专利名称：：制备茶黄素增多的茶产品的方法
技术领域：
：本发明涉及茶叶加工领域。尤其涉及制备茶黄素增多的茶产品的方法。
背景技术：
：在整个说明书中对现有技术的任何讨论都不应视为承认这些现有技术广泛公知或者构成本领域公知常识的一部分。茶黄素是以存在苯并环庚三烯酚酮环为特征的化合物，在茶叶被酶氧化或者发酵生产红茶时形成。茶黄素是红茶和乌龙茶特有的，茶黄素(TF1)、茶黄素-3-单没食子酸酯(TF2)、茶黄素-3'-单没食子酸酯(TF3)和茶黄素-3-3'-双没食子酸酯(TF4)是存在的四种主要物质。在茶叶中，表儿茶素(EC)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)是筒单的儿茶素，而表掊儿茶素(EGC)和表掊儿茶素没食子酸酯(EGCG)是参与四种茶黄素物质形成的掊儿茶素。儿茶素的氧化生物转化，象其它生物转化一样，是复杂的，并且包括多个反应途径，产生二聚体茶黄素和被称为茶玉红精(thearubigin)的更高分子量的化合物。已知茶黄素具有抗氧化、抗微生物和抗炎症性质。已报道茶黄素对包括癌症、心血管和脑血管疾病、糖尿病和高胆固醇血症在内的各种疾病是有效的。但是，茶中茶黄素的正常水平为基于干重1-2%，取决于诸如茶的地理位置和茶的品种等因素。因此希望获得茶黄素水平提高的茶产品。过去，研究人员已经尝试通过各种方法增加茶产品中的茶黄素。Cloughley和Ellis(7.如c.31(1980)924-934)描述了一种通过在低pH下进行发酵步骤而增加茶的茶黄素的方法。但是，通过这种方法获得的茶可能具有残余的酸性，可导致在制备含奶茶饮料时添加的牛奶凝结。US6113965(2000,Lipton)公开了一种通过在浆液氧化发酵之前用单宁酶处理绿叶茶并从其浆液氧化发酵产物中分离茶黄素而生产茶黄素的方法。还教导了制备富含茶黄素的提取物的方法，提供了冷水可溶性的茶粉和产品。但是，通过上述方法可获得的茶黄素的增加是有限的，并且仍然需要茶黄素水平进一步提高的茶产品。另外，已发现现有技术中报道的方法是昂贵的，因此进一步需要节约成本的制备茶黄素增多的茶产品的方法。本发明的一个目的是克服或改善现有技术的至少一个缺点，或者提供有用的替代方案。本发明的一个目的是提供一种与现有技术方法相比制备含有更高总茶黄素水平的茶黄素增多的茶产品的方法。本发明的另一个目的是提供一种以成本节约的方式制备茶黄素增多的茶产品的方法。本发明人惊讶地发现，在茶源的酶发酵过程中存在外源性表儿茶素可产生茶黄素增多的茶产品。
发明内容根据本发明，提供了一种制备茶黄素增多的茶产品的方法，包括在存在添加的外源性表儿茶素的情况下使茶源进行酶发酵的步骤。优选地，本发明的酶发酵是利用茶源中的内源性酶进行的。根据本发明的一个优选方案，所述表儿茶素的量为35-750，更优选75-520,最优选120-260mg/g所述茶源中可溶性固体千重。根据一个优选方案，表儿茶素在茶源发酵之前加入。茶源优选地在发酵前或发酵过程中用单宁酶处理。根据一个优选方案，发酵在存在添加的水的情况下进行。添加的水的量优选地为0.1-500克/克茶源中可溶性固体。定义此处使用的术语"茶源"是指从中国茶(Came〃/"W"e"^;y)或阿萨姆茶(C"me肌aa^a附/c")才直物获4寻的"f壬"f可才才冲+或在力口工这种才直物材料后产生的任何材料。此处使用的术语"茶产品"是指由茶源产生的任何产品。包括但不限于红茶、乌龙茶、速溶茶和绿茶。还包括含有茶产品与水的混合物的浆液。此处使用的术语"茶黄素增多的"是指包括TF1、TF2、TF3和TF4的总茶黄素水平比茶源提高的茶产品。特别是，与茶源中每克可溶性固体干重的茶黄素含量相比，茶产品中每克可溶性固体干重通常具有较高含量的茶黄素。此处使用的术语"茶叶"包括中国茶(Came〃/aW"eww、)或阿萨姆茶(C"we肌fla^"w/ca)植物的茶叶、芽和其它部分。此处使用的术语"茶坯(dhool)"是指解析(macerated)后的茶叶。茶叶可以通过常用的方法解析，如揉捻(Rolling)、碾碎-撕裂-巻起(CTC)、使用搅拌机混合等。此处使用的术语酶发酵是指由酶介导的氧化生物转化。发酵可以利用茶源中能够进行酶发酵的内源性酶进行。这种茶源的非限制性例子包括茶叶和茶坯。发酵也可以利用外源性酶和相应的辅底物(co-substrate)进行。术语"基本被灭活的内源性酶"是指经历灭活茶源中内源存在的酶的步骤的茶源。灭活一般是热灭活，即，经历暴露于高于100°C的温度的步骤，也被称为烘焙(firing)。内源性酶基本被灭活的茶源的例子包括速溶茶和绿茶。此处使用的术语"茶源中可溶性固体"是指通过以下步骤获得的一定量的固体(a)茶源与水在90。C接触1小时，(b)通过离心/过滤(Whatman541滤纸)将液体与不溶性固体分离，和(c)从液体中蒸发掉水，获得可溶性固体。此处使用的术语"基于干重"是指基于不含水分表示的组分的比6例或重量％。此处使用的术语"基于鲜重"是指表示为包含水分的材料的。/。wt的组成。茶叶一般含有大约70%的水分和大约30%的固体。在总固体中，可溶性固体通常占大约40%重量(基于干重)。因此基于鲜重的~12%的可溶性固体相当于基于干重的40%的可溶性固体。应当指出，以上给出的典型数字是代表性的，实际数字根据茶的地理来源、种类和湿度可能略有不同。此处使用的术语"浆液发酵"是指茶源的发酵，其中添加的水与茶源的比例基于鲜重大于2:1,或者基于干重大于6.7:1，基于可溶性固体大于17:1。此处使用的术语"固态发酵，，是指茶源的酶发酵，其中添加的水与茶源的比例基于鲜重低于2:1，或者基于干重低于6.7:1,基于可溶性固体低于17:1。基于可溶性固体，添加的水与茶源的比例一般低于2:1。此处使用的术语"外源性表儿茶素，，是指从外部添加到茶源中的表儿茶素，并且不包括任何可能存在于茶源中的表儿茶素。酶活性表示为活性单位或者简单地表示为单位。单宁酶活性单位引自供应商的数据。对于外源性酶，如多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD),酶活性可以如下确定。多酚氣化酶(PPO)的测定利用(+)-儿茶素作为底物以分光光度法测定PPO。进行该测定，反应体积为3mL,在0.1M磷酸盐柠檬酸盐緩冲液pH5.5中含有3mM儿茶素。利用150iuL等份新鲜制备的60mM儿茶素在水(70Q/Qv/v)-乙醇(30%v/v)混合物中的储备溶液在反应混合物中获得3mM的儿茶素浓度。加入适当稀释的酶溶液以启动反应，混合物在40。C孵育10-20min。利用200|uL由乙腈(60%v/v)、乙酸(10%v/v)和水(300/。v/v)组成的溶液终止反应。然后记录在400nm的吸光度，并基于以下关系计算活性1单位活性=0.001的吸光度增加。过氧化物酶(POD)的测定POD的测定与PPO的测定基本相同，不同之处是反应混合物还含有7.3mM过氧化氢。使用1.5%w/v储备溶液提供所需量的过氧化氢。反应混合物在30。C孵育10-20min。然后如上所述终止反应，并测量400nm处的吸光度。再次基于以下关系计算活性1单位活性=0.001的吸光度增加。发明详述根据本发明，提供了一种制备茶黄素增多的茶产品的方法，包括使茶源在存在添加的外源性表儿茶素的情况下进行酶发酵的步骤。优选地，本发明的酶发酵利用茶源中能够进行发酵的内源性酶进行。可以添加可商购的外源性表儿茶素(例如，来自Sigma，Herbs-Tech等)。#4居本发明可以添加的外源性表儿茶素的其它来源包括其它植物材料的富含表儿茶素的提取物，如可可粉、葡萄汁等。本发明的方法可以在其它与外源性表儿茶素一起添加的外源性儿茶素(包括表儿茶素没食子酸酯、表掊儿茶素和表掊儿茶素没食子酸酯)的存在下进行。优选地，外源性表儿茶素与总外源性儿茶素的比例大于茶源中内源性表儿茶素与总内源性儿茶素的比例。选择添加的外源性表儿茶素的优选量，使得总表掊儿茶素与总表儿茶素的摩尔比为1:1至1:16，优选1:1.5至1:10,更优选1:2至1:9。根据本发明的一个优选方案，添加的表儿茶素的量为35-750，优选75-520，更优选120-260mg/克茶源中可溶性固体干重。根据一个优选方案，当茶源是茶叶时，在采摘后向茶叶中添加表儿茶素。根据一个替代的优选方案，在采摘前向茶叶中添加表儿茶素。优选地，茶源基本上是未发酵的，即，以前没有经历酶发酵步骤。特别地，优选地所述茶源中总儿茶素与茶黄素的重量比大于10,优选地大于20，更优选地为50-10000。可替代地或者另外，茶源优选地含有不超过10mg，更优选不超过5mg，最优选不超过2mg茶黄素/g可溶性固体干重。特别优选地，茶源基本上不含茶黄素。本发明的方法优选地包括在所述发酵之前或过程中用单宁酶处理茶源的步骤。根据一个优选方案，用单宁酶处理茶源的步骤在发酵之前进行。单宁酶处理优选地在氮气氛中(以防止发酵)在适当温度下进行适当的时间。适当的条件可以通过实验确定。根据一个替代优选方案，用单宁酶处理茶源的步骤在发酵过程中进行。优选地单宁酶的量为0.08-8,更优选0.2-4，最优选0.4-2mg/g茶源中可溶性固体干重。根据一个优选方案，发酵在存在添加的水的情况下进行。添加的水的量优选地为0.1-500克/克茶源中可溶性固体。在一个优选方案中，添加的水的量为0.1-17,更优选0.1-10,最优选0.1-2克/克茶源中可溶性固体，导致固态发酵。根据一个替代优选方案，添加的水的量为17-500,更优选20-400,最优选25-200克/克茶源中可溶性固体，导致浆液发酵。根据一个优选方案，茶源是包含能够进行酶发酵的内源性酶的茶叶，并且所述方法包括以下步骤(a)使茶叶萎凋；(b)解析萎凋的茶叶；(c)使解析的茶叶在存在添加的外源性表儿茶素的情况下进行酶发酵；和(d)烘焙，优选地达到大约120。C的温度，以获得茶黄素增多的红茶。以上列出的方法优选地包括在步骤(c)即酶发酵之前或过程中用单宁酶处理茶源的步骤。根据另一个优选方案，茶源是包含能够进行酶发酵的内源性酶的茶叶，并且所述方法包括以下步骤(a)使所述茶叶萎凋；(b)解析萎凋的茶叶并且向解析的茶叶中添加17-500克水/克可9溶性固体，以制备浆液；(C)使浆液在存在添加的外源性表儿茶素的情况下进行酶发酵，以获得茶黄素增多的浆液。以上列出的方法优选地包括在步骤(c)即酶发酵之前或过程中用单宁酶处理茶源的步骤。茶黄素增多的浆液可以优选地被干燥，以使含水量降至低于5%，以获得茶黄素增多的红茶。在另一个优选方案中，将不溶性固体从茶黄素增多的浆液中分离，以获得富含茶黄素的溶液。富含茶黄素的溶液可以优选地被干燥，以得到茶黄素增多的茶产品，该产品例如可以添加到红茶、绿茶、乌龙茶或速溶茶中。根据一个替代的优选方案，可以将富含茶黄素的溶液涂覆至红茶、绿茶或乌龙茶上，并且干燥，获得茶黄素增多的茶。根据另一优选方案，酶发酵是利用外源性酶和辅底物进行的。当茶源具有基本上被灭活的内源性酶时，利用外源性酶和辅底物的发酵是优选的。内源性酶基本上被灭活的茶源的例子是绿茶或速溶绿茶。当茶源具有基本上被灭活的内源性酶时，浆液发酵是优选的。选择外源性酶和相应辅底物的适当的组合，使得该组合能够发酵茶源。根据一个优选方案，外源性酶是多酚氧化酶，相应的辅底物是氧。根据一个进一步优选的方案，所述多酚氧化酶的量是1.5xl0"至1.5x107,更优选3.5xl()4至1.5x106，最优选7.5x104至7.5x105单位/克所述茶源中可溶性固体干重。多酚氧化酶可以商购获得，例如，从Worthington获得，或者可以从合适的植物材料中提取和纯化。根据另一优选方案，外源性酶是过氧化物酶，辅底物是过氧化氢。过氧化物酶可以从诸如Sigma的商业来源获得，或者可以从合适的植物材料中提取和纯化。根据一个进一步优选的方案，所述过氧化物酶的量为1.5xl()4至1.5x107，更优选3.5xl()4至1.5x106,最优选7.5xl(^至7.5xl()S单位/克所述茶源中可溶性固体干重。优选地，所述过氧化氢的量为7-700mg，更优选15-300mg，最优选35-100mg/g所述茶源中可溶性固体千重。根据一个优选方案，茶源是绿茶或速溶绿茶，并且所述方法包括以下步骤(a)向茶源中添加17-500克水/克可溶性固体，以制备浆液；(b)通过添加外源性酶和辅底物，使浆液在存在添加的外源性表儿茶素的情况下进行酶发酵，以获得茶黄素增多的浆液。以上列出的方法优选地包括在步骤(b)即酶发酵之前或过程中用单宁酶处理茶源的步骤。茶黄素增多的浆液可以优选地被干燥，以使含水量降至低于5%(重量)，以获得茶黄素增多的红茶。在另一优选方案中，将不溶性固体从茶黄素增多的浆液中分离，以获得富含茶黄素的溶液。富含茶黄素的溶液可以优选地被干燥，以得到茶黄素增多的茶产品，该产品例如可以添加到红茶、绿茶、乌龙茶或速溶茶中。根据一个替代优选方案，可以将富含茶黄素的溶液涂覆至红茶上并干燥，以获得茶黄素增多的红茶。根据另一优选方案，将通过以上方法获得的茶黄素增多的浆液涂覆在红茶上，以获得茶黄素增多的红茶。根据另一优选方案，将茶黄素增多的浆液涂覆在速溶茶上以获得茶黄素增多的速溶茶。实施例现在参考具体实施例描述本发明。下面的实施例只是为了说明而提供的，并非限制本发明的范围。材料与方法表1给出了实施例中使用的材料的列表。表1:使用的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>茶黄素分析方法总茶黄素水平利用含水甲醇提取物测定。来自固态发酵的样品利用70。/。曱醇提取在80。C下提取10分钟，含水曱醇溶液与茶坯的高比例基于鲜重为16.7:1。提取物的样品用含90%v/v水、10%v/v乙腈、0.5g/L抗坏血酸和0.5g/L乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液1:1稀释，以防止茶黄素和儿茶素的氧化。对于浆液发酵系统，通过将所需量的100%甲醇添加到含水浆液中以获得70%甲醇和30%水的组成来准备该提取物。添加的甲醇量为所含水的体积的2.33倍，因此该提取在含水曱醇溶液与茶坯的比例基于鲜重为16.7:1或者基于干重为55.7:1下进行。在70%甲醇与茶坯的这种高比例下，于80。C和10min的提取时间下获得茶黄素的定量提取。将样品贮存于-80。C,用具有二极管阵列检测的高效液相色谱法(HPLC)分析茶黄素。茶黄素利用十八烷基硅石(octadecylsilica)(C18)柱(Nova-pak，来自Waters,3.9mmi.d.xl50mm)通过HPLC(Shimadzu)分析，于380nm检测，柱温为40°C,注射体积为20)uiL，流速为1mL/min。茶黄素分析的流动相为2%(v/v)乙酸水溶液(流动相A)和乙腈(流动相B)。利用50min内从8%B到69%B的梯度分离茶黄素，之后用8%緩冲液A平衡柱子5min。可商购的高纯度茶黄素用作定量标准。固态发酵固态发酵通过将5g茶坯涂布在暴露于大气的平面上在室温下(25。C)进行。发酵时间为90-120min。当固态发酵用单宁酶进行时，单宁酶的剂量为1.67mg/g茶源中可溶性固体。以1.7:1的比例(基于可溶性固体)向茶坯中添加含有所需量的表儿茶素或表儿茶素和单宁酶的水。表2中列出了各个实施例在固态发酵中添加的表儿茶素和单宁酶的量。表2:固态发酵实施例<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例1-7是本发明的方法的实施例，而比4交例A、Bl和B2属于本发明的范围之外。浆液发酵浆液发酵在30°C下使用定轨振荡器以190-200rpm在摇瓶中进行。发酵实验使用5g(鲜重)茶坯，水与可溶性固体的比例为41.7:1(或5:1，基于鲜重)。在发酵之前向浆液中添加需要量的表儿茶素。发酵时间为90min。当用添加的单宁酶(活性为50,000单宁酶活性单位/克，来自Kikkoman)进行浆液发酵时，单宁酶的剂量为0.83mg/g可溶性固体，使用lg/L的储备溶液。表3中列出了各个实施例在浆液发酵中添加的表儿茶素和单宁酶的量。表3:浆液发酵实施例<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例8-15是本发明的方法的实施例，而比较例C、Dl和D2属于本发明的范围之外。结果分析了所有实施例的茶产品的总茶黄素，固态发酵的结果显示于表4中，浆液发酵的结果显示于表5中。表4:固态发酵中的总茶黄素实施例茶产品中的总茶黄素(基于干重的重量％)比專交例A1.311.822.431.9比较例Bl1.9比较例B23.144.354.064.975.2从以上可以清楚地看出，通过包括在外源性表儿茶素存在下进行酶发酵的步骤的方法制备的实施例1-4的茶产品比比较例A的茶产品具有水平提高的茶黄素。类似地，通过包括在外源性表儿茶素和单宁酶存在下进行酶发酵的步骤的方法制备的实施例5-8的茶产品比比较例Bl和B2的茶产品具有水平提高的茶黄素。表5:浆液发酵中的总茶黄素实施例茶产品中的总茶黄素(基于干重的重量％)比较例c1.982.092.6103.1112.9比4交例Dl1.9比4交例D23.7125.1136.4146.0156.4从以上可以清楚地看出，通过包括在外源性表儿茶素和外部添加的水存在下进行酶发酵的步骤的方法制备的实施例8-11的茶产品比比较例C的茶产品具有水平提高的茶黄素。类似地，通过包括在外源性表儿茶素、单宁酶和外部添加的水存在下进行酶发酵的步骤的方法制备的实施例12-15的茶产品比比较例Dl和D2的茶产品具有水平提高的茶黄素。从以上所有实施例也可以清楚地看出，茶黄素水平随表儿茶素水平的提高(可达约300mg/g表儿茶素，基于茶坯千重)而提高。随着表儿茶素水平进一步提高到大约500mg/g茶坯干重，趋势表明茶黄素水平稳定或降低。因此想像以超过750mg/g茶坯干重的水平加入表儿茶素不可能导致茶黄素进一步提高或者在经济上是不可行的。因此，根据本发明，已经能够通过在外源性表儿茶素的存在下、在存在或不存在单宁酶的情况下进行酶发酵，使用固态发酵及浆液发酵制备茶黄素增多的茶产品。1权利要求1.一种制备茶黄素增多的茶产品的方法，包括使茶源在存在添加的外源性表儿茶素的情况下进行酶发酵的步骤。2.如权利要求l所述的方法，其中所述表儿茶素的量为35-750mg/克所述茶源中可溶性固体干重。3.如权利要求1或2所述的方法，包括在所述发酵之前或发酵过程中用单宁酶处理茶源的步骤。4.如权利要求3所述的方法，其中所述单宁酶的量为0.08-8mg/g所述可溶性固体干重。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵在存在添加的水的情况下进行。6.如权利要求5所述的方法，其中所述水的量为0.1-500克/克所述茶源中可溶性固体干重。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述茶源是包含能够进行所述酶发酵的内源性酶的茶叶，并且所述方法包括以下步骤(a)使所述茶叶萎凋；(b)解析萎凋的茶叶；(c)使解析的茶叶在存在添加的外源性表儿茶素的情况下进行酶发酵；和(d)烘焙，以获得茶黄素增多的红茶。8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述茶源是包含能够进行酶发酵的内源性酶的茶叶，并且所述方法包括以下步骤(a)使所述茶叶萎凋；(b)解析萎凋的茶叶并且向解析的茶叶中添加17-5OO克水/克可溶性固体，以制备浆液；(c)使浆液在存在添加的外源性表儿茶素的情况下进行酶发酵，以获得茶黄素增多的浆液。9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵通过添加外源性酶和辅底物进行。10.如权利要求9所述的方法，其中所述茶源含有基本上被灭活的内源性酶。11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述外源性酶是多酚氧化酶，所述辅底物是氧。12.如权利要求9或10所述的方法，其中所述外源性酶是过氧化物酶，所述辅底物是过氧化氢。13.如权利要求9-12中任一项所述的方法，其中所述茶源是绿茶或速溶茶，所述方法包括以下步骤(a)向茶源中添加17-500克水/克可溶性固体，以制备浆液；(b)通过添加外源性酶和辅底物，^f吏浆液在存在添加的外源性表儿茶素的情况下进行酶发酵，以获得茶黄素增多的浆液。14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述茶源中总儿茶素与茶黄素的重量比大于io。15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述茶源含有不超过10mg的茶黄素/g可溶性固体干重。全文摘要提供了一种制备茶黄素增多的茶产品的方法，包括使茶源在存在添加的外源性表儿茶素的情况下进行酶发酵的步骤。文档编号A23F3/06GK101553125SQ200780044068公开日2009年10月7日申请日期2007年11月15日优先权日2006年12月1日发明者A·玛尔利克,S·M·普特里宇乌申请人:荷兰联合利华有限公司