红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分子鉴别方法

专利名称：红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分子鉴别方法
技术领域：
本发明涉及一种分子生物学领域的分子鉴别方法，具体地，涉及一种红豆杉 中产紫杉醇内生真菌的分子鉴别方法。
背景技术：
紫杉醇(Pacitaxel，商品名taxel)是继阿霉素、顺铂之后最有前途的抗 癌药物，它是以A， B， C和D四个环为核心骨架的二萜类化合物，是一种高效的 细胞毒素。目前紫杉醇主要来源于红豆杉植物(Taxus)的树皮，其含量仅为 0.01%-0.05%。因过度的采伐，红豆杉资源日趋减少，已被国家列为保护植物， 因此寻求紫杉醇或其替代品的新资源已成为目前研究的重点。根据资料报道蒙大 拿州立大学植物病理学家Strobel和化学家Stierle等在1993年首次报道了
从太平洋红豆杉树皮中分离出一种可产生紫杉醇的内生真菌，这种真菌被命名为 安得列亚菌(Taxomyces andreanae)，其紫杉醇含量为24-50ng/L。这一发现具 有重大的科学意义和潜在的商业价值，为人们展示了一个可生产紫杉醇的新途 径。在过去的十多年里，国内外科学工作者从红豆杉及近缘植物分离内生真菌的 工作已有陆续的报道。
植物中紫杉醇的合成由两条截然不同的途径完成 一是经典的甲瓦龙酸 (MVA)途径，另一是新近发现的5-磷酸脱氧木酮糖(DXP)途径，MVA途径位 于细胞质，DXP途径位于质体中。在MVA途径中牴牛儿基栊牛儿基焦磷酸(gerany geranyl pyrophosphate, GGPP)是所有二萜类化合物的共同前体，紫杉二烯合 成酶，又称二萜烯环化酶，它是紫杉醇生物合成途径上的一个质体酶，它催化 GGPP的环化而生成紫杉二烯(taxa-4(5)， ll(12)-diene)，由于这一步反应是生 成紫杉烷类化合物独特的骨架结构而成为整个紫杉醇生物合成途径中的关键步 骤，因此紫杉二烯合成酶成为紫杉醇生物合成途径上的第一个限速酶。前人的研 究证明，紫杉二烯合成酶能催化GGPP环化成taxa-4(5), 11 (12)- diene，在紫杉醇生物合成过程中的起着限速酶的作用，是紫杉醇合成的关键酶。也就是说无 论在真菌还是植物中，紫杉醇的合成由GGPP环化成taxa-4(5),ll(12) -diene 是一个必需的通路。也就是说，在生物体内只要有这一代谢途径关键酶基因的存 在，就一定会有紫杉醇的产生。
经对现有技术文献的检索发现，多数文献大都采取同样的分离方法和鉴定技 术分离并鉴定产紫杉醇的内生真菌，如东北红豆杉内生真菌的分离及产紫杉醇菌 的鉴定(金涛，王伟,刘军等，中草药，2007， 38(5) :770-772)，其技术流程为① 内生真菌的分离采用无菌操作技术从红豆杉中分离并纯化出内生真菌；②发酵 培养内生真菌菌丝体的液体发酵， 一般需要500-1000mL体积的量；③样品中紫
杉醇的提取将内生真菌发酵液滤过，得到的菌丝体研磨破壁，按菌丝体质量与
萃取液体积比为i:5的比例用乙酸乙酯萃取，滤去菌丝的澄清滤液用同等体积
的乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯萃取液合并，50 'C减压蒸干，用5mL甲醇溶解 再浓縮至0.5 mL，获得样品液；④样品中紫杉醇的初步鉴定通过薄层层析 (Thin-Layer Chromatography, TLC)观察紫杉醇特征性蓝点出现的有无，即可 初步判定是否为产紫杉醇菌株；⑤分析和确认通过高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)或高效液相色谱-质谱联用(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, HPLC-MS)等手段进 一步判断是否为产紫杉醇的菌株，即通过与紫杉醇标准品比较，在内生真菌发酵 提取物中能检测出紫杉醇的则分离的样品为紫杉醇产生菌。但是在上述采用TLC 方法对紫杉醇产生菌的初步确认的工作流程仍然存在一些缺陷亟待克服，比如 发酵体积大；紫杉醇抽提过程复杂；溶剂抽提使用试剂多；同时工作量大要经 过抽提、减压浓縮等多项步骤；而且TLC检测的灵敏度较低，在菌株中紫杉醇含 量较少的情况下，TLC不易检测到等。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种红豆杉中产紫杉醇内生 真菌的分子鉴别方法，使其利用紫杉醇合成途径中的特异基因-紫杉二烯合成酶 (Taxa-4(5), 11(12)-diene Synthase, TS)基因的编码序列对分离到的内生真 菌进行鉴别的分子生物学方法。本发明对内生真菌的检测包括来自不同种的红豆杉、或红豆杉不同部位(种子、树枝、树干)中分离到的内生真菌，比背景技术 在初步筛选紫杉醇产生菌方面更加高效、准确，节约了成本，简化了中间处理过 程，且灵敏度高，使用该方法对分离到的内生真菌进行初步筛选，可以避免最后 的检测过程中对人力、物力和财力的浪费 本发明是通过以下技术方案实现的(1) 红豆杉内生真菌的分离、纯化采用常规分离真菌的方法对内生真菌 进行分离，采用菌丝尖端切割法进行纯化。(2) 内生真菌的培养将斜面菌株放至28'C活化24h，挑取斜面试管菌种的菌丝接至马铃薯综合培养基(Potato Dextrose Agar, PDA)平板上，28。C恒 温培养7天(d)。将lcm2左右的平板菌种接至酵母蛋白胨蔗糖培养基(Yeast extract P印tone Sucrose, YPS)，在25-28。C、 120rpm条件下培养36-48h。(3) 内生真菌DNA的提取和检测将培养好的菌丝体10, 000g离心lOmin， 去上清，加入PBS缓冲液洗涤沉淀三次，用液氮将洗涤好的菌丝体研磨成粉末状。 采用高盐低pH法进行DNA的提取和纯化。采用琼脂糖凝胶电泳和紫外光谱法对 提取出的DNA进行检测。(4) 内生真菌的PCR扩增和电泳检测；根据GenBank (http:〃丽w. ncbi. nlm. nih. gov/)上登录的加拿大红豆杉(TaxusCanadensis)紫杉二烯合成酶基因(ts)(GenBank: AY364469)的保守序列设计一对引物，进行PCR扩增，通过电泳检 测，发现差异(仅能从产紫杉醇的内生真菌菌丝中扩增出650bp的特异性条带)， 利用差异进行鉴别，判定筛选结果。(5) 紫杉二烯合成酶基因的克隆和鉴定使用胶回收试剂盒回收DNA片断， 然后用T-A系统将DNA片断与载体连接，之后采用常规的生物学方法进行转化， 最后对阳性菌落进行序列测定。所述步骤(1)中采用常规分离真菌的方法对内生真菌进行分离，包括如下 步骤将野外采集的树干分割成lcm3见方的小块，树枝分割成1cm长的小段， 种子直接用于分离，其分离程序因消毒剂的不同分为三种，可以任取其中一种①红豆杉树皮切成小块，用无菌水清洗3次，然后用75%酒精浸泡3到5min， 再用无菌水冲洗3次，种植在培养基上；② 树皮切成小块，用无菌水清洗3次，用75%酒精浸泡100sec，在用 0. 1。/。HgCL浸泡2min，然后无菌水冲洗3次，种植在培养基上；③ 树皮切成小块，用无菌水清洗3次，75%酒精浸泡lmin、NaC10浸泡10min、 75X酒精浸泡lmin，种植在培养基上。种植材料放置在25-28。C条件下培养3-5 天后，内生真菌开始萌发。所述步骤(1)中的红豆杉内生真菌的分离采用菌丝尖端切割法进行纯化， 该方法是指切取培养菌丝的尖端，移入一新的培养基上培养，切割3-5次即可得 到较纯的菌丝。所述步骤(3)中的采用高盐低pH法提取基因组DNA，包括以下步骤①将 lg左右经液氮研磨的样品放入65'C预热的提取缓冲液，放入65'C水浴保温 30min，缓慢振摇，室温下10, OOOXg离心10min;②在上清液中加入2/3体积 的2. 5mol/L的KAc高盐溶液，混匀后置于(TC保持30min沉淀蛋白质；③在4°C 下10， OOOXg离心lOmin，弃蛋白质沉淀。上清液加入由氯仿和异戊醇按照24:1 的体积比配成的等体积的氯仿和异戊醇的混合物抽提，在6， OOOXg离心10min， 取出水相转入另一离心管，如果中间层仍有白色沉淀，则再用由氯仿和异戊醇按 照24:1的体积比配成的氯仿和异戊醇的混合物抽提一次；④在上清液中加入三 分之二体积的预冷异丙醇，混匀后置于-2(TC静置30min，以沉淀核酸，重复一 次，用体积比为70%乙醇清洗沉淀，在空气中干燥50min，将DNA沉淀溶解在 TE缓冲液中，分装存放于-2(TC或4'C冰箱中保存。所述步骤(3)中的内生真菌DNA的检测，采用琼脂糖凝胶电泳以及紫外光 谱法进行检测。包括以下步骤①琼脂糖凝胶电泳测定法取10uLDNA溶液， 经1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶电泳成像系统分析结果及摄取图像。②紫外光 谱法测定提取的DNA经50倍稀释后，于紫外可见分光光度计上测定其浓度和 纯度。所述步骤(4)中的内生真菌的PCR扩增和电泳检测，是通过以下步骤来实 现的①引物的设计上游引物为TsF: 5' -CAAACCCATGTCGAATTGAGAAG-3，; 下游引物为TsR: 5' -CAAGTTTGCATACACTCTGGAATCT-3，;②PCR扩增PCR扩增 的总反应体系如下，总体积50iiL，包括0. 25uL的TagEx DNA polymerase(TaKaRa)， 5uL的IO,XPCR Buffer, 2. 0uL的dNTP Mix (2.5 mM)， l.OyL 的DNA， 0. 5 y L的TsF (10 u M) ， 0. 5 u L的TsR (10 u M)和40. 75 u L的PCR-Grade Water; PCR扩增程序:94。C变性5min， (94 °C 50sec， 55 °C lmin， 72 °C 80sec) 32个循环，72'C延伸5min，反应结束后取5 y L产物用质量百分比为1%琼脂糖 凝胶电泳检测，EB染色观察。所述步骤(5)中的紫杉二烯合成酶基因的克隆和鉴定，是通过以下步骤来 实现的①PCR扩增片段的回收，使用胶回收试剂盒回收片段，按胶回收试剂盒 的步骤操作。②连接采用T-A系统将DNA片段与pMD18-T载体连接，反应体系 如下，总体积10yL，包括1 ii L的pMD18-T Vector DNA， luL的回收片断，5uL 的连接溶液I和3wL的无菌水；反应条件16°C， 30min以上。连接好的片段 可用于转化。③转化感受态细胞的制备在工作平板上挑取DH5cc单菌落接种 到20-30mL无抗生素的LB培养基中，在240-260 rpm摇床中37。C摇菌至0D6。。=0. 5 (约6-8h);取出菌液与0.1 mol/L CaCl2同时置于冰浴中15-30 min;然后在 灭菌的超净台上取1. 5mL菌液于1. 5mLEP管中，4'C 5000-8000 rpm离心5 min 收集菌体；用移液器吸去上清，并用500nL冰冷的0. 1 mol/L CaCl2重悬菌体； 离心后用移液器吸去上清，用200uL冰冷的0.1 mol/L CaCl2重悬菌体，最后 置冰浴过夜备用。采用如下方法进行转化将10u L连接片段与100 ii L感受态 细胞混合；放置冰上，30min; 42。C水浴放置90sec;放置冰上1-2min;加入800 u L LB培养液，在摇床(37°C， 200rpm)中培养lh;取100 u L溶液均匀涂在LB平 板上(含Amp， X-gal， IPTG); 37°C的培养箱中培养过夜。 阳性菌落的鉴定 取白色菌落用菌落PCR法或转化质粒的酶切鉴定阳性菌落。⑤序列测定。所述步骤(4)中"仅能从产紫杉醇的内生真菌菌丝中可扩增出650bp的 特异性条带，利用差异进行鉴别，判定筛选结果"是指产紫杉醇内生真菌中能 扩增出一条650bp左右的条带，扩增片断经回收、克隆和测序后，与GenBank 上的TS基因序列(GenBank: AY364469)比对，同源性较高。不能产紫杉醇的内 生真菌则不能扩增出此条带。本发明尝试了利用TS基因保守序列PCR扩增的方法，对紫杉醇产生菌进行 初步筛选，初次筛选使用发酵量小(50ml即可)，并且省去了初筛中化学溶剂提的步骤，因此克服了背景技术中，利用TLC或HPLC方法初筛紫杉醇产生菌， 其工作程序繁琐、工作量大、试剂消耗多、检测水平低等一系列缺陷。在深入了 解紫杉醇代谢途径的分子生物学基础上，结合其它生物化学的检测手段，试图从分子水平上寻找新的标记手段，从而实现从大分子水平上揭示小分子药用成份的 分布规律，使有效成份分析更加科学化和现代化，把对紫杉醇产生菌的检测由原 来的化学检测水平提高到现在的分子检测水平。同时，本发明利用特异基因序列 对内生真菌是否产紫杉醇进行简单、快速、准确的初步鉴别，为进一步研发和使 用奠定了基础。本发明中所涉及的菌株已在参考文献(金涛,王伟，刘军,平文祥,周东坡.东 北红豆杉内生真菌的分离及产紫杉醇菌的鉴定，中草药，2007, 38(5) :770- 772) 中公开。


图1 内生真菌的PCR扩增和电泳检测结果示意图。 图2 扩增片断与ts基因序列对比示意图；其中TS-Tc为GenBank登陆的ts基因的序列；TS-1为本次克隆的序列，灰色背景为两者不同的碱基。图3 分离菌的发酵提取物的和紫杉醇标准品的HPLC测定结果示意图； 其中图3A是分离菌的发酵提取物的HPLC测定结果示意图；图3B是紫杉醇标准品的HPLC测定结果示意图。图4 分离菌的发酵提取物的和紫杉醇标准品溶液的质谱分析示意图； 图中所示为相关化合物分子量的信息，其中图4A是检测到的紫杉醇加钠和加氢的离子峰值示意图；图4B是检测到的样品加钠和加氢的离子峰值示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案 为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于 下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。实施例1:检测分离于曼地亚红豆杉(Taxus media)的内生真菌是否产紫杉醇的PCR检测1. 菌丝体的培养将分离并纯化放在4t:冰箱保藏的内生真菌斜面菌株放至28'C活化24h，挑 取斜面试管菌种的菌丝接至PDA固体培养基平板上，28'C恒温培养2-3d。用接 种铲将lcW左右的平板菌种接至YPS液体培养基，并捣碎。28°C， 120rpm震荡培养。2. 菌丝体的准备将培养好的菌丝体10, OOOXg离心10min，去上清，然后加入PBS缓冲液洗 涤沉淀3次，最后用液氮将洗涤好的菌丝体研磨成粉末状。3. 菌丝体基因组DNA提取在lg材料中加入65。C预热的提取缓冲液，65'C水浴保温30min，缓慢振摇； 在室温下10， OOOXg离心10min;然后在上清液中加入2/3体积的KAc高盐溶液， 混匀后置于O'C保持30min以沉淀蛋白质；然后在4°C 10， OOOXg离心10min， 弃蛋白质沉淀；上清液加入等体积的氯仿和异戊醇混合物(体积比24:1)抽提， 在6，000Xg离心lOmin使分层，取出水相转入另一离心管；然后在上清液中加 入三分之二体积的预冷的异丙醇，混匀后置于-20'C过夜以沉淀核酸；用70%乙 醇洗涤沉淀，在空气中干燥5min;最后将DNA沉淀溶解在TE缓冲液或超纯水中， 放置于-2(TC保存备用。4. DNA的检测(1) 取10uL DNA溶液，经质量比为1%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶电 泳成像系统分析结果及摄取图像；(2) 紫外光谱法测定DNA经50倍稀释后，于紫外可见分光光度计上测定 其浓度和纯度。5. 引物设计根据GenBank (AY364469)上登录的紫杉二烯合成酶(Taxa-4(5)， 11(12) -diene Synthase, TS)基因的保守序列设计一对引物 上游引物TsF: 5， -CAAACCCATGTCGAATTGAGAAG-3，下游引物TsR: 5， -CAAGTTTGCATACACTCTGGAATCT-3， 引物由上海生工生物工程有限公司合成。6. PCR反应PCR反应体系包括5叱的10Xbuffer， 2hL dNTP (25mmol/L)，引物2叱， Taq酶0. 25叱(TaKaRa)， DNA模板lpL，无菌去离子水补足50叱。PCR扩增程 序94。C变性5min， (94 。C 50sec， 55 。C lmin， 72 。C 80sec) 32个循环，72°C 5min。 PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色观察。结果如图1所示， 能扩增出大约650左右的条带的样品说明该内生真菌中有ts基因的存在。7. 胶回收把扩增特异的DNA谱带用割胶铲从琼脂糖凝胶中割下，采用上海华舜生物工 程有限公司的柱离心式小量胶回收试剂盒进行DNA回收纯化。具体操作细节详见 说明书。8. 克隆和鉴定采用T-A系统将DNA片段与pMD18-T载体连接，反应体系如下，总体积10 y L， 包括1 y L的pMD18-T Vector DNA， 1 ii L的回收片断，5 y 1的连接溶液I和3 u L 的无菌水；反应条件16°C， 30min以上。连接好的片段可用于转化；转化将 10 u L连接片段与100 w L感受态细胞混合，放置冰上30min，在42'C水浴放置 90sec后放置冰上l-2min，然后加入800 u L LB培养液，在37°C， 200rpm的摇 床中培养lh，最后取100uL溶液均匀涂在含Amp、 X-gal、 IPTG的LB平板上 在37'C的培养箱中培养过夜，取白色菌落用菌落PCR法或转化质粒的酶切鉴定 阳性菌落。9. 测序在上海Invotrogen公司对阳性克隆进行测序。10. 序列分析 测定的序列结构如下CCTGACGAAG GAGCTATGGA CGATGCTAGA AAATTTGCAG AACCATATCT TAGAGACGCA 61 CTTGCAACGA AAATCTCAAC CAATACAAAA CTATACAAAG AGATTGAGTA CGTGGTGGAG 121TACCCTTGGC ACATGAGTAT CCCACGCCTA GAAGCTAGAA GTTATATTGA TTCGTATGAC 181 GACGATTATG TATGGCAGAG GAAGATTCTA TACAGAATGC CATCTTTGAG TAATTCAAAA 241 TGTTTAGAAT TGGCAAAATT GGACTTCAAT ATCGTACAAT CTTTGCATCA AGAGGAGTTG 301 AAGCTTCTAA CAAGATGGTG GAAGGAATCC GGCATGGCAG ATATAAATTT CACTCGACAC 361 CGAGTGGCGG AGGTTTATTT TTCATCAGCT ACATTTGAAC CTGAATATTC TGCCACTAGA 421 ATTGCCTTCA CAAAAATTGG TTGTTTACAA GTCCTTTTTG ATGATATGGC TGACATCTTT 481 GCAACACTAG ATGAATTGAA AAGTTTCACT GAGGGAGTAA AGAGATGGGA TACATCTTTG 541 CTACATGAGA TTCCAGAGTG TATGCAAACT TG 601 11.结果分析
把扩增出的650bp条带的扩增片断经回收、克隆和测序后，与GenBank上 ts序列比对，结果如图2所示扩增片段与GenBank上登陆的ts基因相比，仅
有几个碱基对的差别。
结果显示，从内生真菌中克隆出来的ts基因的核心片断和GenBank上登陆 的序列具有高度的同源性，说明该内生真菌中有ts基因的存在，这从分子水平 上则说明该内生真菌是产紫杉醇的内生真菌。
实施例2:
利用HPLC-MS进一步分析内生真菌是否产紫杉醇
1.实验方法 (1)紫杉醇及紫杉垸类化合物提取和分离
分别将分离自红豆杉的内生真菌(PDA斜面保藏)接种于250 mL三角瓶种 子液中，25。C振荡培养3d后，按10X的接种量转接至500mL三角瓶发酵液中， 25'C振荡培养15d，通过离心得到菌丝体和上清液。发酵液离心，上清55'C旋转 蒸发至十分之一体积后，加入等体积的乙酸乙酯萃取3到5h;沉淀后再加入等 体积的乙酸乙酯浸提3到5h;再将上清和沉淀各提取3次，分别合并酯层。将 酯层在45'C分别旋转蒸发至干，加入0. 5 mL乙醇溶解。沉淀的菌丝体经低温反 复冻融2次后，加入一定量的乙醇超声波提取lh，重复2次，合并上述三种乙 醇提取液，45。C旋转蒸发至干，加入0.5mL乙醇溶解。合并上清液和菌丝体的 乙醇提取物，用于HPLC-MS检测。(2) HPLC-MS检测 ①色谱分离条件色谱分离按二元梯度方式进行。条件如下:
时间(min)甲醇(％)水(％)
0.011000
105050
206040
231000
301000
355050
流速为0. 6mL/min。进样量为10 y L，柱后流出物依次经UV和MSD检测。UV 检测波长为230nm，经UV检测器流出的流分进入电喷雾离子化(ESI)喷雾室。
②质谱检测参数检测模式为Scan模式，离子极性Pos (正离子)，离子化 方式ESI， m/z扫描范围50-2300,检测离子分别为H+、Na+、K+，干燥气温度350°C， 雾化器流量为10L/min， CID电压70 V，毛细管电压3.0KV。
2.实验结果
从分离菌株发酵提取物和紫杉醇标准品的HPLC测定结果可以看出，在相同 色谱条件下，紫杉醇标准品的保留时间为17.202 min (图3B)， PCR检测能扩增 出650bp的分离菌的发酵提取物在相同保留时间处，有一对应峰出现(图3A)， 则证明该菌株能够产紫杉醇，进一步在高效液相-质谱联用中通过质谱分析获得 相关化合物分子量以及与结构相关的碎片离子的信息(图4)。
4.结果分析
如图4A中，标准品紫杉醇加钠离子的离子峰值为876. 2，图4B样品中同样 也能找到质谱的离子峰为876.5;再之图4A中标准品加氢离子的离子峰值为 854.3，图4B样品中同样也能找到离子峰值854.5。这就说明该样品中检测到了 紫杉醇的存在，从而证明分离出能够扩增出650bp条带的真菌是产紫杉醇的内生 真菌。序列表
〈110〉上海交通大学
〈120>红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分子鉴别方法
<160〉3
〈170〉Patentln version 3.1
〈210>1
〈211〉632
〈212>腿
〈213>真菌
〈400〉1
caaacccatg tcgaattgag aagcgtggtg aatcttttca gagcttccga ccttgcattt 1 cctgacgaag gagctatgga cgatgctaga a犯tttgcag aaccatatct tagagacgca 61 cttgcaacga aaatctcaac caatacaaaa ctatacaaag agattgagta cgtggtggag 121 tacccttggc acatgagtat cccacgccta gaagctagaa gttatattga ttcgtatgac 181 gacgattatg tatggcagag gaagattcta tacagaatgc catctttgag taattcaaaa 241 tgtttagaat tggcaaaatt ggacttcaat atcgtacaat ctttgcatca agaggagttg 301 aagcttctaa caagatggtg gaaggaatcc ggcatggcag a.tataaattt cactcgacac 361 cgagtggcgg aggtttattt ttcatcagct acatttgaac ctga^tattc tgccactaga 421 attgccttca caaaaattgg ttgtttacaa gtcctttttg atgatatggc tgacatcttt 481 gcaacactag atgaattgaa aagtttcact gagggagtaa agagatggga tac已tctttg 541 ctacatgaga ttccagagtg tatgcaaact tg 60权利要求
1、一种利用特异基因序列初步筛选产紫杉醇内生真菌的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)红豆杉内生真菌的分离、纯化分离内生真菌并且采用菌丝尖端切割法进行纯化；(2)内生真菌的培养将斜面菌株放至28℃活化24h，挑取菌丝接至固体培养基平板上，28℃恒温培养7天后将菌种接至液体培养基，在25-28℃、120rpm条件下培养36-48h；(3)内生真菌DNA的提取和检测将培养好的菌丝体离心后去上清，加入缓冲液洗涤沉淀3次，将洗涤好的菌丝体研磨成粉末状，然后提取和纯化DNA，最后对提取出的DNA进行检测；(4)内生真菌的PCR扩增和电泳检测；根据GenBank上登录的紫杉二烯合成酶基因的保守序列设计一对引物，进行PCR扩增，通过电泳检测，仅能从产紫杉醇的内生真菌菌丝中扩增出650bp的特异性条带，利用差异进行鉴别，判定筛选结果；(5)紫杉二烯合成酶基因的克隆和鉴定回收DNA片断，然后用T-A系统将DNA片断与载体连接，转化后对阳性菌落进行序列测定。
2、根据权利要求l所述的利用特异基因序列初步筛选产紫杉醇内生真菌的 方法，其特征是，步骤(3)中所述的内生真菌菌丝体DNA的提取和纯化，采用 高盐低pH提取法提取基因组DNA，该提取方法包括以下步骤① 经研磨的样品放入65。C预热的提取缓冲液，放入65'C水浴保温30min， 室温下10, OOOXg离心10min;② 在上清液中加入三分之二体积的2. 5mol/L的KAc高盐溶液，混匀后置于 (TC保持30min以沉淀蛋白质；③ 在4'C下10,000Xg离心10min，弃蛋白质沉淀，上清液加入等体积的体 积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合物抽提，在6， OOOXg离心10min，取出水相 转入另一离心管，如果中间层仍有白色沉淀，则再用体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合物抽提一次；④在上清液中加入三分之二体积的预冷异丙醇，混匀后置于-2(TC静置 30min，以沉淀核酸，重复一次，用体积比为70%的乙醇清洗沉淀，在空气中干 燥50min，将DNA沉淀溶解在TE缓冲液中，分装存放于-2(TC或4'C冰箱中保存。
3、根据权利要求l所述的利用特异基因序列初步筛选产紫杉醇内生真菌的 方法，其特征是，步骤(4)中所述的设计的一对特异引物的序列为引物l， TsF: 5， -CAAACCCATGTCGAATTGAGAAG-3，；引物2， TsR: 5' -CAAGTTTGCATACACTCTGGAATCT-3'。
全文摘要
一种分子生物学技术领域的分子鉴别方法。该检测方法包括如下步骤从红豆杉中分离内生真菌并进行保藏和培养；将培养的内生真菌菌丝体洗涤沉淀，研磨成粉末状；内生真菌DNA的提取和纯化；PCR扩增、PCR产物的电泳检测和特异基因序列的测定；通过从内生真菌中能否扩增出650bp大小的特异性条带来区分该菌株是否产紫杉醇；通过化学检测程序进一步确定结果的可靠性。本发明利用特异基因序列对内生真菌是否产紫杉醇进行简单、快速、准确的初步鉴别，为进一步研发和使用奠定了基础。
文档编号C12Q1/04GK101302555SQ20081003883
公开日2008年11月12日 申请日期2008年6月12日 优先权日2008年6月12日
发明者周选围, 唐克轩, 娟 林, 魏雅敏 申请人:上海交通大学