专利名称：大菱鲆红体病虹彩病毒灭活疫苗的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用鱼类细胞系生产大菱鲆红体病虹彩病毒灭活疫苗的技术工艺 ——大菱鲆红体病虹彩病毒灭活疫苗的生产工艺。
背景技术：
大菱鲆养殖业是我国北方海水养殖的支柱产业之一，但近年来大菱鲆传染性病毒 病的广泛传播，给大菱鲆养殖业造成了巨大的经济损失。如何预防和治疗大菱鲆病毒 病己成为当今世界上大菱鲆养殖业中急需解决的重要问题。学者们认为，利用灭活病 毒疫苗对大菱鲆进行预防免疫，是防治大菱鲆病毒病和提高大菱鲆养殖业经济效益的 重要途径。在哺乳类和鸟类动物中，已有利用细胞系大规模繁殖病毒和生产灭活病毒 疫苗的成功先例，但到目前为止，在海水鱼中还没见利用鱼类细胞系生产大菱鲆红体 病虹彩病毒灭活疫苗的报道。
大量的研究结果表明，只有建立病毒灭活疫苗的生产工艺，才能规模化生产病毒 疫苗，才能成功而有效地进行其病毒病的预防免疫。但至今还没检索到大菱鲆病毒灭 活疫苗成功生产的报道，特是大菱鲆的主要致病病毒——大菱鲆红体病虹彩病毒。 因此，建立一种利用鱼类细胞系生产大菱鲆红体病虹彩病毒灭活疫苗的技术工艺，是 规模化生产病毒灭活疫苗的必备技术，也是进行大菱鲆病毒病的预防免疫、提高大菱 鲆养殖业经济效益的核心技术之一。
发明内容
本发明的目的就是利用大菱鲆鳍细胞系繁殖病毒、进行病毒灭活，提供一种生产 大菱鲆红体病虹彩病毒灭活疫苗的生产工艺，以便规模化生产病毒灭活疫苗，并用于 养殖大菱鲆红体病的预防免疫。
首先取出患病毒性出血性白血症的病鱼的内脏100~200克，装入组织捣碎机玻璃 杯中，添加100~200毫升无血清市售MEM培养液，2000-3000转/分匀浆处理以破碎 细胞，所得匀浆物进行高速离心后收集含病毒的上清液，利用0.45微米的微孔滤膜过 滤除菌后，按每瓶接种5~8亳升病毒液的量直接接种至10~20个500毫升培养瓶中的 对数期大菱鲆鳍细胞系细胞中，将其置于温度为20 24'C培养箱中，使大菱鲆鳍细胞 系细胞吸附大菱鲆红体病虹彩病毒1~2小时后，再加入含5%~15%小牛血清、pH7.0 的MEM培养液至20~25毫升，又置于20 24'C培养箱中培养，于接种病毒后的第3~5 天，无菌条件下用滴管吹打下每个培养瓶中的培养细胞，将培养细胞悬液收集于500 毫升无菌玻璃瓶中，置于-30'C冰柜中冷冻过夜，再取出冷冻玻璃瓶于水池中流水冲化， 待冰块刚好完全溶解时，分装入50毫升离心管中，用离心机12000转/分离心60~90 分钟，收集离心上清液，即得到大菱鲆红体病虹彩病毒液；再按上述方法每瓶接种5~8 毫升继续扩增病毒，直至获得需要的病毒量。最后，利用终浓度为0.1~0.5%的福尔马 林溶液对该病毒原液于35 4(TC灭活处理36~60小时，获得灭活病毒疫苗原液，置4 'C保存备用。在使用时将灭活病毒疫苗原液进行10 20倍稀释，并加入终浓度为3 5 克/升的氢氧化铝佐剂制成灭活病毒疫苗使用液。
由此构筑的本发明的生产工艺简便、稳定性好，所得灭活病毒疫苗量多、免疫原 性好，适合规模化生产，可直接用于大菱鲆的预防免疫，提高养殖大菱鲆的存活率和 养殖效益，实用性强。
具体实施例方式
将上述本发明的方法按照细致步骤进行详述如下
1、 大菱鲆红体病虹彩病毒的分离制备方式将大菱鲆养殖场采集到的患病毒性出
血性白血症的病鱼5尾，用解剖剪剪下病鱼内脏(肝脏、脾、胃或肠组织)100~200 克左右，装入组织捣碎机玻璃杯中，添加100~200亳升无血清市售MEM培养液， 2000~3000转/分匀浆处理以破碎细胞，待匀浆物成均匀糊状后，收集匀浆物装入50 毫升离心管中，于10000~15000转/分离心60~卯分钟，收集离心上清液，于无菌室中 用0.45微米的微孔滤器进行过滤除菌后，用于细胞接种。
2、 病毒扩增用大菱鲆鳍细胞的培养方式取10~20瓶500毫升长满单层的大菱鲆 鳍细胞系细胞，去除原有培养液，每瓶加入3~5亳升0.25%胰蛋白酶消化1~2分钟后， 迅速加入20~25毫升新配制的含10~20%小牛血清的MEM培养液(pH7.0)，用滴管吹 下培养瓶底部的细胞，上述所得的10 20瓶细胞悬液平均接种于20~40个500毫升培 养瓶中，利用20~25毫升含10~20%小牛血清的MEM培养液(pH7.0) 20 24。C进行扩 增培养，待细胞长至对数期时用于以下的病毒扩增。
3、 病毒的扩增方式在无菌室超净台中分别取出5-8毫升上述所得大菱鲆红体病 虹彩病毒液，分别接种于培养有对数期大菱鲆鳍细胞的10 20个500毫升培养瓶中， 放入20 24'C培养箱中吸附1~2小时，每瓶均加入含5%~15%小牛血清的MEM培养液
(pH7.0)至20 25毫升，置20 24'C培养箱中培养，扩增大菱鲆红体病虹彩病毒。
4、 病毒的收获方式连续培养3 5天后，在无菌超净台中用滴管将培养瓶中细胞 从瓶底尽数吹下，装入500毫升消毒玻璃瓶中，置-3(TC冰柜中冷冻过夜，从冰柜中取 出玻璃瓶放入水池中用流水冲洗，使冰冻物融化，待冰块刚好完全溶解时，分装入50 毫升离心管中，以12000转/分离心60~90分钟，收集离心所得上清液，即为扩增病毒 液，用于以下病毒灭活。
5、 病毒的灭活方式取虹彩病毒原液450毫升，加入37%福尔马林溶液1.2~6毫 升，使其终浓度为0.1%~0.5%，混匀后在35 4(TC灭活处理36~60小时，即得灭活病 毒疫苗原液，分装入100毫升血清瓶中置4'C冰箱保存备用。在使用时再行10 20倍 稀释，并加入终浓度为3~5克/升的氢氧化铝佐剂，制成灭活病毒疫苗使用液，直接用 于养殖大菱鲆的浸泡免疫。
实施例1
将大菱鲆养殖场采集到的患病毒性出血性白血症的病鱼5尾，用解剖剪剪下病鱼 内脏的肝脏150克，装入组织捣碎机玻璃杯中，添加150毫升无血清市售MEM培养 液，3000转/分匀浆处理以破碎细胞，待匀浆物成均匀糊状后，收集匀浆物装入50毫 升离心管中，于12000转/分离心卯分钟，收集离心上清液，于无菌室中用0.45微米 的微孔滤器进行过滤除菌后备用；取10瓶500毫升长满单层的大菱鲆鳍细胞系细胞， 去除原有培养液，每瓶加入5毫升0.25%胰蛋白酶消化1.5分钟后，迅速加入23毫升 新配制的含15%小牛血清的MEM培养液(pH7.0)，用滴管吹下培养瓶底部的细胞， 将上述所得的10瓶细胞悬液平均接种于20个500毫升培养瓶中，利用23毫升含10% 小牛血清的MEM培养液(pH7.0)在22。C进行扩增培养，待细胞增长至对数期时，分 别取出7毫升上述所得大菱鲆红体病虹彩病毒液进行细胞接种，并放入22'C培养箱中 吸附2小时，每瓶均加入含10%小牛血清的MEM培养液(pH 7.0)至23毫升，置22'C 培养箱中培养4天后，在无菌超净台中用滴管将培养瓶中细胞从瓶底尽数吹下，装入 500毫升消毒玻璃瓶中，置-30'C冰柜中冷冻过夜，再从冰柜中取出玻璃瓶放入水池中 用流水冲洗，使冰冻物融化，待冰块刚好完全溶解时，分装入50毫升离心管中，以 12000转/分离心90分钟，离心便收集到扩增的病毒液。再按上述方法每瓶接种5~8 亳升继续扩增病毒，直至获得需要的病毒量。于450毫升病毒液中加入37%福尔马林 溶液2.4毫升，使其终浓度为0.2%，混匀后在37'C灭活处理48小时，所得灭活病毒 疫苗原液在使用时进行10倍稀释，并加入终浓度为3克/升的氢氧化铝佐剂，制成灭 活病毒疫苗使用液，直接用于养殖大菱鲆的浸泡免疫。 实施例2
将大菱鲆养殖场采集到的患病毒性出血性白血症的病鱼5尾，用解剖剪剪下病鱼 内脏的脾150克，装入组织捣碎机玻璃杯中，添加150毫升无血清市售MEM培养液， 2000转/分匀浆处理以破碎细胞，待匀浆物成均匀糊状后，收集匀浆物装入50毫升离 心管中，于12000转/分离心60分钟，收集离心上清液，于无菌室中用0.45微米的微 孔滤器进行过滤除菌后备用。取10瓶500毫升长满单层的大菱鲆鳍细胞系细胞，去除 原有培养液，每瓶加入5毫升0.25。/。胰蛋白酶消化2分钟后，迅速加入23毫升新配制 的含15%小牛血清的MEM培养液(pH7.0)，用滴管吹下培养瓶底部的细胞，将上述 所得的IO瓶细胞悬液平均接种于20个500毫升培养瓶中，利用23毫升含10%小牛血 清的MEM培养液(pH7.0)在24'C进行扩增培养，待细胞增长至对数期时，分别取出 8毫升上述所得大菱鲆红体病虹彩病毒液进行细胞接种，并放入24。C培养箱中吸附1.5 小时，每瓶均加入含10%小牛血清的MEM培养液(pH7.0)至23毫升，置24。C培养 箱中培养5天后，在无菌超净台中用滴管将培养瓶中细胞从瓶底尽数吹下，装入500 毫升消毒玻璃瓶中，置-3(TC冰柜中冷冻过夜，并从冰柜中取出玻璃瓶放入水池中用流 水冲洗，使冰冻物融化，待冰块刚好完全溶解时，分装入50毫升离心管中，以15000
转/分离心60分钟，离心便收集到扩增的病毒液。再按上述方法每瓶接种5~8毫升继 续扩增病毒，直至获得需要的病毒量。于450毫升病毒液中加入37%福尔马林溶液3.6 毫升，使其终浓度为0.3%,混匀后在4(TC灭活处理36小时，所得灭活病毒疫苗原液 在使用时进行15倍稀释，并加入终浓度为4克/升的氢氧化铝佐剂，制成灭活病毒疫 苗使用液，直接用于养殖大菱鲆的浸泡免疫。
实施例3
将大菱鲆养殖场采集到的患病毒性出血性白血症的病鱼5尾，用解剖剪剪下病鱼 内脏的胃150克左右，装入组织捣碎机玻璃杯中，添加150毫升无血清市售MEM培 养液，2000转/分匀浆处理以破碎细胞，待匀浆物成均匀糊状后，收集匀浆物装入50 毫升离心管中，于12000转/分离心60分钟，收集离心上清液，于无菌室中用0.45微 米的微孔滤器进行过滤除菌后备用。取10瓶500毫升长满单层的大菱鲆鳍细胞系细胞， 去除原有培养液，每瓶加入4毫升0.25%胰蛋白酶消化2分钟后，迅速加入23毫升新 配制的含20%小牛血清的MEM培养液(pH7.0)，用滴管吹下培养瓶底部的细胞，将 上述所得的10瓶细胞悬液平均接种于20个500毫升培养瓶中，利用23毫升含20%小 牛血清的MEM培养液(pH7.0)在22'C进行扩增培养，待细胞增长至对数期时，分别 取出7毫升上述所得大菱鲆红体病虹彩病毒液进行细胞接种，并放入22t:培养箱中吸 附2小时，每瓶均加入含8%小牛血清的MEM培养液(pH 7.0)至23毫升，置22°C 培养箱中培养4天后，在无菌超净台中用滴管将培养瓶中细胞从瓶底尽数吹下，装入 500毫升消毒玻璃瓶中，置-3(TC冰柜中冷冻过夜，并从冰柜中取出玻璃瓶放入水池中 用流水冲洗，使冰冻物融化，待冰块刚好完全溶解时，分装入50毫升离心管中，以 12000转/分离心60分钟，离心便收集到扩增的病毒液。再按上述方法每瓶接种5~8 毫升继续扩增病毒，直至获得需要的病毒量。于450亳升病毒液中加入37%福尔马林 溶液1.2毫升，使其终浓度为0.1%，混匀后在35'C灭活处理60小时，所得灭活病毒 疫苗原液在使用时进行20倍稀释，并加入终浓度为5克/升的氢氧化铝佐剂，制成灭 活病毒疫苗使用液，直接用于养殖大菱鲆的浸泡免疫。
权利要求
1、一种大菱鲆红体病虹彩病毒灭活疫苗的生产工艺，首先取出患病毒性出血性白血症的病鱼的内脏100～200克，装入组织捣碎机玻璃杯中，添加100～200毫升无血清市售MEM培养液，2000～3000转/分匀浆处理以破碎细胞，所得匀浆物进行高速离心后收集含病毒的上清液，利用0.45微米的微孔滤膜过滤除菌后，按每瓶接种5～8毫升病毒液的量直接接种至10～20个500毫升培养瓶中的对数期大菱鲆鳍细胞系细胞中，将其置于温度为20～24℃培养箱中，使大菱鲆鳍细胞系细胞吸附大菱鲆红体病虹彩病毒1～2小时后，再加入含5％～15％小牛血清、pH7.0的MEM培养液至20～25毫升，又置于20～24℃培养箱中培养，于接种病毒后的第3～5天，无菌条件下用滴管吹打下每个培养瓶中的培养细胞，将培养细胞悬液收集于500毫升无菌玻璃瓶中，置于-30℃冰柜中冷冻过夜，再取出冷冻玻璃瓶于水池中流水冲化，待冰块刚好完全溶解时，分装入50毫升离心管中，用离心机12000转/分离心60～90分钟，收集离心上清液，即为大菱鲆红体病虹彩病毒液；再按上述方法每瓶接种5～8毫升继续扩增病毒，直至获得需要的病毒量；最后，利用福尔马林溶液对该病毒原液进行灭活处理，获得灭活病毒疫苗原液，置4℃保存备用；在使用时再进行稀释，并加入氢氧化铝佐剂制成灭活病毒疫苗使用液。
2、 如权利要求1所述的大菱鲆红体病虹彩病毒灭活疫苗的生产工艺， 其特征是上述大菱鲆红体病虹彩病毒的灭活处理是用终浓度为0.1~0.5% 的福尔马林溶液，于35 40'C灭活处理36~60小时。
3、 如权利要求1所述的大菱鲆红体病虹彩病毒灭活疫苗的生产工艺， 其特征是上述大菱鲆红体病虹彩病毒灭活疫苗的使用液是将灭活病毒疫苗 原液进行10 20倍稀释，并加入终浓度为3~5克/升的氢氧化铝佐剂配制而 成。
全文摘要
一种大菱鲆红体病虹彩病毒灭活疫苗的生产工艺，它是以大菱鲆鳍细胞为病毒的扩增体系，先从患病毒性红体病的病鱼内脏制备出虹彩病毒原液，将大菱鲆红体病虹彩病毒接种至对数期大菱鲆鳍细胞上，细胞于20～24℃吸附病毒后，加入含5％～15％小牛血清的MEM培养液20～24℃培养并收获培养物，经-30℃冻融1～2次后，离心收集上清液中的扩增病毒，所得足量的病毒液用终浓度为0.1％～0.5％的福尔马林溶液于35～40℃灭活处理36～60小时，即得灭活病毒疫苗原液。使用时进行10～20倍稀释，并加入终浓度为3～5克/升的氢氧化铝佐剂，制成灭活病毒疫苗使用液。本发明生产工艺简便、稳定性好，适合规模化生产，所得灭活病毒疫苗量多、免疫原性好，可直接用于大菱鲆的预防免疫，提高养殖大菱鲆的存活率和养殖效益。
文档编号C12N7/00GK101380469SQ200810157498
公开日2009年3月11日 申请日期2008年10月15日 优先权日2008年10月15日
发明者于苗苗, 姜国建, 樊廷俊, 王丽燕, 钱冠兰 申请人:中国海洋大学