水稻杂种花粉育性基因及其应用的制作方法

专利名称：水稻杂种花粉育性基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及水稻杂种花粉育性基因的分 离克隆及其功能验证，以及在水稻杂交育种中的应用。
背景技术：
植物通过不同品种间的杂交产生杂种。杂种在生长势、适应性、 产量等方面具有优势，称为杂种优势。利用杂种优势可以提高农作物
的产量、品质和抗性。亚洲栽培稻的籼稻(Oy加^rira ssp. /mfea ) 和粳稻(a^"wzssp.y^x m'cfl)亚种间的杂种有强大的杂种优势，增 产潜力很大。另 一方面，通过栽培稻与野生稻杂交和回交等育种方法， 可以将存在于野生稻的一些有用性状如抗病、抗虫、高产等导入栽培 稻，培育出优良新品种。但是，籼粳亚种间杂交以及栽培稻与野生稻 杂交产生的杂种存在育性低或不育的问题，称为杂种不育(hybrid sterility)。所述的杂种不育是稻属物种分化过程中产生的生殖隔离的 机制之一，属于合子后生殖隔离(postzygotic isolation )。杂种不育现 象严重阻碍了水稻杂种优势和野生稻有用基因的利用。
在水稻中，有多个基因座(locus)与水稻杂种育性有关。所述的 基因座是细胞遗传学水平的概念，是指染色体的一个特定区域，可能 包含1个或1个以上的相关基因控制同一性状。这些杂种育性基因座 中，有些是导致雌配子不育，如S5，57, S&S9，W5，W7，有些是导致 雄配子(花粉)不育，如Sa，幼，&， 51《&， # Kinoshita 1995， Rice Genet. Newsl., 12:9-15; Ikehashi等1988, Japan J. Breed. 38:283-291; Ikehashi 等1996, Rice Genet III， pp404-408; Wang等1996, Theor Appl Genet 92:183-190; Wang等1998, Rice Genet Newsl 15:151-154;张桂权等 1989,中国水稻科学3: 97-101;张桂权等1993,遗传学报20:222-228;张桂权等1993,遗传学报20: 541-551;张桂权等1994， 遗传学报21: 34-41)。这些基因座在不同品种或品系或野生稻材料 中可以有不同程度的变异分化，产生多种复等位基因座。根据携带这 些复等位基因座的水稻亚种类型以及对杂种育性的效应，它们被划分 为籼型(y)、粳型(50、亲和型(y)、或其它过渡类型。所述的基 因符号S代表杂种育性基因座，S5， &等指特定的杂种不育基因座， ''，、"分别代表籼型(,V2A'cfl)、粳型O'apo"/ca)、和中性型("eutral) 的复等位基因座，如5W、或S""。中性型也称为亲和型
(compatibility)或广亲和型(wide compatibility )。
在水稻杂种中，分化程度较大的杂种育性基因座在杂合状态下 往往发生不亲和互作，导致携带某一等位基因座的雄配子(或雌配子) 发育不正常。这种现象也称为杂种的等位基因特异杀配子
(allele-specific gamete elimination)效应。但是，这些基因座在纟电合
状态下(如纯合的亲本)不影响配子的正常发育。大部分杂种不育基 因座的遗传行为符合"单座位孢子体_配子体互作"的模式(Oka, 1974, Genetics 77, 521-534)。例如，用分别携带A/ASW^ 6"a'AStf'基因 型的水稻粳稻和近等基因系杂交，产生的杂种一代(F0的基因型为 Sa'ASA其产生的雄配子中，携带&''等位基因座的正常可育，而携 带5^'等位基因的雄配子发育异常(不育)。因此表现为约50%的花 粉不育即半不育。但雌配子的育性不受&'AS乂杂合基因座的影响。结 果导致杂种二代(F2)代群体中携带基因型的植株的比例严重 偏少，即严重偏离Sa'/6tf : 5tfASW': ^/fe^l: 2: 1的孟德尔分离 规律。但是，用携带亲和型等位基因座^fASfl"的亲本与携带 或WW等位基因的水稻亲本杂交(F！的基因型为或 F2代群体中3种基因型的分离符合l: 2: 1的分离规律，即该杂合的 等位基因不产生等位基因特异杀配子效应，对籼型和粳型等位基 因座都是亲和的。因此，用携带亲和等位基因座的亲本与粳稻或籼稻杂交，可以提高杂种的育性。
目前已报道了 一些水稻杂种育性基因的染色体定位，但杂种花粉 不育或亲和(可育)的分子基础还不清楚。S"是控制水稻杂种花粉 育性的基因座之一，它已被初步定位于第1染色体(庄楚雄等1994,
遗传学报21: 34-37)。为了在杂交水稻育种中有效地克服杂种不育 性问题，本发明通过图位克隆(map-based cloning)技术在& 座获得 了的2个相邻的杂种育性相关基因，包括它们的籼型和粳型等位基 因，以及产生亲和性的等位基因组合。通过转基因实验验证了这些基 因的功能，并提出通过基因工程技术或杂交-回交育种培育杂种育性 亲和系的方法。

发明内容
(一) 所要解决的技术问题 本发明的第一个目的是分离克隆水稻杂种花粉育性基因的DNA片段。
本发明的第二个目的是提供上述杂种花粉育性基因所编码的蛋 白质。
本发明的第三个目的是提供上述杂种育性基因在培育杂种育性 亲和系中的应用。
本发明的再一个目的是提供上述杂种育性基因产生的分子标记 或其紧密连锁标记及其在水稻杂交育种中的应用。
(二) 技术方案
本发明涉及分离和应用包含杂种育性基因座Sa有关的基因，该 基因控制水稻品种(系)间或水稻与野生稻间杂交产生的杂种的花粉 育性。
本发明利用图位克隆法克隆了 &基因座有关基因并验证了其功 能，其技术方案如下
1、 ^基因座的精细定位和目标基因的发现&基因座已被定位于水稻第1染色体上的大致区域(庄楚雄等
1994，遗传学报21: 34-37)。根据公开的水稻基因组序列数据库的 资料(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)，在该区域发展了多个分子标记。 用粳稻台中65 (代号T65，携带&V5^'基因型)和它的近等基因系E4 (携带籼型基因型&'/& )杂交，产生Fi和F2群体，经过连锁分析， 把&精细定位在一个10.6kb的区间。
根据水稻基因组序列数据库(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)的资 料，在定位的10.6 kb区间内有2个相邻的基因，本发明将它们分别 命名为&M和&尺遗传分析表明，在F2重组体中，只有含有杂合 的5Wlf以及同时有来源于E4的等位基因，即同时含有这3种等 位基因的个体才能产生杂种花粉半不育。表明&座位由SoM和 组成，这2个基因的遗传互作是&座位产生杂种不育的原因。进一 步用细菌双杂交系统证实这2个基因的特定等位基因编码的蛋白之 间发生相互作用。
2、 ^M和5V^等位基因的序列测定比较分析
用聚合酶链式反应(PCR)技术从多个籼型、粳型、和亲和型水 稻品种(系)扩增出5^M和5WF等位基因片段并测定其序列。籼型 feM和5"aF等位基因被命名为&^和5""Z，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO:5所示，它们分别编码具有SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 7所示的氨基酸多肽序列。粳型的和&f等位基因 被命名为feM和其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO:7所示，它们分别编码具有SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 8所示 的氨基酸多肽序列。5""AT和SflM编码新的蛋白SaM+和SaM-,其C 端与酵母的Mms21蛋白即类泛素E3连接酶(small ubiquitin-like modifier E3 ligase )有部分同源。与SaM+相比，SaM—的C端截断了 40个氨基酸。Sa纩和SoP编码功能未知的F-box蛋白，它们之间存 在l个氨基酸差异，即在287位处SaF+是苯丙氨酸氨，SaF变为丝氨酸。亲和型品种含有5"aMV^aMV/SaFASaF基因型。这些不同的基因 型品种间的杂种含有不同组合的杂合基因型，产生雄配子不亲和效应 即花粉半不育，或亲和效应即花粉全可育。 3、 5^M和&F等位基因的功能验证
用PCR技术从E4扩增&7/和fei^，以及从T65扩增SaM, 它们包括启动子区、编码区、以及下游序列，构建植物转化表达载体。 将^M转化含有基因型为SaiW7&7k/7/S"a/^ASai^的E4，获得的T0代 转化体表现为花粉半不育；将S"W转化含有基因型为 5WW76^W7/S"7^AS"F的花粉全可育重组体，获得的T。代转化体表现 为花粉全不育；将5^,转化含有基因型为Sa^W7& iW7/SbFASaF的花 粉全可育重组体，获得的T。代转化体表现为花粉半不育。另外，在 粳稻中导入产生RNA干扰(RNA interference, RNAi)反应的5"aM或 &尸的序列结构，再与E4杂交。产生的杂种F,的SaM或feF的表 达受到抑制，结果其花粉育性得到恢复。这些结果证明了各个等位基 因的生物学功能，说明只有当Sa7kT、 6bM以及&LF^这3个等位基因 都具备时才使含有S"M的花粉产生不育；植株中缺少其中的任何一 个等位基因，或抑制任何一个基因的表达，可以恢复杂种的花粉育性。
应当理解，在不影响S"M以及&^蛋白活性的前提下，本领域 技术人员可对SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6以及SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几 个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。
此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨 基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响SflM或5WF表达的条 件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对 编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核 苷酸，具有与上述编码基因具有相同功能的核苷酸序列。本发明还包
括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述 核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。 (三)有益效果
本发明提供的杂种育性基因具有重要的应用价值。应用之一是培 育杂种育性亲和系。本发明提供通过基因工程技术如使用RNA干扰
技术或反义RNA技术或其它有效技术，控制feM或^F或它们二者 的表达，获得能抑制所述基因表达的杂种育性亲和系。还可以用获得 的转化植株为亲本与其它水稻品种或品系杂交，培育出新的杂种育性 亲和系。本发明所述的基因构建到转化载体中，可以对所述基因或其 调控序列作适当修饰，也可以用其它启动子取代所述基因原有的启动 子，使之达到同等的或强化的表达效果。
本发明提供的杂种育性基因的另一个应用是根据所述基因序列 信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP (单核苷酸多态)、 Indel (插入缺失多态)、RFLP (限制性内切酶长度多态)、CAP (切 割扩增片段多态)。用这些标记可鉴定栽培稻或野生稻或它们的杂交 后代群体植株的基因型，培育水稻杂种育性亲和系。例如，可以用携 带亲和型&基因座如其基因型为feil/ZSa^V/S^FASaF的栽培稻或野 生稻材料为供体亲本，其它粳稻或籼稻品种(系)为轮回亲本，进行 杂交和回交，利用根据本发明产生的特异分子标记进行筛选，培育出 新的杂种育性亲和系。用本发明的方法获得杂种育性亲和系与其它粳 稻或籼稻或野生稻亲本杂交，可产生育性正常的杂种，有利于新的品 种选育或生产杂交种。


图1、显示水稻5""基因的遗传模式及其基因型对花粉育性的效 应。(A)粳稻T65 (&"W)产生的正常可育花粉；(B)近等基因系 E4(& 》a')产生的正常可育花粉；(C )T65与E4杂交的杂种F,(5"a':SaO 产生半不育花粉，即约50%的花粉不育；(D-F) T65 x E4杂种的F2
8植株中，不同基因型植株的频率及其花粉育性。各种基因型频率是用
共分离标记M76.3 (图2,表1 )检测666株F2植株所得。 图2、显示水稻5"a基因座在第1染色体的精细定位及5bM与 基因的发现。各标记的数字同时表示在一个公开的细菌人工染色体 P0013G02上的位置(kb )。 ATG和TAG/TGA分别表示起始密码和终 止密码。
图3、显示籼型(E4)和粳型(T65)的SaM和SaF蛋白结构及
其差异。
图4、显示功能互补实验，转基因导入tSbM(A)、 tSfl7kT(B)、和
t&y(c)使受体水稻产生花粉半不育或全不育。转化受体水稻的基因
型如图所示。
图5、显示用细菌双杂交检测&7l^(M")、 5""AT(M)、 5"ai^C^)、 和&F(F)的互作。细菌生长表示有互作。pBT和pTRG为诱饵载体 和捕获载体，分别用于表达SaM和SaF。
图6、显示用反转录PCR检测& M和5^F在亲本幼穗的表达以 及它们在杂种Fi幼穗的表达受RNA干扰(RNAi)的抑制。(E4) 和(T65)的全长cDNA分别为1101 bp和1021 bp。
图7、显示RNA干扰抑制^M和SaF在杂种Fi的表达产生育性 恢复。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容。若未特别指明，所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例l:多态性分子标记的筛选和S"的精细定位
已知^定位在水稻第1染色体上的大致区域(庄楚雄等1994，遗 传学报21: 34-37)。本发明用如图2所示的图位克隆方法进一步克 隆Sa基因。首先用粳稻品种台中65 (简称T65，具有基因型&占《0 与其近等基因系E4(W&0杂交，建立了一个F2代分离群体。本发明所用的近等基因系E4，是除了 6""'等位基因座及其附近区域是来源
于籼稻外，其核基因组背景与T65相同的品系(庄楚雄等1994，遗传 学报21: 34-37)。因此它们的杂种的雄性不育性的遗传分离只受 杂合基因互作效应的影响。用1% 12-KI溶液染色鉴定花粉的形态， 确定F2植株的花粉育性表型，即全可育或半不育(图1)。
根据公开的水稻基因组序列数据库的资料 (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)，在该区域发展了多个多态性分子标记， 如表1所示。
表l.与^/紧密连锁或共分离的多态性分子标记
标记名标记类型引物名引物序列(5'.…3')
M63SSRG02-63ATGATGAGATGGCGCTGACAT
G02-63BGTTTCCCGTCGCCGTTTCT
M69Indel68861ATGTGCACTCGTCTCTCATCT
69002BGGTGGTGAAGAGAGGCTTG
M69.8SNP69421ACCGCTGTGTTCTCCTGCTCA
70891BATGGAGAGGAACTACTGACACA
69799B-iCCAAAATGCGCATTTT
69799B-JCCAAAATGCGCATTTC
M72Indel71928ACATTTCAAGGAGACGATAAAGT
72108BGCCAAAATTCTCTATGTATTACT
M73SSR72863ACGCAGAGGCTGGAGGATGTGCT
73050BCTTCCCCCAAAATGCTATCGT
M74.6SNP73791AGCAGTTATGTGGTTATGTCTGATT
74801BCCCTGATGAAGTCAATGGCA
74.6B-iTATGTGGCCACAAGTCATAC
74.6B-JTATGTGGCCACAAGTCATAA
M76.3Indel76.3AGTCATGCTGTTGTTGCCGTA
76.4BCACAAACTCAGATGTATCAATTA
M78.5Indel78431AGGTCGGATTATCACAAGGGA
78579BAGGTCCATCCCTCTCCTCT
M79.6SNP79.0AGTGCGTGGCCCTCCCGGA
79672BGGAGGAGCACCAGTTCCAGTT
79576B-4CACCACGTCCTTGAAA
79576B-5CACCACGTCCTTGAGC
表1中的SSR为微卫星标记；Indel为插入/缺失标记；SNP为单
10核苷酸多态性标记。基于PCR的一种SNP检测方法为在20plPCR 反应液中加入1 ^水稻DNA(约50ng)，用表1所示的引物"A"和"B" 扩增33个循环(94。C 30s, 63°C lmin， 72°C lmin)。然后取0.5 pl PCR 产物为第2次PCR的模板，每个样品配制2个PCR反应(20 pl)， 即用引物"A"和"B-i"为E4基因型的特异反应，用引物"A"和"B-j"为 T65基因型的特异反应，扩增8-IO个循环(94°C 30s， 58°C lmin， 72°C lmin)。用1 %琼脂糖凝胶检测PCR产物。
利用遗传作图的方法和上述10000多株F2植株构建了一个&基 因座的遗传连锁图(图2)。图中所示的重组体将S"基因座确定在2 个标记即M69和M79.6之间的10.6 kb区域内。所述的定位区域位于 已公开的水稻细菌人工染色体P0013G02 (http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov) 的约69-79.6 kb处。
实施例2: 5 座位相关基因的序列分析
根据GenBank公开的水稻(粳稻)基因组DNA序列和RiceGAAS 软件(http:〃ricegaas.dna.affrc.go.jp)分析，在所述的定位区域内只存在 2个预测的基因，分别命名为S"M和So尺遗传分析表明，在不同的 F2重组体中，只有含有杂合的&M以及同时有1个或2个来源于E4 的等位基因即杂合或纯合的E4 的个体才能产生杂种花 粉半不育(图2)。表明5"a座位由SaF和SaM组成，这2个基因的3
个等位基因的遗传互作产生杂种不育。
使用引物5，-TCTAAGGGATCCAGGCGCGGGTGAAGCAAACT AGAC-3，(下划线为万amHI)和5，-ATTTAAGAATTCGCCGTCTTA ACACACATTGGAAAA-3，(下划线为五coRI)用PCR技术从T65、 E4、和多个籼型(广路矮4、 93-11、明恢63等等)和粳型(日本睛、 中花11等等)水稻DNA扩增出S"F基因片段。本PCR反应使用高 保真LA-Taq酶(宝生物工程公司)，扩增30个循环(94°C 30s, 62°C 1 min， 72°C 5 min )。
使用 引 物5，-TGGATAAGCTTAGTACTATACTTGATGGGGTGCAAGTAA-3' (下划线为州"din)和5，-TGTTGAGCTCGGGCGTTGTTTCATC TTATTAAAAATAATG-3，(下划线为5""cl)，用PCR技术从T65、 E4、 和多个籼型(广路矮4、 93-11、明恢63等等)和粳型(曰本晴、中 花11等等)水稻DNA扩增出feM基因片段。将获得的基因片段连 接克隆到质粒载体pUC18,并测定其序列。
E4及其它籼稻品种如广路矮4、 93-11、明恢63的6bM和5kF 等位基因被命名为&^和&7^,其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1、 SEQIDNO:5所示，它们分别编码具有SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 7所示的氨基酸多肽序列。T65及其它粳稻品种如曰本晴、中花11 的StxP和5"aM等位基因被命名为5bM和&F，其核苷酸序列如序列 表SEQ ID NO: 3、 SEQ IDNO:7所示，它们分别编码具有SEQ ID NO: 4、 SEQIDNO:8所示的氨基酸多肽序列。这些籼稻和粳稻品种可以 从中国的育种机构(如中国水稻研究所种质资源库)或种子商品巿场 获得。5^M编码l个新的蛋白，其C端与酵母的Mms21蛋白即类泛 素E3连接酶有部分同源。与S^W"的基因组序列相比，SaM在第5 内含子的3'剪切位点即分子标记M74.6的位置存在1个单核苷酸的 变异即"G"改变为"T"。此变异导致SaM丢失了第6个外显子(80 bp ) 以及移码产生新的终止密码，使其编码的蛋白的C端截断了 40个氨 基酸(图2、图3)。 &尸编码1个功能未知的F-box蛋白，feF"和&F 之间存在由编码区的860位即分子标记M68.9的1个单核苷酸多态产 生的1个氨基酸差异，即在蛋白序列287位处SaF+是苯丙氨酸氨， SaF—变为丝氨酸(图2、图3)。
实施例3:遗传转化鉴定目标基因的功能
将实施例2所述的&W、 ^M、以及&F",它们包括启动子区、 编码区、以及下游序列，克隆到双元转化载体pCAMBIA1300 (澳大 利亚CAMBIA公司)。获得的载体转基因分别命名为tSa71/、 t5aM、和tSa^。用电激法将这些载体导入土壤根癌农杆菌(jgra^cfen'wm ^we/ac/my)菌株EHA105，以根癌农杆菌介导法(Hiei等，Plant J. 6: 271-282 )转化适合基因型的水稻。将tSbM转化含有基因型为 ^71//SflMV/SoFV5Wi^的E4,获得的4株T。代转化体表现为花粉半 不育(图4A)。将tS"7kT转化由65与E4杂交产生的杂种后代中分离 出的含有基因型为&^/7^7^7/&7^/5^尸的花粉全可育重组体，获得 的8株To代转化体表现为花粉全不育即不育花粉率达到或接近100 % (图4B)。这是因为这种转化体有纯合的5bTW75^M，其产生的全 部携带&zM的花粉不育。将& 矿转化由65与E4杂交产生的杂种后 代中分离出的含有基因型为^TW7&M〃&FASaF的花粉全可育重组 体，获得的4株T。代转化体表现为花粉半不育(图4C)。
本实施例验证了各个等位基因的生物学功能，并证明Sa^、 SaM、以及^i^这3个等位基因具备时使含有S"M的花粉产生不育； 缺少其中的任何一个等位基因时不产生杂种不育。
实施例4: 5^Af和StfF的表达蛋白的互作
用引物对5，-TCAGAATTCGAACTCCCGACTCCTTCCTC-37 5, -TGACTCGAGTCAGTGGCAGTACTTTATGTC-3 ，,和5, -TCAGAAT TCGAACTCCCGACTCCTTCCTC-3 7 5 ，-TGACTCGAGCAAATACC AGGTCGTTTGACAC-3，，将&71^和5"aM的编码区序列PCR扩增； 用引物对 5，-CCACCGGGATCCCATGGAGGAGG TCATCG-3V 5'-AGAACACTCGAGAGG GAATAATCTAAAGGATCATC-3，将&r 和&F的编码区序列PCR扩增，克隆到细菌双杂交系统BacterioMatch two-hybrid system试剂盒(美国Stratagene公司)的载体，按照试剂盒 说明的实验条件和步骤进行了蛋白互作实验。结果表明，SaF+和SaF 蛋白能够与SaM—互作，但不能与SaM+互作(图5),表明SaM+的C 端存在抑制该蛋白与SaF互作的氨基酸序列。
实施例5:抑制SflM和SflF的表达产生杂种亲和性
13用引物对5'隱CCCTGCAAGCTTCGCCCGCCCCGGCCGTCC-3，/ 5 ， -TTGGAACGGATCCATTCCATGTACAGAATA-3'和5 ， -CCACCG GGATCCCATGGAGGAGGTCATCG-3 ，/ 5 ，-CCGAAGCTTGGGAATA ATCTAAAGGATCATC-3，分别扩增^M和&尸的cDNA片段，按公 开的方法克隆到RNA干扰载体(胡旭霞、刘耀光2006，分子植物育 种4: 621-626 )。用电激法将这些载体导入土壤根癌农杆菌 (Jgra6acfeWwm fwwey^c/e似)菌株EHA105， 以根癌农杆菌介导法 (Hiei等,Plant J. 6: 271-282)转化粳稻品种T65，获得转化体。 将转化体与E4杂交，获得杂种F,。利用引物对 5 ，-GTCCCTGCCCATTTCGCCCT-3 7
5 ， -GCCCAACGCTGACAGTGCTCA-3'和5 ， -CCGCTGTGTTCTCCTG CTCA-3V 5，-GGGGATAAGTGTCTTGAAGCTTA-3，，按照反转录酶 试剂盒Superscript III kit (美国Invitrogen公司)说明的条件分别对这 些杂种的SaM和6"(xF进行反转录PCR检测。PCR反应利用Ex Taq DNAPolymerase Kit (大连Takara公司)进行28个循环(94°C 30s， 65°C lmin, 72°C 2min)。结果证实，SaM和的表达受到抑制(图 6)。观察这些杂种的花粉育性，表现为全可育(图7)。因此，利用 本发明的方法，可以创建S"M或SaF的表达受抑制的水稻杂种亲和 系，用于产生可育的杂种。
实施例6:利用&F和5ViM的分子标记鉴定水稻的基因型
利用本发明提供的序列信息可以产生和等位基因特异 的分子标记，用于鉴定水稻和野生稻^座位的基因型，可在分子标 记辅助选择育种过程中加以应用。例如，本实施例利用表l所示的标 记M68.9和M74.6，鉴定了多个粳稻和籼稻的基因型。结果发现，所 有检测的粳稻品种具有&^7&^〃^^/5("^基因型，大部分籼稻品种 有SaW/SaMV/Sai^ASfli^基因型，约 10 %的籼稻品种有 ^MVSaAiV/SaFASbF基因型(表2),这些品种均表现为花粉全可育。由于&^7&^7/&^/5^^基因型的籼稻品种与粳稻品种杂交的杂种 在该座位缺少等位基因^lF",因此不产生花粉不育性。它与
^MV^TkrV/s^FV^i^^因型的籼稻品种的杂种在该座位缺少等位基
因^^M,因此也不产生花粉不育性。因此该基因型为亲和型等位基
因座，即sw。含有此等位基因的品种为&亲和品种。用这些品种为 亲和基因供体，与其品种杂交和回交，可培育新的杂种亲和品种。
表2.用分子标记M68.9和M74.6鉴定籼稻和粳稻品种的基因型
水稻亚种基因型品种(系)数
(9. s"riv" ssp, zWZca96
9
108序列表
<110> 华南农业大学
<120>水稻杂种花粉育性基因及其应用
<130>
<160> 8
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 5700
<212> DNA
<213>稻属水稻品系E4
<220>
<221> CDS
<222> (1292)..(1556)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1641)..(1712)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (2625)..(2720)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (2814)..(2888)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (2971)..(3084)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (3411)..(3夠
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (4639)..(4715)
<400> 1
gtggaggaag tcccaacaaa atttagagac agcataaaac agctgtaatt ccattcgagc 60 caatatatct tttttccttc ttcttccaga tgttaactgg ttactataga atttgttcaa 120 ttagatggaa aagac幼tct gatttagcga acaataatgt tgtggtcgta attaagcaca 180 tcagttttgg gctaccagaa ctggtgtcac ttggtaaggc ctttcgaata taagttattt 240 ttctcttttt tttaatcaac tattaagttg ttctggcaaa aatctttgta aattctaaac 300 aaggcttggt tacccaacat tttgatatgt gcttggtcca tctxcaatgc agcttgtaca 360
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taaatagacttaaatgttggtgtccataaatgttaaggttagtgattttc480
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<210> 2 <211> 257 <212〉 PRT
〈213〉稻属水稻品系E4 <400> 2
Pro Pro Arg Pro
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Ala
Leu
Pro
Ser
65
Gin
Arg
Arg
Ala
Val 145 Leu
Asn
Ser
Cys
Ser 225 Asp
His
<210> 3 〈211〉 5640 <212> DNA
Ala
Thr
lie
Arg
50
Asp
Pro
Asp
Lys
lie 130 Lys
Gin
His
Gly
Gly 210 Leu
Leu
Arg Ser
20 Gly Glu 35
Pro Ala
Thr Val
His His
Val Ala 100 lie Val 115
Arg Ala
Pro His
Phe Lys
Glu lie 180 Thr Glu 195
His lie Lys Gly Val Phe
5
Arg
Val
Gly
Ala
Leu
85
Phe
Asn
Pro
Leu
Ala 165 Ala
lie
Phe
Cys
Glu 245
Gly
Arg
Val
Pro
70
Gly
Gin
Val
Glu
Leu 150 Ala
lie
Ala
Asp
Pro 230 Asp
Ala
Arg
Arg
Leu
55
Ser
Lys
Phe
Ala
Ala 135 Lys
Leu
Ser
Glu
Arg 215 Val
Ala
Ser
Pro
Ceu
40
Asp
Pro
Arg
lie
His 120 Phe
lie
Glu
Leu
Leu 200 Gin
lie
Glu
Pro
Tyr
25
Arg
Leu
Pro
Leu
Lys 105 Asp
Lys
Asp
Arg
Asp 185 Thr
His
Gly
Leu
Gin
10
Glu
Arg
Asp
Ser
Glu
90
lie
lie
Leu
His
Glu 170
Cys
Gin
lie
Cys
Arg 250
Ser
Gly
Ala
Gin
Pro
75
Asp
Gly
Val
Val
Asp 155 Gin
Tyr
Pro
Met
Pro 235 His
Leu
Trp
Ala
Gly
60
Cys
Val
Arg
Val
Ala 140 Asp
Gin
Thr
Leu
Asn 220 Gly
Asp
Pro
Thr
Ser
45
Asp
Glu
Leu
Gin
Asn 125 Ala
Asn
Val
Asn
Arg 205 Tyr
Ala
lie
Pro
Leu
30
Ser
Ala
Ser
lie
Asp 110 Phe
Ala
Leu
His
Cys 190 Ser
Met
Val
Lys
Val
15
Lys
Ala
Arg
Gin
Ser
95
Glu
Cys
Glu
Leu
Asn 175 Pro
Met
Gly
Ser
Tyr 255
Ala
Glu
Pro
Ala
Glu
80
Leu
Val
Asn
Asn
Phe 160 Val
Leu
Thr
Ser
Asn 240 Cys
19<formula>formula see original document page 20</formula>tcgttgtaaagatggatgagggU卿gct卿ggttgattagtaagtactagtaatact1140
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ac卿gfLgggagggggtagtataatgccgccattatttat3900
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tat taaaaaa￡Ltattcta_gtaaggccattttgtgc犯aatcagttgcata4440
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<210〉 4 <211> 257 〈212〉 PRT
<213〉 稻属水稻品系T65 <400〉 4
Met Ala Pro Pro Arg Pro Ala Ser Pro Gin Ser Leu Pro Pro Val Ala
15 10 15
Ala Thr Arg Ser Arg Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Trp Thr Leu Lys Glu
20 25 30
Leu lie Gly Glu Val Arg Arg Leu Arg Arg Ala Ala Ser Ser Ala Pro 35 40 45
22Pro Arg Pro Ala Gly Val Leu Asp Leu Asp Gin Gly Asp Ala Arg Ala
50 55 60
Ser Asp Thr Val Ala Pro Ser Pro Pro Ser Pro Cys Glu Ser Gin Glu 65 70 75 80
Gin Pro His His Leu Gly Lys Arg Leu Glu Asp Val Leu lie Ser Leu
85 90 95
Arg Asp Val Ala Phe Gin Phe lie Lys lie Gly Arg Gin Asp Glu Val
100 105 110
Arg Lys lie Val Asn Val Ala His Asp lie Val Val Asn Phe Cys Asn
115 120 125
Ala lie Arg Ala Pro Glu Ala Phe Lys Leu Val Ala Ala Ala Glu Asn
130 135 140
Val Lys Pro His Leu Leu Lys lie Asp His Asp Asp Asn Leu Leu Phe 145 150 155 160
Leu Gin Phe Lys Ala Ala Leu Glu Arg Glu Gin Gin Val His Asn Val
165 170 175
Asn His Glu lie Ala lie Ser Leu Asp Lys Tyr Thr Asn Cys Pro Leu
180 185 190
Ser Gly Thr Glu lie Ala Glu Leu Thr Gin Pro Leu Arg Arg Leu Ser
195 200 205
Trp Cys Cys Val Lys Arg Pro Gly lie 210 215
<210> 5 〈211〉 3540 <212> DNA
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〈221〉 CDS
〈222〉 (1178). . (2092)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (2182), . (2325)
<223>
<220>
<221> CDS
<222〉 (2542).. (2913)
〈223〉
〈400〉 5
aggcgcgggt gaagcaaact agaccttttt tctgggccaa aaagggccca agctgaggag 60 aggattttta ttacttttcc aattaaccaa tgaaatgaac tacttccaat gctcacataa 120 tttcatgaaa aaaatcctga aaatacttgg acactta犯g tatttaacaa aattaaaatc 180 agatcattta atgattaatt tattatttaa atattattaa aatgttcttt tattattaaa 240
23gagctctgaaaaaattccactaattatgga300
gagtttaataaaaat taaa tccaaccatgctttatatttagaaaattttatttcccacat360
ttaacttcacttgtaaattaataaatgtttaatataaattctaagaataa420
aatt tataaatcctgaaacg肌aatcatgatgtg8C^tggtttctgccagtgctcctag480
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catgggatgccatggtgtcctggaaaccttgagtttctcaaattcatcgtggaaggggca2700
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<210> 6 <211> 476 <212> PRT
〈213〉稻属水稻品系E4 <400〉 6
Met Glu Ala Val lie 1 5 Gly Pro Phe Leu Ser
lie Ser Gly 35
Pro Val Arg 50
Ser Leu Trp 65
His Arg Arg
Val Ser Ala
Val Gly Cys 115
Trp Leu Arg
130 Gly Ala Pro 145
Cys Ser Ser
Asp Leu lie
lie Cys Asn 195
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Leu 20 Leu
Asp
Ser
Asp
Val 100 Cys
Ala
Trp
Leu
Pro 180 Ala
Ala
Pro
Ala
Ser
Gly
85
Leu
Leu
Leu
Ser
Arg 165 Asp
Leu
Leu
Ala
Ala
Asp
Val
Val
70
Thr
Ala
Ser
Ala
Pro 150 Arg
His
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Glu
Glu
Val
Asp
Ala
55
Pro
Arg
Ala
Ser
Ala 135 Arg
Leu
Ala
Lys
Thr
Cys
Gly
!Leu
40
Thr
Leu
Leu
His
Asp 120 Lys
Ala
Phe
Cys
Ser 200 Val
Arg
Gly
25
Leu
Ser
Arg
Gly
Pro 105 Asp
Gly
Ala
Leu
Phe 185 Gin
Glu
Pro
10
Gly
Phe
Ala
Leu
Arg
90
Gly
Gin
Val
Leu
Gly 170 Pro
Asp
lie
Lys
Gly
Val
Leu
Asp
75
Glu
Pro
Gly
Arg
Pro 155 Ser
Glu
Leu
Leu
Pro
Gly
lie
Ser
60
Asp
Gly
Val
Tyr
Gin 140 Ser
Val
Ceu
Ser
Ala
Leu
Gly
Leu
45
Pro
Ala
Val
Pro
Gin 125 Leu
Ala
Gin
Arg
Leu 205 Ser
Phe Thr 15
Val Asp 30
Ser Lys
Arg Trp
Gly Leu
Ala Ala
95 Ala Ala 110
Leu Gly
Cys Leu
Val Phe
Cys Asn 175 Glu lie 190
Val Leu Arg Asn
Thr
Arg
Leu
Cys
Leu
80
Thr
Ser
Gly
Met
Ser 160 Trp
Gin
Ala
Lyslie 225 Trp
Ser
Asn
Tyr
Lys 305 Val
Ser
Thr
Gly
Val 385 Phe
Pro
Leu
Glu
Asp 465
210 Pro
Lys
Arg
Ser
Leu 290 Val
Leu
lie
Ser
Lys 370 Phe
lie
Lys
Ala
Val 450 His
Thr
Ser
Val
Lys 275 Asp
Asn
Gly
Ser
Lys 355 Val
His
Val
Gly
Pro 435 Val
Ser
Val
Val
Val 260 Val
Thr
Thr
Leu
Phe 340 Thr
Asp
Gly
Glu
Thr 420 Leu
Gin
Val
Arg
Ala 245 Leu
Thr
Gly
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Ser 325 Leu
Asp
Pro
Met
Gly 405 Tyr
Thr
Ser
Asp
Met 230 Lys
Trp
lie
lie
lie 310 Val
Arg
Lys
Val
Pro 390 Ala
Thr
Ser
Ser
Asp 470
215 Ser
Glu
Gin
Ser
Asn 295 Ser
His
Cys
Ala
Glu 375 Trp
Tyr
Ser
Ala
Gin 455 Pro
Ser
Val
Asp
Arg 280 Thr
Phe
Phe
Phe
Ser 360 Cys
Cys
Leu
Met
Ser 440 Gly
Leu
His
Asn
Leu 265 Ala
leu
Lys
Gly
Pro 345 Glu
Val
Pro
Leu
His 425 Trp
Thr
Asp
Thr
Val 250 Leu
Thr
Val
Thr
Val 330 Glu
Ala
Thr
Gly
Glu 410 Ser
Ala
Leu
Tyr
lie 235 Leu
Leu
Lys
lie
Leu 315 Arg
Val
Glu
Ser
Asn 395 Lys
Val
Ser
Ser
Ser 475
220 Arg
Asp
Pro
Met
Asn 300 lie
Lys
Glu
Gin
His 380 Leu
Val
lie
His
Tyr 460 Leu
Asn
Thr
His
Arg 285 Glu
Pro
Glu
Thr
Phe 365 Leu
Glu
Leu
Thr
lie 445 Gin
Thr
Pro
Ser 270 lie
Thr
Ser
Ala
Leu 350 Ser
Lys
Phe
lie
Lys 430 Cys
Leu Leu 240 Cys Leu 255
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Thr Val
Val Lys 320 Leu Met 335
His lie
Phe Trp
Lys Leu
Leu Lys 400 Val Leu 415
Leu Lys
Lys Met Arg Ala Ser
〈210〉 7
<211〉 3540
<212> DNA
<213> 稻属水稻品系T65 〈220〉
<221> CDS
〈222〉 (1161). . (2075)
<223>
<220〉
<221> CDS
26<222〉 (2162).. (2305)
〈223〉
<220>
<221> CDS
<222〉 (2522). . (2993)
<223〉
〈400〉 7
哪cgcgggtg犯gc犯actagaccttttttctgggcc犯aaagggcccaagctgaggag60
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gcaactgggacctcataccagaccatgcctgcttccctgagctacg卿gatccagatat1740
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tggagattcttgcgagccgtaaca犯atcccc3ccgtgcg组gagtagccata1860
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gattgttcttcctaaaggaacttacactagcatgcatsgcgttatcaccaaactcaagtt2760
agcacctttgacctctgcaagttgggctagtcacatctgt肌肌tggaggttgtccaatc2820
cagtx肌ggaactttgagctaccaaagggc3tCtg3tC已ttccgtcgatgatccttt￡Lga2880
ttattccctgtaggctgttctatctgtttgttgtga_ttataacatattgtcgatatggtt2940
atcctttaggtccttcatgtctgtatgccattttcatgtgttttggcttgttatctagag3000
aaaaatgtatggtttgttggatatgcttagtactatacttgatggggtgcaagtaatoga3060
atgcagagcatxcgatgtgtcagtagttcctctccattacttcttgtggcaagacsgcaa3120
gatactctactctcgattttgttgcctctgcttctgtttcttgtggattaattcatcatg3180
cgtcatattgggcggcatcggtctctcatgtctgagaatt3240
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caggtgtgaccaggtattaatgtaactattgtetgaatgagacattagat3420
tggctatagatg組tggagctagtagttggctatactattaaacttgcgagcaacagat3480
gtggagg,tcccaacaaaatttagagacagctgt33ttccattcgagc3540
<210〉 8 <211〉 476 <212> PRT
<213>稻属水稻品系T65 <400> 8
Met Glu Ala Val lie Ala Glu Cys Arg Pro Lys Pro Leu Phe Thr Thr
15 10 15
Gly Pro Phe Leu Ser Ala Val Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Arg
20 25 30
lie Ser Gly Leu Pro Asp Asp Leu Leu Phe Val lie Leu Ser Lys Leu
35 40 45
Pro Val Arg Asp Ala Val Ala Thr Ser Ala Leu Ser Pro Arg Trp Lys
50 55 60
Ser Leu Trp Ser Ser Val Pro Leu Arg Leu Asp Asp Ala Gly Leu Leu 65 70 75 80
His Arg Arg Asp Gly Thr Arg Leu Gly Arg Glu Gly Val Ala Ala Thr
85 90 95
Val Ser Ala Val Leu Ala Ala His Pro Gly Pro Val Pro Ala Ala Ser
100 105 110
Val Gly Cys Cys Leu Ser Ser Asp Asp Gin Gly Tyr Gin Leu Gly Gly 115 120 125
28Trp Leu 130 Gly Ala 145
Cys Ser
Asp Leu
lie Cys
Val Cys 210 lie Pro 225
Trp Lys
Ser Arg
Asn Ser
Tyr Leu 290 Lys Val 305
Val Leu
Ser lie
Thr Ser
Gly Lys 370 Val Phe 385
Phe lie
Pro Lys
Leu Ala
Glu Val 450 Asp His 465
Arg
Pro
Ser
lie
Asn 195 Pro
Thr
Ser
Val
Lys 275 Asp
Asn
Gly
Ser
Lys 355 Val
His
Val
Gly
Pro 435 Val
Ser
Ala
Trp
Leu
Pro 180
Ala
Ala
Val
Val
Val 260 Val
Thr
Thr
Leu
Phe 340 Thr
Asp
Gly
Glu
Thr 420 Leu
Gin
Val
Leu
Ser
Arg 165 Asp
Leu
Leu
Arg
Ala 245 Leu
Thr
Gly
Asn
Ser 325 Leu
Asp
Pro
Met
Gly 405 Tyr
Thr
Ser
Asp
Ala
Pro 150 Arg
His
Met
Glu
Met 230 Lys
Trp
lie
lie
lie 310 Val
Arg
Lys
Val
Pro 390 Ala
Thr
Ser
Ser
Asp 470
Ala 135 Arg
Leu
Ala
Lys
Thr 215 Ser
Glu
Gin
Ser
Asn 295 Ser
His
Cys
Ala
Glu 375 Trp
Tyr
Ser
Ala
Gin 455 Pro
Lys
Ala
Phe
Cys
Ser 200 Val
Ser
Val
Asp
Arg 280 Thr
Phe
Phe
Phe
Ser 360 Cys
Cys
Leu
Met
Ser 440 Gly
Leu
Gly
Ala
Leu
Phe 185 Gin
Glu
His
Asn
Leu 265 Ala
Leu
Lys
Gly
Pro 345 Glu
Val
Pro
Leu
His 425 Trp
Thr
Asp
Val
Leu
Gly 170 Pro
Asp
lie
Thr
Val 250 Leu
Thr
Val
Thr
Val 330 Glu
Ala
Thr
Gly
Glu 410 Ser
Ala
Leu
Tyr
Arg
Pro 155 Ser
Glu
Leu
Leu
lie 235 Leu
Leu
Lys
lie
Leu 315 Arg
Val
Glu
Ser
Asn 395 Lys
Val
Ser
Ser
Ser 475
Gin 140 Ser
Val
Leu
Ser
Ala 220 Arg
Asp
Pro
Met
Asn 300 lie
Lys
Glu
Gin
His 380 Leu
Val
lie
His
Tyr 460 Leu
Leu
Ala
Gin
Arg
Leu 205 Ser
Asn
Thr
His
Arg 285 Glu
Pro
Glu
Thr
Phe 365 Leu
Glu
Leu
Thr
lie 445 Gin
Cys Leu Met Val Cys
Glu 190 Val
Arg
Thr
Pro
Ser 270 lie
Thr
Ser
Ala
Leu 350 Ser
Lys
Phe
lie
Lys 430 Cys
Arg
Phe Ser 160 Asn Trp 175
lie Gin
Leu Ala
Asn Lys
Leu L>eu 240 Cys Leu 255
Arg Tyr
Ser Gly
Thr Val
Val Lys 320 Leu Met 335
His lie
Phe Trp
Lys Leu
Leu Lys 400 Val Leu 415
Leu Lys Lys Met Ala Ser
29
权利要求
1、水稻杂种花粉育性基因的等位基因SaM+、SaM-、SaF+和SaF-，其编码蛋白的序列为1)SEQ ID NO2或SEQ ID NO4或SEQ ID NO6或SEQ IDNO8或2)它们中替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2、 根据权利要求1所述的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1 或SEQIDNO:3或SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7，或它们中替换、 缺失和/或添加一个或几个核苷酸且编码权利要求1所述蛋白同等功 能的基因序列。
3、 含有权利要求1或2所述基因或其片段的表达载体。
4、 根据权利要求3所述的表达载体，其为含有权利要求1或2 所述基因或其片段的正义链或反义链或产生RNA干扰的核苷酸序列 的表达载体。
5、 由权利要求3或4所述载体转化的宿主细胞。
6、 —种培育水稻杂种育性亲和系的方法，其特征在于将权利 要求l或2所述基因或权利要求3或4所述载体转化水稻，获得转基 因水稻杂种育性亲和系；或用杂交-回交方法和分子标记选择培育含 有权利要求1或2所述基因的各种基因型组合的水稻杂种育性亲和 系。
7、 根据权利要求1或2的核苷酸序列产生的分子标记。
8、 权利要求7所述分子标记在水稻杂交育种中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及水稻杂种花粉育性基因座Sa的2个命名为SaM和SaF的基因的分离克隆和应用。细菌双杂交实验证明籼稻和粳稻的SaM和SaF的特定等位基因编码的蛋白发生特异的相互作用。遗传分析和转基因功能互补实验表明，在杂种中杂合的SaM和来源于籼稻的SaF即3个等位基因的相互作用产生杂种花粉不育，缺少它们中的任何一个或抑制其表达时产生杂种亲和性即花粉可育。本发明还涉及利用所述基因培育水稻杂种育性亲和系的方法和应用，以及鉴定水稻杂种育性基因型的分子标记及其应用。
文档编号C12N15/29GK101492682SQ20081013234
公开日2009年7月29日 申请日期2008年7月11日 优先权日2008年1月23日
发明者刘耀光, 庄楚雄, 牛白晓, 赵利锋, 龙云铭 申请人:华南农业大学