转化。该方法还提供用于含有s-三嗪化合物农用化学和其他工艺废水的处理。取决于本发明的混合培养物AtzMix1的分解代谢活性，该方法提供用于在微量污染位置(100-200ppm)和非常高污染位置(1000-5000pPm)处的被污染环境中s-阿特拉津，优选阿特拉津的降解，后者最通常的情况下指的是溢出以及非正规地处理这些化合物的储存。取决于培养基和环境中污染物存在下的条件，本发明提供了培养物AtzMixl作为液体培养物或者作为固定在足够载体(例如颗粒状活性炭或者其他用于细菌附着的固相载体)上的培养物的用途。本发明的方法涉及在含有相应矿物盐(例如KH2P04，K2HP04,NaCl,MgS04，ZnS04，FeS04，MnSO"CuS04)维生素源和特定养分(例如酵母膏)、合适碳源(例如柠檬酸盐、葡萄糖、琥珀酸盐)和一些阿特拉津以提供大约30:1的C/N比的培养基中批量培养培养物AtzMix1。本发明的混合培养物的分解代谢活性以阿特拉津的特定降解率表示大约为2.5mM每小时每克干重生物量(mMg—'1—1)。为了实现本发朋的方法的最佳可能效果，即在污染位置最迅速和完全的s-三嗪化合物的降解(这些化合物的完全矿化)，推荐使用确保2.5mMg—i广阿特拉津降解率的培养物量。例1混合细菌培养物的培养和特性培养物AtzMix1从持续暴露在阿特拉津和其他s-三嗪化合物污染20年以上的农业工厂区域中收集的土壤中富积。培养物的富积在室温下在以含有阿特拉津作为唯一碳源和氮源的矿物盐培养基流入的连续流动单元中在2个月的培养过程中进行。连续流动单元的描述在HrsakQBosnjakM和JohanidesV1982J.A卯l.Bacteriology53:413-422中给出。阿特拉津培养基(AMS)包括下列矿物盐(gr1):K2HP041.6;KH2P040.4;MgS04x7H200.2;NaCl0.1;CaCl2x6H200.04，并加入阿特拉津(25mg-1),盐母液(20mlr。和维生素母液(10mlr1)。盐母液含有(g"):EDTA2.5;ZnS04x7H2011.1;FeS045.0;MnS04x7H201.54;CuS04x5H200.4;Co(N03)2x6H200.25以及^2840—10}{200.18，维生素母液含有(gl—1):硫胺HC15;生物素2;叶酸2;烟碱10和维生素B6HC110。过程简单描述如下将连续流动单元充满用PH7.0的磷酸缓冲)制备的土壤滤液(100g的土壤加入到1升磷酸缓冲液中混合20分钟，允许沉淀并通过粗滤纸过滤)，接着配制AMS培养基。在2个月的富积后，将单元的内含物离心(6000g，IO分钟)，将生物量重新悬浮在磷酸缓冲液中并以小等分试样(10ml)储存在零下2(TC的冰箱中。在富积2周后，流出物中阿特拉津的残留浓度通过高效液相色谱-HPLC监测。还通过将适量培养物稀释液涂布在含有阿特拉津(5GGml—1)和柠檬酸钠(lgi—1)的固体AMS培养基上来监测混合培养物的结构。所使用的HPLC方法和色谱条件在StipicevicS，FinglerS,Zupancic-KraljL和DrevenkarV2003J.S印.Sci.26:1237-1246中描述；这里仅仅i兑明使用系统VarianProStar系统和色谱柱为ODSHypersil,250mmx4.6mm(粒子尺寸5nm)进行分析，所述系统装备有具有一系列光学二极管(UV-腦)的VarianProStar330UV-检测器(Varian，WalnutCreek,CA,USA),所述色谱柱具有安全柱HypersilODS色谱(10mmx4mm，5jum),ThermoHypersi1-Keystone,Bellefonte,PA，USA。阿特拉津和其他s—三嗪化合物以及降解中间产物的鉴别根据可靠标准的保释时间和UV-波谱。来自确信阿特拉津完全消失的连续流动单元的培养物样品的HPLC分析以及在固体阿特拉津培养基(在3(TC下培养10天后)上生长的克隆分析确保在培养物中一些宏观形态上差异的克隆类型的存在；最通常存在4种克隆类型。在一些克隆的周围观察到透明带，这表明阿特拉津降解细菌的存在。混合培养物AtzMix1的其他特征通过使用聚合酶链反应(PCR)方法筛选负责阿特拉津降解的基因来进行分析。用于扩增的PCR程序在RousseauxS,HartmannA和SoulasG2001FEMSMicrob.Ecol.36:211-222中描述；这里仅仅给出简短描述使用蛋白酶K方案按照生产商的说明书(BoehringerMannheim,Germany)从在含有lgT阿特拉津(光密度006。。=0.4)的培养基中摇瓶培养中生长的培养物AtzMix1中分离总基因组DNA。分离的DM被用作使用具有对阿特拉津降解基因扩增专一的引物的PCR反应(反应体积为25jal)中的模板(2.5nl)。PCR产物然后通过1%的琼脂糖凝胶中进行电泳来分离，用溴化乙啶染色并在UV-光照射下使用数码相机(加能，日本)成像。培养物AtzMix1的分子特性显示编码用于将阿特拉津转化成氰尿酸的酶的分解代谢基因trzA、atzB和atzC以及编码用于打开s-三嗪的环的酶的基因trzD的存在。这些基因的检测还表明，阿特拉津分解代谢以去氯(羟基阿特拉津的形成)，接着是阿特拉津侧链的水解除去(氰尿酸的形成)，随后是s-三嗪环的裂解。该阿特拉津分解代谢途径得到大量进一步的实验支持，在这些实验中羟基阿特拉津和氰尿酸作为在各种条件下(见例2和3)培养物AtzMix1的批量培养过程中形成的主要代谢产物被检测。此外，使用环标记["C]阿特拉津(在RousseauxS，HartmannA和SoulasGFEMSMicrob.Ecol.200136:211-222中描述的方法)进行培养物AtzMix1的矿化实验结果证实了阿特拉津高度(78%)转化成终产物C。2和NH/(见图1)。为了检查培养物AtzMix1在其他s-三嗪化合物降解中的活性，使用在例2中描述的摇瓶培养方法(单个化合物的初始浓度大约为2mgl-1),并在3(TC的温度下进行实验。HPLC方法被用于定量测定单个s-三嗪化合物的初始和残留浓度。在图2中显示的色谱表明，在7天后，除氰尿酸以外所有被检s-三嗪化合物几乎都完全小室，测定氰尿酸的浓度大约为lmg厂1。应当注意对于所有s-三嗪化合物来说氰尿酸是核心降解中间产物。因此，所得到的结果表明培养物AtzMix1表现了完全降解所有被测s-三嗪化合物的能力。例2不同温度下培养物AtzMix1的分解代谢活性温度对培养物AtzMix1生长以及其分解代谢活性的影响在含有与例1中描述的相同矿物盐并添加了阿特拉津(lOOmgI—1)和柠檬酸钠(lg")作为碳源的培养基中培养过程中被监测。在温度分别为10°C、2(TC和30。C下在旋转摇床(200revmirT1)上在Erlemneyer烧瓶(500ml,200ml培养基)中进行实验。在实验过程中，培养物生长通过测定光密度(0D6。。)进行监测，通过使用由已知密度培养物的干重产生的标准曲线将得到的数据换算成生物量干重。在离心后(6000g,5分钟)通过HPLC方法测定培养物样品中的阿特拉津和形成的中间产物。基于动力学阐述，培养物AtzMixl的特定生长率(ju)和阿特拉津降解的特定生长率(Q)通过下列等式来计算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中Xt和X,是以小时(h)表示的开始时间(ti)和指定时间(t2)之后的生物量浓度(由干重(gr1)表示)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中Si和S2是分别为时刻ti和时刻t2的初始和残余阿特拉津浓度(由mM表示)。当与图3中显示的培养物AtzMix1的生长曲线进行比较时，可以发现在3(TC和2(TC时得到了类似的培养曲线，而随着温度下降到l(TC培养物的生长显著减缓。但是，虽然与更高温度相比更慢，在1(TC时产生了相同的最终生物量浓度，表明培养物AtzMix1具有适应更低温度的机制。此外，虽然图3中显示的阿特拉津小室曲线表明培养物AtzMixl在更高温度时更为有效，但培养物在l(TC时仍然显示了其专一性分解代谢活性(即通过相同的分解代谢途径进行阿特拉津降解)。动力学参数分析、最大阿特拉津降解专一性速率(表1)进一步证明培养物AtzMix1即便是在低温(例如l(TC)下也保持了显著的阿特拉津降解活性。所有前述结果表明，培养物AtzMixl可能拥有在不同和变化的温度条件下诱导阿特拉津分解代谢的机制，这最可能归功于培养物成分之间的相互作用，同时指示了这种培养物作为用于在阿特拉津污染的环境中加速生物转化过程的生物试剂的高潜能。表l.不同温度下培养物AtzMix1生长和阿特拉津降解动力学<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>ia目是在实验条件下培养物AtzMix1的最大专一性生长率Q,是在实验条件下的最大阿特拉津专一性降解率(niM阿特拉津每小时每克生物干重)例3不同阿特拉津浓度下培养物AtzMix1的生长和分解代谢活性在3(TC的温度下在摇瓶中使用添加了连续量的柠檬酸钠(lg—。和不同量的阿特拉津(初始阿特拉津浓度范围为30mgr到iogr)的AMS培养基进行培养物AtzMixl培养过程中进行了这些研究。其他实验条件与例中描述的相同。在实验过程中培养物样品的HPLC分析显示在阿特拉津的宽浓度范围(图4A到图4D)内培养物AtzMix1的完全阿特拉津降解活性。这尤其涉及阿特拉津降解的第一步(降解成氰尿酸)。此外，以最大专一性生长率和最大专一性阿特拉津降解率(表2)表示的动力学参数分析显示，在初始阿特拉津浓度为30mgr和100mgr(摩尔碳氮比C/N-31.1和C/N=10.4)时达到培养物AtzMixl的最快生长速率，而阿特拉津浓度进一步增加但不增加碳源(柠檬酸钠)培养物生长率逐渐降低。相反，专一性阿特拉津降解率随着阿特拉津浓度增加到1000mgr(C/N=2.5)而增加，完全培养物降解能力也表示为5000mgr1(C/N=1.8)。表2中列出的动力学参数还表明，培养物AtzMix1显示了极大的阿特拉津降解活性，即几乎是专一性阿特拉津降解率的三分之一，即便在10g"的浓度下也是如此表2.培养物AtzMix1生长和不同厨师阿特拉津浓度下阿特拉津降解动力学阿特拉津C/NK平均M"maxmgrmg1墨V1h-13031.11.2±0.20.26±0.050.6±0.510010.416.6±1.50.25±0.041.5±0.0510002.539.8±2.50.14±0.031.8±0.0450001.871.4±3.80.10±0.031.4±0.05100001.759.5±5.50.03±0.020.5±0.02K，是在实验条件下平均阿特拉津降解率H,是实验条件下培养物AtzMix1的最大专一性生长率Q,是实验条件下最大阿特拉津专一性降解率(mM阿特拉津每小时每克生物干重)例4在其他氮源存在下培养物AtzMix1的生长和分解代谢活性为了评估其他氮源对培养物AtzMix1的分解代谢活性的影响，使用添加了阿特拉津作为唯一氮源(lOOmgI—1)的AMS培养基和添加了以与阿特拉津等摩尔量的氮(2.3mM)其他氮化合物(尿素，(NH4)2，KN03)的AMS培养基进行了比较摇瓶实验。其他实验条件与例3中描述的相同。图5中显示的培养物生长曲线和阿特拉津小时曲线表明，在加入尿素作为辅助氮源(图5B)时培养物AtzMix1显示了最大生长，在所有被测氮源存在时(图5B到5D)阿特拉津的降解率都比当将阿特拉津作为唯一氮源时的情况下高(图5A)。这进一步表明培养物AtzMix1可能具有克服添加的有机或无机氮化合物对阿特拉津分解作用的抑制影响的机制，而这种抑制影响在迄今为止研究的大多数阿特拉津降解细菌中都存在。因此，可以预期培养物AtzMix1将证明在当一些容易得到的氮源存在时的条件下的分解代谢活性，而这通常是杀虫剂污染的土壤和生产废水中的情形。权利要求1、一种来自天然环境的混合细菌培养物，具有降解阿特拉津和其他s-三嗪化合物的遗传潜能和活性，并具有培养物AtzMix1的其他鉴别特性，被存放在NationalCollectionofAgriculturalandIndustrialMicroorganisms，Budapest，Hungary，保藏号NCAIM(P)B0013292005-12-09。2、根据权利要求l所述的混合细菌培养物，其中阿特拉津降解遗传潜能由起阿特拉津降解作用的基因trzA、atzB、atzC以及trzD组成。3、根据权利要求l所述的混合细菌培养物，其中阿特拉津降解活性产生二氧化碳和铵离子作为阿特拉津降解的最终产物。4、根据权利要求l所述的混合细菌培养物，其中阿特拉津矿化是培养副成分的互补分解代谢活性的结果；至少一个成员将阿特拉津降解成氰尿酸，至少一个成员继续将氰尿酸降解成二氧化碳和铵离子。5、根据权利要求l所述的混合细菌培养物，其中完全阿特拉津降解活性在从1(TC到30。C的温度范围内在很宽的阿特拉津浓度范围内(几个ppb到数千ppm)显示。6、根据权利要求1所述的混合细菌培养物，其中显示了高达10g"的高阿特拉津浓度的耐受性。7、一种利用培养物AtzMix1NCAIM(P)B0013292005-12-09进行阿特拉津和其他s-三嗪化合物降解的微生物方法。8、根据权利要求7所述的微生物方法，包括在保证培养物AtzMixl的阿特拉津降解能力和其他鉴别特性的条件下混合培养物的批量培养。9、根据权利要求8所述的微生物方法，其中培养物的培养直接在被污染位置进行。10、根据权利要求8所述的微生物方法，其中培养物作为最初在使保证其具有完全降解阿特拉津效率的条件下生长的液体培养物被施加。11、根据权利要求8所述的微生物方法，其中培养物作为固定培养物即与足够载体连接的小室被施加。12、根据权利要求l-ll中任何一个所述的混合培养物AtzMixl作为生物试剂的用途，其中提供了用于阿特拉津污染环境(土壤、地下水和地表水)补救的方法以及用于含有阿特拉津和其他三嗪化合物的固体废物和废水处理的方法。全文摘要本发明提供了被标记为AtzMix1的混合细菌培养物，其来自被暴露于阿特拉津和s-三嗪化合物长期污染的土壤。培养物AtzMix1在各种温度下(10℃到30℃)在广泛的阿特拉津浓度单位内(几个ppb到数千ppm)降解阿特拉津，而不形成有毒代谢产物并导致阿特拉津完全降解(矿化)。AtzMix1是稳定的混合培养物，包括至少四种不同形态学、生理学和分解代谢特性的成分。培养物AtzMix1的分子特性显示编码用于将阿特拉津转化成氰尿酸的酶的分解代谢基因trzA、atzB和atzC以及编码用于随后打开s-三嗪的环的酶基因trzD的存在，而环标记[<sup>14</sup>C]阿特拉津的高度矿化(80％)证实，继续进行降解产生CO<sub>2</sub>和NH<sub>4</sub><sup>+</sup>。作为本发明的一部分的降解阿特拉津和其他s-三嗪环化合物的微生物学方法优于迄今为止所描述的使用单个细菌培养物的方法。这基本上是由于被用作生物试剂的混合培养物AtzMix1的专一性生长和分解代谢特性，即由于在与在阿特拉津污染环境(例如变化的温度、低C/N比、优选氮源的存在、高阿特拉津浓度)中类似的那些条件下其表现持续生长和阿特拉津降解效力的能力。此外，应当强调的是，迄今为止观察到的大多数所描述的单个菌株在容易获得的氮源存在下阿特拉津降解的抑制对于培养物AtzMix1而言没有记录。因此，可以预期本发明的微生物学方法可适用于阿特拉津污染土壤的补救，即便是在氮丰富的区域也是如此，而且可用于加速含有高浓度s-三嗪化合物的废水中阿特拉津的矿化过程。文档编号C12N1/00GK101395262SQ200780008048公开日2009年3月25日申请日期2007年1月22日优先权日2006年2月20日发明者梅加·哈瑞鲁克,达布瑞卡·赫萨克申请人:鲁杰尔博斯科维茨学院