抗柑橘溃疡病pthA-nls基因及其构建方法与应用的制作方法

专利名称：抗柑橘溃疡病pthA-nls基因及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗柑橘溃疡病基因及其构建方法，尤其是涉及一种利用柑橘溃疡病的致 病基因/^力/J构建的抗柑橘溃疡病基因及其构建方法。
背景技术：
柑橘溃疡病(citrus bacterial canker disease)是由地毯黄单孢杆菌柑橘致病变种 (A/3f力o/B朋as afo; opocVs pv. cArJ')引起的一种细菌性病害。对柑橘苗木、产量及果品 品质影响极大，严重危害着柑橘产业的健康发展。到目前为止，还没有能根除柑橘溃疡病菌 的特效方法，柑橘品种资源中亦未发现完全抗病的品种，柑橘抗溃疡病育种多年，没有取得 实质性进展。发明内容本发明的目的在于提供一种抗柑橘溃疡病基因及其构建方法。 本发明的目的是通过以下技术方案实现的。研究表明，病原基因ptA4是柑橘溃疡病亚洲型(A型)致病所必需的因子，；7tW表现出 致病性和无毒性双重功能，即在非寄主上引起超敏反应，在寄主上引起溃疡状症状。本发明者利用柑橘溃疡病的致病基因介导广谱抗性原理，构建了抗柑橘溃疡病的新 基因户t)M-"Zs,所述抗柑橘溃疡病基因pt/^-7 "具有本说明书第5-10页记载的序列表所示 的序列。其构建方法包括以下步骤(1)引物设计，根据基因银行登记序列号为U28802的/^力力基因序列设计溃疡病核定位信号的特异性引物引物名称 序列 引入酶切位点pl 5' 一gactctagagttgcccagttatctcgccctga- J6a I3,p2 5' —gaggatccgttgcccagttatctcgccctga-3 feffl^Ip3 5' —gcctcgagcaaccatgcgagctxctcttcgttg 5ac Ia-3'p4 5' -cccggggcctcgagcaaccatgcgagctcctct 5"咖Itcgt-3'引物可从上海生工生物工程技术公司购得；(2) NLS序列的克隆，以P1/P3、 Pl/P4、 P2/P3 或P2/P4为引物，以从湖南省柑橘溃疡病疫区分离的柑橘溃疡病菌为模板，利用公知的PCR方 法扩增出NLS序列，PCR反应条件为94 。C 4 min; 94 。C 30 sec、 58 'C 30 sec、 72 。C 1.5上游引物 下游引物8min， 35个循环，最后72'C延伸IO min; PCR试剂购自MBI公司；(3) PCR产物回收及酶切，PCR 产物用1% 1.5%琼脂糖凝胶电泳后用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝胶回收试剂盒(可 从Qiagen公司购得)回收纯化，操作方法同说明书，纯化产物用15 25 U l无菌水溶解；回 收片段用J力a I和&c I双酶切，其中引物P1 /P4扩增产物采用7力a I和S/ffl3 I双酶切；引物P2 /P3扩增产物采用^a/^l和5"acl双酶切；引物P2 /P4扩增产物采用^w^1和5"ac I双酶切； 酶切反应体系为20 ul:纯化产物15ul、两种酶各1.5 ul、 lOXBuffer 2 ul (Buffer为 MBI公司配套提供)；酶切条件为37 'C 5 10 h;酶切产物用1% 1.5%琼脂糖凝胶电泳后用 Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝胶回收试剂盒(可从Qiagen公司购得)回收纯化，操作 方法同试剂盒说明书；内切酶feffl/yi、 5"acl、 5i昭I、 J力aI购自MBI公司；(4)植物表达载 体双酶切，将pBI121 (基因银行登记序列号AF485783;可从北京博大泰克生物基因技术有 限公司购得，全序列见http:〃丽，ncbi. nlm. nih. gov/,质粒图谱见图l)质粒用J6a I和&c I 双酶切(如连接扩增P1 /P4产物则用J》al和5feal ;连接P2/P3扩增产物用泡朋yi和i"acl ; 连接P2/P4扩增产物用5MI和6"ac I );酶切反应体系和条件同步骤(3);酶切产物用1% 1.5%琼脂糖凝胶电泳后用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝胶回收试剂盒(可从Qiagen 公司购得)回收纯化，操作方法同试剂盒说明书；(5)连接，将pBI121酶切产物用T4 DNA 连接酶(购自MBI公司)与相应的NLS序列的PCR酶切产物连接，连接反应体系为10 P 1: pBI121 酶切产物4 ul、 NLS序列PCR酶切产物4 yl、 T4 DNA连接酶1 y 1、 10XBuffer (MBI公司配 套提供)1 yl; 16 'C反应15 20 h; (6)克隆，将连接产物转化大肠杆菌DH5 a ,克隆操作 方法见《分子克隆实验指南》(金冬雁等译，科学出版社，1996)。获得的阳性克隆基因即 为本发明的新基因，命名为;^力力-/7^,其碱基对序列见本说明书第5-10页记载的序列表， "h质粒图谱见图2。本发明将病原基因的NLS序列克隆到植物表达载体的/6al和5"acl位点(或 fe/必I /5ac I或/5^c I位点)，构建了新基因/^力/l-"^。新基因""可进一步对 柑橘的感病品种进行遗传转化，通过对转基因植株的筛选，可以获得抗柑橘溃疡病的新种质。本发明为柑橘抗溃疡病育种提供了有效工具。


图1为植物表达载体pBI121质粒图谱； 图2为pthA-nls质粒图谱。
具体实施方式
下面结合优选实施例对本发明作进一步描述。实施例1(1)以从湖南省衡阳市南岳区柑橘潢疡病疫区分离的柑橘溃疡病菌为模板，以P1/P3为 模板，利用PCR方法扩增出NLS序列，PCR反应条件为94 'C 4 min; 94 'C 30 sec， 58 °C 30 sec, 72 。C 1.5 min， 35个循环，最后72 'C延伸IO min; (2) PCR产物用1W 1. 5%琼脂糖凝 胶电泳后用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝胶回收试剂盒(购自Qiagen公司)回收纯 化，纯化产物用15 25 nl无菌水溶解；回收片段用J力al和5"acI双酶切酶切反应体系为 20 nl:纯化产物15 lU、两种酶各1.5 lil、 10XBuffer 2 u 1; (3)植物表达载体pBI121 双酶切，将pBI121质粒用X6al和5"acI双酶切反应体系和条件同步骤(2)，酶切产物用1%~ 1.5%琼脂糖凝胶电泳后用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝胶回收试剂盒(购自Qiagen 公司)回收纯化，操作方法同试剂盒说明书；(4)将pBI121酶切产物用T4DNA连接酶与相应 的NLS序列的PCR酶切产物连接，连接反应体系为IO ul: pBI121酶切产物4 lU、 NLS序列PCR 酶切产物4 yl、 T4 DNA连接酶1 ixl、 10XBuffer 1 ul; 16 。C反应15 20 h: (5)将连接 产物转化大肠杆菌DH5a ，获得的阳性克隆基因即为本发明的新基因，命名为/7tA4-""。/77逮因通过公知的农杆菌介导法导入到柑橘感病品种甜橙中，转基因植株经离 体接种柑橘溃疡病菌表现出很强的抗性。 实施例2以从湖南省衡阳市南岳区柑橘溃疡病疫区分离的柑橘溃疡病菌为模板，以P1 /P4为模 板，利用PCR方法扩增出NLS序列，PCR产物用1W 1.5W琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，纯化产 物用15 25 nl无菌水溶解；回收片断用J6a I和5fea I双酶切；酶切反应体系为20 iU:纯 化产物15 ul、两种酶各l. 5 ul、 10XBuffer2 u 1;将pBI121质粒用/力a I和5Jaa I双酶切。 酶切产物用1% 1. 5%琼脂糖凝胶电泳后回收纯化。将pBI121酶切产物与NLS序列的PCR酶切产 物用T4 DNA连接酶连接，连接反应体系为IO yl: pBI121酶切产物4 u 1、 NLS序列PCR酶切产 物4 ul、 T4 DNA连接酶lwl、 10XBuffer 1 ul。 16 'C反应15 20 h。将连接产物转化大 肠杆菌DH5a，获得的阳性克隆基因即为本发明的新基因，命名为/^W-"7s。将ptA4-T7^S因通过公知的农杆菌介导法导入到柑橘感病品种甜橙中，转基因植株经离 体接种柑橘溃疡病菌表现出很强的抗性。实施例3以从湖南省衡阳市南岳区柑橘溃疡病疫区分离的柑橘溃疡病菌为模板，以P2 /P3为模 板，利用PCR方法扩增出NLS序列，PCR产物用W 1.5劣琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，纯化产物 用15 25 wl无菌水溶解；回收片段用5affl/ZI和5scI双酶切；酶切反应体系为20 u 1:纯化产物15 ul、两种酶各1.5 ul、 10XBuffer 2 ul;将pBI121质粒用Sa7z/ZI和&c I双酶切。 酶切产物用1% 1. 5%琼脂糖凝胶电泳后回收纯化；将pBI121酶切产物与NLS序列的PCR酶切产 物用T4 DNA连接酶连接，连接反应体系为IO ul: pBI121酶切产物4 nl、 NLS序列PCR酶切产 物4 nl、 T4 DNA连接酶1 ul、 lOXBuffer 1 ul。 16 。C反应15 20 h;将连接产物转化大 肠杆菌DH5a，获得的阳性克隆基因即为本发明的新基因，命名为/^力/l-y^s。将;^A4-T77連因通过公知的农杆菌介导法导入到柑橘感病品种甜橙中，转基因植株经离 体接种柑橘溃疡病菌表现出很强的抗性。序列表〈uo〉邓子牛<120>抗柑橘溃疡病;7^4-"fe基因及其构建方法与应用〈130〉<140><141>〈160>1<210〉1<211〉13678<212〉DNA〈213〉地毯黄单孢杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv. citri) 〈220〉〈222〉 (5821) ... (6639) <400>1tgagcgtcgcaaaggcgctcggtcttgccttgctcgtcggtgatgtacttcaccagctcc60gcgaagtcgctcttcttgatggagcgcatggggacgtgcttggc幼tcacgcgcaccccc120cggccgttttagcggctaaaa卿tcatggctctgccctccgcccatcat180gaccttgccaagctcgtcctgcttctcttcgatcttcgccagcagggcgaggatcgtggc240atcaccgaaccgcgccgtgcgcgggtcgtcggtgagccagagtttcagcaggccgcccag300gcggcccaggtCgCC3ttg8tgcgggcc兆ctcgcggscgtgctcatagtccacgacgcc360cgtgaUttgtagccctggccgacggccagcaggtaggccgacaggctcatgccggccgc420cgccgccttttcctcaatcgctcttcgttcgtctggaaggcagtacaccttgat8Lggtgg480gctgcccttcctggttggcttggtttcatcagccatccgcttgccctcatctgttacgcc540ggCggtElgCCggccagcctcgc卿gcaggattcccgttgagcaccgccaggtgcg犯ta600agggacagtga3g犯gg肌cacccgctcgcgggtgggcctacttcacctatcctgcccgg660ctgacgccgttggatacaccaaggaaagtctacacgaaccctttggca犯atcctgtata720tcgtgcgaaa犯ggatggateitaccgaa犯aatcgctataatgaccccgaagcagggtta780tgcagcggaaaagcgccacgcttcccg犯ggg柳犯ggcggacaggtatccggt犯gcg840gC3gggtCggaacaggagagCgC3Cg3gggagcttcc3ggggga犯cgcctggtatcttt900atagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttg鄉gtcgatttttgtgatgctcgtcag960gggggcggagcctetgga犯aacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcctttt1020gctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgta1080ttaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagCgC3gCg3gt1140C3gtg3gCg3ggaagcggaag3gcgcc卿aggccgccag柳ggccgeigcgcggccgtg1200aggcttggacgCt鄉gC3gagcccgtagcgggctgctacgggcgtctga1260cgcggtggaaagggggaggggatgttgtctacatggctctgctgtagtgagtgggttgcg1320ctccggcagcggtcctgatcaatcgtcaccctttctcggtccttcaacgttcctgacaac1380gagcctccttttcgccaatcC3tCg3C犯tC3CCgCg8gtccctgctcgaacgctgcgtc1440cggaccggcttcgtcgaaggcgtctatcgcggcccgcaacagcggcgagagcggagcctg1500ttcaacggtgccgccgcgctcgccggca/tcgctgtcgccggcctgctcctcaagcacggc1560aagtagctgattgtcatcagcgcattgacggcgtccccggccgaaaaacc1620cgcctcgcagagg犯gcgaagctgcgcgtcggccgtUccatctgcggtgcgcccggtcg1680cgtgccggcatggstgcgcgcgccatcgcggt鄉cgagcagcgcctgcctg卿ctgcg1740ggcattcccgatcagaaatgagcgccagtcgtcgtcggctctcggcaccgaatgcgtatg1800attctccgcc3gC3tggCttcggccsgtgcgtcg柳agcgcccgcttgttcctgaagtg1860ccagtaaagcgccggctgctgaacccccaeLccgttccgccagtttgcgtgtcgtcagacc1920gtctacgccgacctcgttcaacaggtccagggcggcacggatcactgtattcggctgcaa1980ctttgtcatgcttgacactttatcactgataaacataatatgtccaccaacttatcagtg2040cgcgcgttca3tCgg3CC3gcggaggctggtccggsggccagacgtga犯2100cccaacatacccctgatcgtaattctgagcactgtcgcgctcgacgctgtcggcatcggc2160ctgattatgccggtgctgccgggcctcctgcgcgatctggttcactcgaacgacgtcacc2220gcccactatggcattctgctggcgctgt8tgcgttggtgcaatttgcctgcgc犯ctgtg2280ctgggcgcgctgtcggatcgtttcgggcggcggccaatcttgctcgtctcgctggccggc2340gccagatctggggaaccctgtggttggcatgcacatacaaatggacgaacggataaacci;2400tttcacgcccccgattattctaataaacgctcttttctcttaggtttacc2460cgcc肪tstatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcggg犯scgac幼tctgai2520tcatgagcggagaatt犯ggg3gtC3Cgttatgacccccgccgatgacgcggg3C卿CC2580gttttacgtttggaactgacag犯ccgc肪cgttg犯ggagccactcagccgcgggtttc2640tggagtttaatgagct犯gcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttca犯agtcgcc2700ta兆gtcactatcagctagctgtcaaa幼tgctccactgacgttccataa2760attcccctcggtatcc犯ttagagtctcsttattcactctcatctgcaccg2820gatctggatcgtttcgcatgattgaacaagcgcaggttctccggccgctt2880gggtgg柳ggctattcggctatgactgggcacaacagac犯tcggctgctctgatgccg2940ccgtgUccggctgtcsgcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccg3000gtgccctgaatg肌CtgCELggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcg3060ttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactg肌gcggg犯gggactggctgctattgg3120gcg肪gtgccctcctgtcatctceiccttgctcctgccgagaaagtatcca3180tcatggctgatgc犯tgcggCggCtgC￡lt3cgcttgatccggctacctgcccattcgacc3240accaagcgaaac3tcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatc3300aggatgatctggELCg卿agcatc郷ggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctca33603ggCgCgC3tgcccgacggcgatgstctcgtcgtgacccstggcgstgcctgcttgccga34203t3tC3tggtgg犯aatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtgg3480cggaccgctfttcaggacatagcgttggctscccgtgatattgctg犯gagcttggcggcg3540aatgggctga>ccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcg3600ccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcg3660cc犯gcgeicgcccaacctgcC3tC3Cg3g3tttcgattccaccgccgccttctatgaaag3720gttgggcttcgg犯tcgttttccgggacgccggctggstgatcctccagcgcggggatct3780catgctggagttcttcgcccacgggatctctgCgg犯C3ggcggtcg卿gtgccgatat3840cattacgacagc犯cggccgcgccacgatcctgagcgacaatatgalcgg3900gcccggcgtccacatcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcet卿ccgagatgcaccg3卿cgatatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgCC8C3g3CCCggstgstccc4020cgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattg犯tcctgttgccggtcttgc4080gatgattatcatat肪tttctgttg幼ttacgtt幼gcatgtaataattaacatgtaatg4140catgacgttagggttttt3tgattagagtcccgcaattat4200cgcgatagaa3gcgcgca肌ctaggat肌attatcgcgcgcggtgtcatc4260tatgttactEtgatcgggcctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtg4320gcggctctgagggtggtggctctg鄉gtggcggttctgagggtggcggctctgagggag4380gcggUccggtggtggctctggttccggtgattttgattagcaaacgcta44403t肌gggggCtstgaccg犯犯tgccgatg犯肪cgcgctacagtctgacgcta幼ggca4500aacttgattctgtcgctactgatt￡LCggtgCtgCt3tCg3tggtttcattggtgacgttt4560ccggccttgct朋tggt肪tggtgctactggtgattttgctggctct幼ttccca犯tgg4620tgacggtgataattcacctttttccgtcaatatttacctt4680ccctccctcatgtcgcccttUgtctUggcccaatacgc^犯ccgcctc4740tccccgcgcgttggccgattcattaatgcagCtggC3Cg3caggtttcccgsct 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权利要求
1.一种抗柑橘溃疡病pthA-nls基因，其特征在于，具有如下序列tgagcgtcgc aaaggcgctc ggtcttgcct tgctcgtcgg tgatgtactt caccagctccgcgaagtcgc tcttcttgat ggagcgcatg gggacgtgct tggcaatcac gcgcaccccccggccgtttt agcggctaaa aaagtcatgg ctctgccctc gggcggacca cgcccatcatgaccttgcca agctcgtcct gcttctcttc gatcttcgcc agcagggcga ggatcgtggcatcaccgaac cgcgccgtgc gcgggtcgtc ggtgagccag agtttcagca ggccgcccaggcggcccagg tcgccattga tgcgggccag ctcgcggacg tgctcatagt ccacgacgcccgtgattttg tagccctggc cgacggccag caggtaggcc gacaggctca tgccggccgccgccgccttt tcctcaatcg ctcttcgttc gtctggaagg cagtacacct tgataggtgggctgcccttc ctggttggct tggtttcatc agccatccgc ttgccctcat ctgttacgccggcggtagcc ggccagcctc gcagagcagg attcccgttg agcaccgcca ggtgcgaataagggacagtg aagaaggaac acccgctcgc gggtgggcct acttcaccta tcctgcccggctgacgccgt tggatacacc aaggaaagtc tacacgaacc ctttggcaaa atcctgtatatcgtgcgaaa aaggatggat ataccgaaaa aatcgctata atgaccccga agcagggttatgcagcggaa aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcggcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 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2. —种如权利要求l所述的抗柑橘溃疡病ptM-nls基因的构建方法，其特征在于，包括以 下步骤(1)引物设计，根据基因银行登记序列号为U28802的ptvW基因序列设计溃疡病核定 位信号的特异性引物引物名称序列引入酶切位点上游引物pl5' -gactctagagttgcccagttatctcgccctga-5' -ga卿tccgttgcccagttatctcgccctga-3勘Ip2下游引物P35 z -gcctcgagcaaccatgcgagctcctcttcgttg a-3' 5' -cccggggcctcgagc犯ccatgcgagctcctct tcgt-3'lp45"鹏I;(2) NLS序列的克隆，以P1/P3、 Pl/P4、 P2/P3或P2/P4为引物，以从湖南省柑橘溃疡病疫 区分离的柑橘溃疡病菌为模板，利用公知的PCR方法扩增出NLS序列，PCR反应条件为94°C4 min; 94 °C 30 sec、 58 °C 30 sec、 72 °C 1. 5 min， 35个循环，最后72 。C延伸10 min; (3) PCR产物回收及酶切，PCR产物用W 1.5W琼脂糖凝胶电泳后用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝胶回收试剂盒回收纯化，纯化产物用15 25 iU无菌水溶解；回收片段用Ztel和5"acI 双酶切，其中引物P1 /P4扩增产物采用/6al和5^al双酶切；引物P2 /P3扩增产物采用 fe/^I和&c I双酶切；引物P2 /P4扩增产物采用fe/myi和5"3C I双酶切；酶切反应体系为20 Ul:纯化产物15ul、两种酶各1.5 ixl、 10XBuffer 2 ul;酶切条件为37 。C 5 10 h; 酶切产物用1% 1.5%琼脂糖凝胶电泳后用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA凝胶回收试剂 盒回收纯化；(4)植物表达载体双酶切，将基因银行登记序列号为AF485783的pBI121质粒用 J6a I和&c I双酶切，其中，如连接扩增P1 /P4产物则用J6a I和5〉肪I酶切，连接P2 /P3扩增 产物用5a/zz//1和&c I酶切；连接P2 /P4扩增产物用5a/7z//1和5"ac I酶切；酶切反应体系和条 件同步骤(3);酶切产物用1% 1.5%琼脂糖凝胶电泳后用Qiaquick Gel Extraction Ket DNA 凝胶回收试剂盒回收纯化；(5)连接，将pBI121酶切产物用T4 DNA连接酶与相应的NLS序列 的PCR酶切产物连接，连接反应体系为10 ul: pBI121酶切产物4 ii 1、 NLS序列PCR酶切产物4 ul、 T4 DNA连接酶1 ul、 10XBufferl ul; 16 。C反应15 20 h; (6)克隆，将连接产物 转化大肠杆菌DH5a，获得的阳性克隆基因，命名为/^力力-/ 7&
3.如权利要求l所述的抗柑橘溃疡病pthA-nls基因在柑橘抗溃疡病育种中的应用。
全文摘要
抗柑橘溃疡病pthA-nls基因及其构建方法与应用。本发明利用柑橘溃疡病的致病基因pthA介导广谱抗性原理，构建了抗柑橘溃疡病的新基因pthA-nls。其构建方法包括以下步骤(1)引物设计；(2)NLS序列的克隆；(3)PCR产物回收及酶切；(4)植物表达载体双酶切；(5)将pBI121酶切产物用T4 DNA连接酶与相应的NLS序列的PCR酶切产物连接；(6)将连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得阳性克隆基因pthA-nls。基因pthA-nls可进一步对柑橘的感病品种进行遗传转化，获得抗柑橘溃疡病的新种质。本发明之抗柑橘溃疡病pthA-nls基因为柑橘抗溃疡病育种提供了有效工具。
文档编号C12N15/10GK101260399SQ20081003080
公开日2008年9月10日 申请日期2008年3月13日 优先权日2008年3月13日
发明者张家银, 磊 徐, 娜 李, 莉 杨, 胡春华, 邓子牛 申请人:邓子牛