专利名称：：基于issr分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库的方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于植物品种遗传资源数据库建立及应用，具体涉及一种基于ISSR分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库鉴定的方法以及数据库的应用。
背景技术：
：豇豆(VignaunguiculataL.Walp.)是一种重要的豆科植物，全球种植面积超过12500万公项，年产量超过300万吨。其中，长豇豆(V.sesquipedalis)是豇豆中经济性上最重要的一个亚种，可菜用、粒用，还可作动物祠料，因而被广泛种植于东南亚与中国。中国是长豇豆的次生起源中心，具有悠久栽培历史。中国地域辽阔、生态环境复杂，长豇豆在全国各地都有种植，因此形成了丰富的长豇豆地方品种。然而至今为止，没有人系统地对中国丰富的长豇豆品种资源从DNA分子标记的角度进行遗传关系分析，这给长虹豆品种资源鉴定、评价、保存与利用带来了相当大的困难。加之近年来长魟豆育种工作日见成效，新品种在全国各地都得到了推广而逐渐取代传统地方长豇豆品种，如果不及时对地方品种资源进行鉴定保存，这些宝贵的基因资源就会面临丢失的危险。特异性、一致性与稳定性(DUS)是植物新品种资源必须具备的特征。长期以来，品种资源鉴定一直采用形态性状为主，生理特性为辅的方法，这些特性是授予新品种权的依据，也是开展品种鉴定、解决品种争议的基础。但是，这种经典鉴定一般只在植物完成整个生长周期，甚至于收获后才能完成；同时很多性状属于数量性状，存在连续变异、易受环境影响的特点，不利于品种资源特性的明确描述；再者，同一物种，同一类型的品种资源数目巨大，且新品种数目逐年累加，鉴定机构仅根据形态性状、生理特性，实际上无法确定待审品种是否有别于其它品种。越来越多的研究表明，DNA分子标记的应用极大的推动了这些问题的解决。国际新品种保护联盟(UPOV)将DNA标记的DUS测试列入议事日程，中国也于1997年开始实施植物新品种保护。近年来，各种DNA分子标记被广泛应用于在虹豆属或种内种质资源亲缘关系分析，如SSR，RAPD,RFLP，AFLP、DAF、SAMPL和ISSR标记。进4亍属或种内的研究对于植物分类与进化具有重要意义；而进行亚种内栽培种的研究则对于种质资源的保存与有效利用，特别是对于育种工作的开展具有重要意义。然而国内外针对虹豆属中长虹豆亚种的遗传资源亲缘关系的研究还很少，且很不系统。Phansak等对全球范围内15个长豇豆品种在16个SSR标记位点上的多态性进行了分析，其中中国的长虹豆品种仅3个，由于品种数少，在全基因组范围内检测的位点数也仅有16个，因此其结果对长扛豆品种特别是中国长豇豆品种的代表性较差；陈禅友等对长豇豆品种资源做了形态学分析。目前还未见对整个中国长豇豆品种分子标记方面的才艮道。各种分子标记在豇豆资源鉴定中各有其自身优势与不足。SSR标记引物序列特异，多态性高且为共显性，在资源与种子纯度鉴定等方面应用最为广泛，然而目前在整个虹豆属中有差异的有效SSR标记仅20多个，由于长虹豆亚种内品种间亲缘关系更近，因而有效SSR标记更少，还远不能满足实际应用的需要。RAPD标记检测的位点多，引物通用，但普遍认为不够稳定，而且在豇豆中RAPD标记不能反应血缘关系，^皮认为不适合做豇豆亲缘关系分析。AFLP与SAMPL标记的多态性很高，能够有效区分普通豇豆(V.unguiculata)不同品种，然而酶切、扩增与PAGE检测程序复杂，费用高，在基础研究中应用较多而在品种纯度或资源鉴定等应用研究中应用较少。ISSR是由Zietkiewicz等提出的用于扩增两个SSR位点间序列的一种方法。其原理是同一ISSR引物序列同时与两个较近但方向相反的SSR重复序列互补结合而扩增这两个SSR位点间的序列。因此ISSR变异同时来源于SSR序列内与序列间的变异，具有很高的多态性，ISSR技术被认为比RFLP更便宜，比RAPD重复性更高。在豇豆中，ISSR技术被认为更适合于遗传多样性较低的栽培品种内的遗传分析。
发明内容本发明的目的在于提供一种基于ISSR分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库鉴定的方法，并"l是出中国长5工豆遗传资源数据库鉴定的应用。本发明的技术方案为基于ISSR分子标记构建中国长釭豆遗传资源数据库鉴定的方法，其包"fe以下步骤(1)收集中国长豇豆品种资源，田间形态鉴定品种种内单抹间的一致性与典型性，放弃分离与不典型的材料，对一致性与典型性品种的单株提取DNA;(2)利用高多态性的3个ISSR标记鉴定初选单抹间DNA水平的一致性，最终决选构建指紋图镨的品种与单林；(3)利用决选品种及单抹对中国长豇豆品种进行ISSR分析，建立指紋图谱数据库。所述田间形态鉴定品种种内单林间的一致性与典型性的方法是田间鉴定选用的性状指标包括叶型、叶色、花形、花色、开花期、荚长、鲜荚重、粒重；每一品种选10个单4朱;险测上述指标，利用方差同质性测验检测群体稳定性是否比对照品种早翠的性状指标差(a-50/。)，如果有两个指标都显示品种内单林间变异大于品种早翠的指标，则表示该品种不稳定，否则即为稳定的品种。所述利用决选品种及单林对中国长豇豆品种进行ISSR分析，建立指紋图谱数据库的方法是对决选长豇豆品种利用室内发芽，提取DNA，利用24对ISSR引物对它们进行PCR扩增，共扩增出192个位点，再采用"0-1"系统计带，将有带的赋值为1,无带的赋值为0;读取每个材料在不同引物扩增产物电泳谱带的数据，构建每一品种的指紋图谱数据库。本发明有效解决前人在遗传标记数据库构建中，库的代表性差的问题；也解决了已有标记技术在鉴定中国长豇豆遗传资源方面的不足，具有多态性高、重复性好、费用低、4会测程序简单和不受环境影响的优点。可快速、有效、准确地鉴定中国长豇豆遗传资源。本发明较为完整的收集了中国长豇豆栽培品种种质资源，以ISSR为起点，弥补了国内外对中国长豇豆分子标记研究甚少的不足，发明成果可用于中国长豇豆品种资源保存与筌定、遗传关系与品种纯度分析、分子标记辅助育种、新品种保护以及解决品种争议等方面，具有相当大的科学价值与应用价值。图1本发明数据库构建示意图。图2实施例品种鉴定分析图谱。具体实施例方式如图l所示，构建中国长虹豆遗传资源数据库1)对所收集67个的中国长豇豆品种资源，首先进^f亍了田间鉴定其是否具有品种典型特征，田间鉴定选用的性状指标包括叶型、叶色、花形、花色、开花期、荚长、鲜荚重、粒重等。每一品种选IO个单株检测上迷指标，利用方差同质性测验检测群体稳定性是否比对照品种早翠的性状指标差(a=5%)，如果有两个指标都显示品种内单林间变异大于早翠，则表示该品种不稳定，否则即为稳定的品种，从而保证了建立的指紋图谱可准确反应品种特性。这里67个的中国长豇豆品种为_ii￥i￥ii￥il^1压草豆2抗病,花3线豆角4揭上二号5桂林黑籽豆角6白iL豆7硬壳豇8南平白皮短豇豆9抹洲三尺红10常德青皮扛豆11长白豇豆12红荚白露13之虹1414杜豇15花皮豇豆16圈團豆17利川虹豆18矮虎195号豇豆20秋白豆21红鳝鱼骨22白皮盘香豆工34五月鲜35宝鸡地豆角36开封挑箭豇豆37银川地豇豆38象牙白39绿条ii豆40414243短杆豇豆44勾勾红45早翠46特长青条90147葛星90148之虽工1949美国地豆50特长青豇8051长青豇豆52香港粉豆53赤种三尺长虹豆54,755交黑白豆夬青豆^花爬黄黄白2324252627282930313233银雁水红豇豆一李豆白胖子矮紫尾青棒槌豇豆线虹紫魁躁虽工豆月月豆工大青条565758596061626364656667高产4号之豇28花豆角去湿赤小豆浅红秋白豆深红大白虹短红冬豆角开鲁线豆茶罗米一高产青虹豆2)从田间形态鉴定为稳定品种的群体中，任意选出3个单林，提取DNA，利用3个高多态性ISSR引物(编号为834,825，858)对这3个单抹利用ISSR标记扩增后鉴定品种内遗传稳定性，扩增的方法见(彭海，张静，张路帆.&陈禅友.2007.对长豇豆品种ISSR反应体系中4种关键成分的优化.北方园艺186-188)，每次实验重复3次，每一引物在每一品种中扩增出来的带型必须是一致的，如不一致，则视为不稳定的品种，从而从分子的水平上保证了品种内是稳定一致的，进一步增强了图谱的准确性。3)对最后决选的67个长豇豆品种利用室内发芽，提取DNA,利用24对ISSR引物对它们进行PCR扩增，扩增的方法见(彭海，张静，张路帆.&陈禅友.2007.对长豇豆品种ISSR反应体系中4种关键成分的优化.北方园艺186-188)。共扩增出192个位点，其中62个位点具有多态性，多态性比率为32.29%。采用"0-1"系统计带，将有带的赋值为l，无带的赋值为0;读取每个材料在不同引物扩增产物电泳谱带的数据。构建每一品种的指紋图谱，最后综合所有品种的指紋图谱，形成指紋图谱tt据库，品种间指紋的差异清楚明了，利用方1更。所述24对ISSR引物碱基组成及其编号是编号碱基组成，""碱基组成808AGAGAGAGAGAGAGAGC846GAGAGAGAGAGAGAGAA811GAGAGAGAGAGAGAGAC847CACACACACACACACARC812GAGAGAGAGAGAGAGAA855ACACACACACACACACYT817CACACACACACACACAA856ACACACACACACACACYA825ACACACACACACACACT857ACACACACACACACACYG826ACACACACACACACACC861ACCACCACCACCACCACC834AGAGAGAGAGAGAGAGYT868GAAGAAGAAGAAGAAGAA834AGAGAGAGAGAGAGAGYT880GGAGAGGAGAGGAGA835AGAGAGAGAGAGAGAGYC885朋BGAGAGAGAGAGAGA836AGAGAGAGAGAGAGAGYA888BDBCACACACACACACA840GAGAGAGAGAGAGAGAYT889DBDACACACACACACAC841GAGAGAGAGAGAGAGAYC891HVHTGTGTGTGTGTGTG842GAGAGAGAGAGAGAGAYG采用了田间鉴定和DNA分子标记鉴定相结合的方面对品种的代表性与遗传稳定性进行了筛选，使建立的数据库准确性大为提高。采用了24对ISSR引物，对67个中国长豇豆遗传资源进行了ISSR电泳图谱分析，分别获得了每一品种在24对引物下的指紋图谱，各个品种的指紋各不一样，可用于准确快速鉴定中国长豇豆种质资源。本发明中采用基于ISSR分子标记技术构建的数据库鉴定中国长豇豆遗传资源的方法，该方法^是供了一个长豇豆遗传资源ISSR数据库，此数据库具有以下优点田间鉴定和DNA分子标记鉴定相结合的方面对品种的代表性与遗传稳定性进行了筛选，利用该方法建立的数据库准确性大为提高。此数据库是基于ISSR分子标记技术构建的，具有明显优势。首先，与经典的形态遗传标记比较，其不受环境的影响，鉴定结果准确可靠；与蛋白质标记比较，可用标记位点多得多，理论上可鉴定任何两个品种，即使它们的差异很小；与其它分子标记比较，ISSR技术也具有明显优势。可用引物比SSR标记多得多，目前SSR标记在豇豆中仅20多对引物可用；比RAPD重复性更高；不需要PAGE检测，比AFLP与SAMPL检测程序简单；比RFLP更便宜。因此，从现有标记技术来看，本发明中采用ISSR分子标记技术鉴定中国长豇豆遗传资源是最优也是最适合的。本发明较为完整的收集了中国长虹豆栽培品种种质资源，以ISSR为起点，弥补了国内外对中国长虹豆分子标记研究甚少的不足，发明成果可用于中国长豇豆品种资源保存与鉴定、遗传关系与品种纯度分析、分子标记辅助育种、新品种保护以及解决品种争议等方面，具有相当大的科学价值与应用i"介值。将数据库用于种子鉴定假设A公司和B公司分别经营长豇豆品种"揭上二号"和"桂林黑籽豆角'，，由于"揭上二号"品种表现优良，因此市场上存在较多假种子，A公司怀疑B公司用"桂林黑籽豆角"假冒"揭上二号"进行销售，由此产生了品种权纠纷。为了解决此争议，传统的方法是将种子种于田间并观察，这样耗时费用，为了迅速解决此纠纷，分别从A和B公司销售产品中抽取样本，提取DNA。根据本专利所提供的数据库，这两个品种(如图2所示，编号分别为4和5)在引物834上的指紋分别是111101101101111和111101101101110，存在差异，可用于真伪鉴定，因此选用834引物对这两个品种DNA进行ISSR扩增与电泳分析。电泳带型如下图中方框所示，差异位置如箭头所示，有箭头所指的带型相应品种为"揭上二号"，否则为"桂林黑籽豆角"。整个鉴定过程可在一周内完成。构建的数据库如下表中国长豇豆ISSR分子标记数据库(第一部分:前34个品种)说明列标题为引物编号，其碱基组成见附件2;行标题35-67为品种编号，品种名称见附件L811811812出7817825腿鄉謡8:M柳UG(]000000C0000000000000000000oooooo000000000000000c000000000000<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>鹏8898989中国长豇豆ISSR分子标记数据库(第二部分:后33个品种)说明列标题为引物编号，其碱基组成见附件2;行标题35-67为品种编号'品种名称见附件l。80811111111L180811111111L181111111111]L181111111111]L18110100001]811000100(81111111111]L181111111111]L1811000001()18]111110000(81211111111]L1812丄丄111111]L181211111111]181211111111]181211111111]181211111111].181211111111]1812000000(81711111111〗181711111111〗18171110001]81711111111〗182511111111]82500000000]0082500000000()0082500000000()0082511111111]182511111111]L182500082511111111]L1825i1111111]L182611111111]L182611111111()182611111111]L182611111111]L182611111111]L182611111111-]L182611111111]L182611111111L182611111111111111111100011110001111111111111110011111111110100000011111110001111111111111111111111111111111100111111111111111111000011111101001011111111111111111111111111111100001111111111001111111101000000000011110011111111111011011111110011100111111101111100110000000000000000000000000000000111676665646361Lo85756555-45352515.o494-oo474544434241393837363582611]1l11111111]L111182611]1L1111〗iii:[111182611()1()1111]iii:L111183411]1L1111]iii-L110183411]1L1111〗iii:L111183411]1()1111]iiiL110183411]1L1111〗iiiL110183400〔)0000〔)001083411]i:L11111ill]L110183411]il11111ill:L111183400()0000〔)001083411]i:L111.11ill]L111183411〗i:L11111ill]L111183400()0001()000183411〗i:11111ill]L110183411]i][11111ill]L1111834111i]L11111ill]L110183400〔)0001()1001835111i]L11111ill]L111183511]i]L11111ill]L1111835111l]L11111ill]L111183501ci][11111)1010835111i]L11111ill]L1111835111l][11111ill]L111183511c[1100c)000083511〗i]L11111ill]L111]835111i]L11111ill]L111183511l][11111ill]L111183611]i:t11111ill:L111183611〗i:l11111ill:L111183611〗i:L11111iiiL111183611]l:L1111〗liiL111183611]iL1111]iiiL111183610()0011]L101183611]lL111I1iiil111183600()0000(〕000083611]iL1111〗iiiL111183611]it1111〗iiil111183611]lL1111]lliL111184011]iL1111〗ilit111184011]l1L1111]liil1111184011]1L1111]l1111111184011〕1L1111]l1011110184011]1L1111]l111111118400111111]L0]loooooo:L01]L1000]l01111118401111111]L1]l11]L1111]l11111118411111111〗L1]l111111，l11]L11111l11111118411111111]L1[iiiiii111][1111l11111118411111111].1]liiiiiiL11]L1111]l11111118411111111]l1]L111111，l11]L1111]l11111118411111111]L1]l111111-111]l1111—l11111118411111111]L1][iiiiii:111][1111]l11111118421111111]一1]l1111111l11]L1111]l11111118461111111]—1]L111111]l11]1111]L11111118461111111]—1]L111111]l11]1111]l11111118471111111〗-1]L111111]l11]L1111]L11111118471111111]L1]L111111.111]l1111]L1111111847丄111111]1]L111111]L11]1111]l11111118551111111])111111]L01]1111]L11111118551111111]1].111111]l11j1111]L11111118551111111111111111]L11]1111].1i11111855111111111]111111]L11]1111]1111111855111111111]111111]l11]1111]L1111111855111111111]111111]11]1111]—1111111855111111111〗111111]11]1111]111111185511丄丄11111〗111111]L11]1111]—11111118551111111111111111].11]1111]1111111855110000>1〔)111111]L10]0111]1100011855110111111]000010]l11]1111]L1111111856111111111]111111]l11]1111]L1111111856111111111]111111]11]1111]1111111856111111111]111111]l11〗1111]L1111111856111111111〗111111][11]1111]L1111111856111111111]111111]l11〗1111]L1111111857000000857111111111〗111111][11]1111〗L1111111857111111111]111111]L11]1111]L11111118571111111〗1]L111111][11]L1111]l11111118571111111]1〗L111111]L11]L1111]L11111118571111111()1]000010]l11100118571111111〗1〕L111111-111]L1111[1111111857000000—1000()00010008571111111]1]L111111]l11].1111]l11111118571111111].1]l111111L11]L1111]L11111118571111111]L丄jl111111L11]liiii:L11111118571111111]1]l111111l11]liiii:L11111118571111111]L1][1111]1til]L1111-t11111118611111111].1][111111L11]liiii:L11111118611]L011111L10000L001101001111101118611]111111L11111L111111111111111118611]L111111t11111till111111111111118611J[111111L11111till111111111111118611]L111111L1111111111111111H111118681]L111111L111111111111111111111118681〕[1111111111111111111111111111118681]111111111111111011ii111111118681]L111i1丄L11111till1111ii111111118801]111111L1111111111111ii111111118801]111111—L11111L1111111ii111111118801]—111111L11111L1111111ii11111111卿1]111111L1111111111111ii1]■1111.118801]111111]L11111-L1111111ii111111118800(0000()00000(0100008801]110010()01111()111101111111100118801〗111111]L11111]L111111111111111118850()100010]L00000]L011010000110118851〗111111]^11〗11]L111111111111111118851]111111]L11111]L101101111111111118851〗111111]L11111]L11111111I111111118851〔)100000()00000]L01110000111111188511111111]L11111]L11111111111111111885i1111111111111]L1111111111111111188511111111〗11111]L1111111111111111188511111111〗11111]L1111111111111111188511111111〗.11111][1111111111111111188511111111〗11111]L111111111111111118851〗111111]t11111]L1111111111111111188511111111]11111]L111111111111111118851]111111L11111〕[1111111111111111188511111111]—11111]L1111111111111111188511111111]L11111]L111111111111111118851(>110000()01111()110111110010101118851]111111]L1111111111111111111111188511111111]L11111L111111111111111118851〗111111]L11111till111111111111118851]111111]L11111111111111111111111哪1]111111]L1111111111111111111111188811111111]L11111tilli111111111111188811111111]L111111111111111111111118881J111111]L111111111111111111111118880〗111111]L110011011101011101100118881]111111]L111111111101111111111118880000000000000000000]LOOOOOO00O00O8891111111111111111111][1111111111118891111111111111111111111111111111118891111111111111111111][111111111111,1111111111111111111][1111111111118891111111011100110011]L111111111111,1111111111丄丄丄丄11111]t1111111111118891111111111111111111]L1111111111118891111111111111111111]L1111111111118890111111111100110111()1011101100118891111111111111111111][111111111111舰1111111111111111111]L1111111111118911111111111]」1111111]L11111111111189111111111111111111111[1111111111118911111111111111111111]L1111111111118911111111111111111111]L1111111111118911111111111111111111]L111111111111891111111111111111111]L1111111111118911111111111111111111]1111111111118911111111111111111111].11111111111权利要求1、基于ISSR分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库的方法，其包括以下步骤(1)收集中国长豇豆品种资源，田间形态鉴定品种种内单株间的一致性与典型性，放弃分离与不典型的材料，对一致性与典型性品种的单株提取DNA；(2)利用高多态性的3个ISSR标记鉴定初选单株间DNA水平的一致性，最终决选构建指纹图谱的品种与单株；(3)利用决选品种及单株对中国长豇豆品种进行ISSR分析，建立指纹图谱数据库。2、如权利要求1所述基于ISSR分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库的方法，其特征在于田间形态鉴定品种种内单林间的一致性与典型性的方法是田间鉴定选用的性状指标包括叶型、叶色、花形、花色、开花期、荚长、鲜荚重、粒重；每一品种选10个单林检测上述指标，利用方差同质性测验;险测群体稳定性是否比对照品种早翠的性状指标差a=5%,如果有两个指标都显示品种内单株间变异大于品种早翠的指标，则表示该品种不稳定，否则即为稳定的品种。3、如权利要求1所述基于ISSR分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库的方法，其特征在于所述高多态性的3个ISSR标记是编号为834，825和858的ISSR引物。4、如权利要求1或3所述基于ISSR分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库的方法，其特征在于对于田间形态鉴定品种具有一致性与典型性的品种任意选出3个单抹，利用编号为834,825和858的3个高多态性ISSR引物对这3个单抹利用ISSR标记进行遗传一致性的鉴定，每次实验重复3次，每一引物在每一品种中扩增出来的带型必须是一致的。5、如权利要求1所述基于ISSR分子标记构建中国长i工豆遗传资源数据库的方法，其特征在于利用决选品种及单抹对中国长豇豆品种进行ISSR分析，建立指紋图谱数据库的方法是对决选长豇豆品种利用室内发芽，提取DNA,利用24对ISSR引物对它们进行PCR扩增，共扩增出192个位点，再采用"0-1"系统计带，将有带的赋值为1,无带的赋值为0;读取每个材料在不同引物扩增产物电泳谱带的数据，构建每一品种的指紋图谱数据库；所述24对ISSR引物碱基组成及其编号是<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>6如权利要求5所述基于ISSR分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库的方法，其特征在于决选品种为67个长豇豆品种是<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>7、如权利要求5或6所述基于ISSR分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库的方法，其特征在于对67个中国长豇豆遗传资源进行ISSR电泳图谱分析。8、一种基于ISSR分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库的用途，它是将该数据库用于中国长豇豆品种资源鉴定、评价、保存或育种中的一种或一种以上。全文摘要本发明公开了一种基于ISSR分子标记构建中国长豇豆遗传资源数据库的方法及其应用，并利用数据库进行品种真假鉴定，它通过田间形态鉴定品种种内单株间的一致性与典型性，放弃分离与不典型的材料，对一致性与典型性品种的单株提取DNA；再利用高多态性的3个ISSR标记鉴定初选单株间DNA水平的一致性，最终决选构建指纹图谱的品种与单株；利用决选品种及单株对中国长豇豆品种进行ISSR分析，建立指纹图谱数据库。克服了以往在遗传标记数据库构建中的不足，如品种内不同单株间形态上分离，DNA水平上不纯合等利用本方法所构建的中国长豇豆ISSR指纹图谱数据库可靠性和准确性都大为提高，可有效方便地鉴定和区分中国长豇豆栽培品种。文档编号C12Q1/68GK101436229SQ20081019736公开日2009年5月20日申请日期2008年10月23日优先权日2008年10月23日发明者静张,海彭,陈禅友申请人:江汉大学