专利名称：：来自多药运出蛋白缺损株的转化株以及使用该转化株的微生物转化方法
技术领域：
：本发明涉及在多药运出蛋白缺损的宿主中整合来自异种生物的基因而得到的转化抹、以及使用该转化抹进行的底物化合物的微生物转化方法。
背景技术：
：通常制备化合物的方法例如有化学合成法和酶促合成法。为了制备可作为很多药物原料的化合物，高效率地进行原料化合物的区域特异性或立体特异性修饰，这是不可缺少的。关于这些反应，已知酶促合成法较为优异。但是，以酶作为实际应用的催化剂在工业规模中使用时，必须考虑酶本身所具有的本质上的极限。即，酶的寿命短以及催化作用中必须有辅酶的问题。目前在使用酶的制备工艺设计中，如何延长酶的寿命、使酶活性持续的问题受到了较多关注。在酶促合成法中使用的大部分的酶在其催化作用中必须有辅酶，例如在氧化还原的酶促反应中，必须有NADH等吡啶核苷酸。这些辅酶通常价格昂贵，因此进行工业规模的酶促反应时辅酶的添加在成本上存在较大的问题。作为为了克服这些酶促反应的极限的解决对策，建立了使用微生物、特别是大肠杆菌的细胞作为酶促反应场所的战略。即，通过将大肠杆菌用酶的基因转化，可以使目标酶在细胞内大量表达。这意味着可以在细胞内连续生产酶，只要细胞存活就可以维持酶活性。并且，通过细胞内的各种代谢反应，可以再生酶促反应所必需的辅酶。将上述大肠杆菌的转化体在培养基中培养，使底物化合物与培养物接触，获得经修饰的该化合物，通过该"微生物转化，，可以尝试生产可作为各种药物原料的化学物质。特别是使用由细胞色素P-450基因转化的大肠杆菌对疏水性或两亲性的化合物进行微生物转化的氧化反应在药物制备中很重要。细胞色素P-450基因所编码的细胞色素P-450酶(以下简称为P-450酶)是还原型、结合有一氧化碳、在450nm附近显示索雷吸收带(索雷带)的一组含血红素的蛋白质的总称。P-450酶与很多动植物组织、霉菌、酵母的微粒体、一部分动物组织的线粒体的内膜结合，除此之外在某种细菌、霉菌中以可溶性的形式存在。P-450酶具有各种底物特异性。是可以以各种各样的有机化合物作为底物的、显示异常广泛的底物特异性的酶，不过也存在只与比较有限种类的有机化合物反应的底物特异性非常严格的酶。有时还显示对反应部位的立体特异性(stereo-specificity)或区域特异性(regio-specificity)也优异的选择性。已知P-450酶的具体功能是通过催化单加氧反应，在表达该P-450酶的细胞内参与生物体内异物(异生素)的氢氧化、环氧化、去烷基化、脱氮等各种反应。特别是来自微生物的P-450酶的一部分实际上已应用于有用化合物的工业生产。代表性的例子之一是放射菌链霉菌0Sr印to/^c&sc"a^o//h7w)的P-450酶，将作为底物的密实菌素(compactin)6々位进行氢氧化，作为产物生成高血脂的治疗药物普伐他汀(参照非专利文献1)。并且利用》文射菌自养#支i若卡氏菌(尸sewobwoc(3ni/aorwto/rap/n'ca)ATCC33795抹的P-450酶，使维生素D3的lcc位和25位进行氢氧化，生产活性型维生素D3的方法也已经得到实际应用。这些来自微生物的P-450酶与向其供给电子的电子传递系统(铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶)共轭才会催化其单加氧反应。使用上述来自微生物的细胞色素P-450酶的化合物的微生物转化可使用表达该酶的微生物的培养液或菌体来进行。也可以使用将编码来自微生物的P-450酶的基因导入到适合作为宿主的放射菌变青链霉菌(5^印to附yc^s/z'v/血ra)中、表达该酶活性的培养液。但是，由具有上述基因的放射菌进行的底物化合物的微生物转化，由于放射菌特有的性质，培养和底物化合物向目标产物的转化需要很长时间。为了有效增加酶的表达量还必须对诱导酶表达的条件进行研究。并且，有时转化所使用的放线菌中存在代谢或分解底物化合物或目标产物的反应体系，这引起副产物的生成或底物化合物和目标产物的减少等，成为目标产物的生产性能降低的一个原因。基于这些理由，人们希望构建培养所需时间较短、并且以被认为代谢或分解底物化合物和目标产物的反应体系少的大肠杆菌作为宿主的、可功能性表达来自微生物的细胞色素P-450基因的体系。关于上述体系，有人提出了共表达编码P-450cam的电子传递系统的camAB基因、功能性表达各种放射菌的细胞色素P-450基因的系统(参照专利文献l)。但是，该系统的微生物转化活性非常低，应用于工业生产时并不足够。也就是说，为了通过使用大肠杆菌的微生物转化来实际进行工业生产，必须进一步提高活性，其中所述大肠杆菌表达编码来自微生物的细胞色素P-450酶的基因。作为上述目的的方法，还对于使底物主动地摄取到细胞内的方法进行了研究。例如已知表达lat基因的大肠杆菌具有将L-赖氨酸转化成L-2-哌啶酸的能力(参照非专利文献2)，其中，所述Iat基因编码来自泥色黄杆菌(F/m;o6a"eWwm/wtescera)IFO3084林的L國赖氨酸-6-氨基转移酶；在使用该转化体的微生物转化反应中，为了使底物的L-赖氨酸主动地摄取到细胞内，通过对编码L-赖氨酸特异性透过酶的lysP基因进行扩增，可以使该微生物转化活性提高(参照非专利文献3)。上述微生物转化中，显示底物分子向细胞内的膜转运是重要的问题，在用于药物制备的微生物转化中，对于常常作为底物化合物的亲水性或两亲性的化合物，大肠杆菌中并不存在使其主动地膜转运到细胞内的机制。有报道指出在破坏了大肠杆菌的药物运出蛋白的株中，所给予的化合物(哺乳类的甾类激素)在细胞内的存在量升高(参照非专利文献4)。这显示被动地摄入到细胞内的化合物难以运出到细胞外，由此细胞内的存在量升高。另一方面，有一个专利申请，其主要内容是由编码药物运出蛋白的acrA、acrB或tolG基因的至少一个基因转化的大肠杆菌对有机溶剂产生抗性，可以高效率实施使用该大肠杆菌的双层系统(二層系)的微生物转化(专利文献2)。由此很难推测破坏宿主微生物的多药耐药性蛋白对于微生物转化会产生什么样的影响。专利文献1:国际公开第2003/087381号小册子及其英文家族US2006234337A1专利文献2:日本申请公开平成11-221080(221080/1999Al)号公报非专利文献1:Cloning,characterizationanduxprcssionofthegeneencodingcytochromeP-450sca-2fromStreptomycescarbophilusinvolvedinproductionofpravastatin,aspec,HMC;-CoAreductaseinhibitor.Gene.1995S印22;163(1):81-85.非专利文献2:Biotransformationof'L—lysinetoL—pipecolicacidcatalyzedbyL—lysine6-aminotransfcraseandpyrrolinc-5-carboxylatereductase.BiosciBiotechnolBiochem.2002Mar邻(3):622-627.非专利文献3:IncreaseintherateofI--pipecolicacidproductionusinglat-expressingEscherichiacolibylysPandyeiEamplification.BiosciBiotechnolBiochem.2002S印;66(9):198卜1984.非专利文献4:MammaliansteroidhormonesaresubstratesforthemajorRND-andMFS-typetripartitemultidrugeffluxpumpsofEscherichiacoli.JBacteriol.2006Feb;188(3):119卜1195.6非专利文献5:EntryintoandreleaseofsolventsbyEscherichiacoliinanorganic-aqueoustwo-liquid-phasesystemandsubstratespecificityoftheAcrAB-TolCsolvent-extrudingpump.JBactcriol.2000S印;182(17):4803-10.非专利文献6:Productionof'a!pha,omega—alkanediolsusingEscherichiacoliexpressingacytochromeP450fromAcinetobactersp.OC4.BiosciBiotechnolBiochem.2006Jun;70(6):J379-1385.上述专利文献1和2、非专利文献1~6的全部记载在这里均以公开的形式援引到本说明中。本发明的课题在于提供改善在现有的使用整合来自异种生物的
发明内容本发明人等为解决上述课题，使用编码几种多药运出蛋白的基因中的任意一种的基因缺损的微生物作为宿主，向其中整合来自异种生物的基因，来制备转化体。发现该转化体可以高效率地将疏水性或两亲性的底物化合物转化成其目标化合物，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下的[1][9]。转化体，该转化体是向宿主微生物中整合来自异种生物的基因而得到的，其中，所述宿主微生物是编码多药运出蛋白的基因中的任意一种基因缺损的宿主微生物。[l]所述的转化体，其中，编码多药运出蛋白的基因缺损的宿主微生物是大肠杆菌。[1]或[2]所述的转化体，其中，编码多药运出蛋白的基因是选自tolC、acrA和acrB的任意一种基因。[1]~[3]中任一项所述的转化体，其中，来自异种生物的基因是编码选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和合成酶的任意一种酶的基因。[1]-[3]中任一项所述的转化体，其中，来自异种生物的基因是编码细胞色素P-450酶或氨基转移酶的基因。[1]-[3]中任一项所述的转化体，其中，来自异种生物的基因是编码细胞色素P-450酶的基因。微生物转化方法，其使用[4][6]中任一项所述的转化体进行的微生物转化方法。微生物转化方法，其使用[4]~[6]中任一项所述的转化体进行的^(数生物转化方法，其特征在于在底物化合物中单加氧。[8]所述的方法，其中，底物化合物选自维生素D3、4-胆甾烯-3-酮和密实菌素。以下通过说明本说明书中所述的术语、符号等的含义来详细地说明本发明。本说明书中使用的"多药运出蛋白，，包含革兰氏阴性细菌所具有的、主要使疏水性、两亲性的化合物由菌体内向菌体外排出的构成耐药性机制的全部蛋白。大肠杆菌中，TolC、AcrA、AcrB、EmrA、EmrB等属于该蛋白，在绿脓杆菌中，OprM、MexA、MexB等属于该蛋白质，但不限于此。本说明书中使用的"来自异种生物的基因，，包含由宿主微生物以外的生物分离或可扩增的全部基因。由生物的染色体DNA或质粒DNA中分离或扩增的基因、由mRNA扩增的基因等属于该基因，但不限于此。本说明书中使用的"转化体，，是指采用基因重组技术，以可表达的形式将来自其它生物的基因导入到特定的微生物中所得的微生物，在其中所使用的基因导入方法不只是使用质粒等载体的基因重组，也包含同源重组等方法。本说明书中使用的"微生物转化方法"是指在培养基中培养转化体，使底物化合物与培养物接触，修饰该化合物，转化为目标化合物并获得该目标化合物的方法。本发明中所述的"底物化合物"是指可通过各种微生物转化反应修饰的疏水性或两亲性的化合物。例如，来自异种生物的基因为P-450基因时，可以是己烷、庚烷、辛烷、壬烷等链烷化合物，曱苯、苯酚、枯烯等芳族化合物，胆甾醇、睾丸酮、4-胆甾烯-3-酮、脱氬表雄酮、维生素D2、维生素D3的甾类，亮氨酰基亮氨酸、亮氨酰基缬氨酸、聚亮氨酸、聚缬氨酸等直链肽类，脯氨酰基苯基丙氨酸、亮氨酰基丙氨酸等二肽进行环化稠合所得的二酮哌。秦类，环胞菌素、棘霉素等具有生理活性的环状肽类，蒎烯、莰烯、柠檬烯、香叶醇等单萜烯类；豚草烷(Ambrosane)、丁香烷(Caryophyllane)、补身烷(Drimane)等的倍半辟烯类，松香酸、赤霉酸等的二碎烯类，达玛烷、何帕烷、羊毛甾烷等的三萜烯类，密实菌素等的抑制素类，泰洛星、FK-506、红霉素等的大环内脂类，其它各种药物，或者它们的前体、代谢产物、衍生物等。本说明书中使用的"基因的类似物，，是指与原有的基因实质上具有同等功能的、(1)与原有的基因在严谨条件下杂交的多核苷酸；(2)具有与原有基因的碱基序列同源性为70%以上的碱基序列的多核苷酸；(3)具有与原有的基因的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸；或者(4)多核苷酸，该多核苷酸具有的碱基序列由于基因密码的简并，与原有的基因在严谨条件下不杂交，但是编码与(1)~(3)中任一项中定义的多核苷酸所编码的氨基酸序列相同的序列。"在严谨条件下杂交的多核苷酸，，是指例如以原有的基因作为探针，通过使用集落杂交法、噬菌斑杂交法或DNA杂交法等获得的多核苷酸，具体来说，是使用固定有来自集落或噬菌斑的多核苷酸的滤器，在0.7~l.OM氯化钠存在下、在65。C下进行杂交，然后使用0.1~2倍浓度的SSC溶液(l倍浓度的SSC溶液的组成包含150mM的氯化钠、15mM柠檬酸钠)，在65。C的条件下清洗滤器进行鉴定的多核苷酸。根据本发明，可以制备以编码多药运出蛋白基因缺损的微生物作为宿主的、整合来自异种生物的基因的转化体，使用该转化体，可以高效率地将各种底物化合物转成目标化合物。具体实施例方式以下对本发明的实施方式进^f亍详细说明。编码多药运出蛋白的基因缺损的宿主本发明中，首先制备使作为宿主的微生物本来所具有的多药运出蛋白的功能丧失的宿主。该宿主是编码多药运出蛋白的基因的一部分或全部缺失，或者在该基因的内部插入其它的DNA进行分隔，或者在该基因中引入至少一个以上的突变，由此使该基因所编码的多药运出蛋白的功能的一部分或全部丧失(也称为被破坏)。对上述基因的功能被破坏的微生物并没有限定，可以采用公知的Pl转导法或DNA的同源重组法来获得。作为宿主的微生物只要是可培养、并且与质粒或噬菌体DNA等载体用于插入基因的扩增的微生物即可，没有特别限定，例如有属于大肠杆菌、黄杆菌属(F/avo^cfen'ww)、假单胞菌属(尸化W(iomw7as)、4奉状4干菌属(Co^7"e6a"en'wm)的樣吏生物，^f尤选的例子是大肠杆菌。对编码多药运出蛋白的基因并没有限定，例如来自大肠杆菌的有SEQIDNO:.22的碱基1~碱基1488的连续的碱基序列所示的、编码来自大肠杆菌K-12抹的多药运出蛋白TolC的基因tolC,SEQIDNO:.23的碱基329~碱基1522的连续的碱基序列所示的、编码来自大肠杆菌K-12林的多药运出蛋白AcrA的基因acrA,SEQIDNO:.23的碱基1545~碱基4694的连续的碱基序列所示的、编码来自大肠杆菌K-12林的多药运出蛋白AcrB的基因acrB或它们的类似物。上述得到的宿主微生物是多药运出蛋白的功能的部分或全部缺损，因此在微生物转化中底物化合物容易停留在微生物内，结果转化10反应的效率提高，目标产物的生产效率也提高。转化体的制备接着，向所得的宿主中整合来自异种生物的基因或其类似物(以下也简称为异种基因等)，制备适合微生物转化的转化体。对将异种基因等整合宿主的方法没有特别限定，例如可以将该异种基因等插入到适当的载体中，通过原生质体法、电穿孔法整合到宿主中。对可以使用的载体的种类没有特别限定，例如可以是自主复制的载体(例如质粒等)，或者是导入到宿主中时整合到宿主细胞的基因组中，与整合的染色体一起复制，优选表达载体。表达载体中，异种基因等可以功能性连接转录所必须的要素(例如启动子等)。启动子在宿主细胞中是显示转录活性的DNA序列，可以根据宿主的种类适当选择。来自异种生物的基因整合到宿主中的异种基因等只要是参与将底物化合物转化成目标化合物的反应即可，没有特别限定，优选编码直接催化转化反应的各种酶的基因，例如有氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或合成酶等。氧化还原酶只要是催化氧化还原反应的酶即可，没有特别限定，例如有细胞色素P-450酶或醛还原酶等。特别优选的是细胞色素P-450酶，其中有分类为CYP105家族和CYP107家族的细胞色素P-450。转移酶只要是将原子团(官能基团等)从某种分子转移到另一种分子上的酶即可，没有特别限定，可以是氨基转移酶(将底物化合物的a-氨基转移到2-氧化戊二酸上，底物化合物本身催化形成2-氧代酸的反应)或糖转移酶等。水解酶只要是催化水解反应的酶即可，没有特别限定，有脂酶或淀粉酶等。裂解酶只要是催化原子基团的键解离的酶即可，没有特别限定，例如有碳酸水合酶(carbonatehydratase)等。异构酶只要是催化将某种异构体进行底物特异性异构化的反应的酶即可，没有特别限定，优选葡糖异构酶等。合成酶只要是利用ATP的水解能量，使两个分子键合的酶即可，没有特别限定，例如有DNA连接酶等。ii转化体的培养上述制备的转化体可以根据需要添加诱导物质等，在可以表达导入的基因的条件下、在适当的营养培养基中进行培养。该营养培养基含有适当的碳源、氮源、无机盐和天然有机营养物等，碳源可以使用葡萄糖、果糖、甘油、山梨醇、有机酸类等，氮源可以使用氨、尿素、硫酸胺、硝酸胺、乙酸胺等化合物，它们分别可以使用一种或两种以上。无机盐可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁等的盐类。并且，对使用菌具有生长发育促进效果的天然有机营养物可以使用蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、水解酪蛋白氨基酸等，进一步可以少量含有维生素类、核酸类。使用转化体的微生物转化接着，使表达这些基因的菌体与底物化合物接触，进行转换反应。转换反应的温度可考虑转化体的最佳温度而适当决定。反应时间也可考虑目标化合物的转化率(反应的进行程度)等而适当决定。宿主为大肠杆菌时，例如优选在2037。C下、1~5天。并且反应方式可以是间歇式或连续式，也可以以任何形式实施。生成的目标产物的分离和纯化通常可以利用将微生物代谢产物从其培养液中分离时所使用的分离、纯化的方法。例如使用曱醇、乙醇、丙酮、丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、曱苯等的有机溶剂萃取，使用夕'4X4才7HP-20等疏水性吸附树脂的吸附脱吸附处理，使用七77亍、;/夕义LH-20等的凝胶过滤色谱、活性碳、硅胶等的吸附色镨、或薄层色镨的吸附脱吸附处理，或者使用反相柱等的高效液相色谱等公知的所有方法均符合。另外，不特别限于这里所述的方法。可以将这些方法单独或组合成任意的顺序、还可以反复使用，由此可以分离、纯化目标化合物。实施例以下给出具体例子，对本发明进行更详细的说明，但并不是将本发明限定为这些例子。需要说明的是，下述例子中的百分号(％)在培养基的说明中表示重量百分号，在HPLC的流动相说明中表示容量百分号。实施例l:大肠杆菌tolC破坏抹的构建通过Pl转导法，将购自E.coliGeneticStockCenter(耶鲁大学)的大肠杆菌CAG12184(tolC::TnlO)抹转移至BL21star(DE3)抹上。即，在含有2.5mM氯化钩的L-培养基(l。/。聚胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠，pH7.2)上培养大肠杆菌CAG12184林，向0.2mL该培养液中添加Pl噬菌体，在37。C下培养10分钟。将该反应液添加到加温至45。C的软琼脂(l。/。聚胨、0.5%酵母提取物、0.5°/。氯化钠、0.3%琼脂、2.5mM氯化钙、pH7.2)中，铺于含有2.5mM氯化钙的L-琼脂培养基(1%聚胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠、1.8%琼脂，pH7.2)上。将其在37。C下培养18小时，然后加入3mLL-培养基，破碎软琼脂，回收上清，制成tolC-噬菌体液。接着，将大肠杆菌BL21star(DE3)株H;/匕'卜口，-工》公司)用含有2.5mM氯化钙的L-培养基培养，向0.1mL该培养液中添加tolC-噬菌体液，在37。C下培养IO分钟。然后将菌体离心并回收，向其中加入1mLL-培养基，在37。C下培养1小时，然后铺于含有10/^g/mL四环素的L-琼脂培养基中。在37。C下培养18小时，将出现的集落作为BLstarTolC林。BLstarTolC林是TolC功能缺损的tolC破坏抹。实施例2:大肠杆菌acrAB破坏林的构建同样，通过P1转导法，从具有非专利文献5所述大肠杆菌JA300A(acrAB::cat)的大肠杆菌JA300A林转移至BL21star(DE"林，将用含有5Ag/mL氯霉素的L-琼脂培养基选择的林作为BLstarAcrAB抹。另夕卜，将acrAB::cat也转移至BLstarTolC抹，将该抹作为BLstarTolCAcrAB抹。BLstarAcrAB林是AcrA功能和AcrB功能缺损的acrAB破坏抹。13BLstarTolCAcrAB抹是TolC功能进一步缺损的TolC、acrAB破坏林。实施例3:各种质粒的构建(1)pETAciBC-SD载体以下，所有的PCR反应均使用KOD#PLUS-DNA聚合酶(东洋纺公司)进行。将质粒pDolABC(参照非专利文献6)用限制酶Ncol和BamHI处理，得到含有基因aciB(参照SEQIDNO:,3的碱基1~碱基321)的DNA片段，其中基因aciB编码来自不动杆菌(」"'"eto6acfer^.)OC4林的铁氧化还原蛋白。将该片段通过T4DNA连接酶与大肠杆菌质粒载体pETduet-l(Novagen公司)的Ncol和BamHI位点连接，将该质粒作为质粒A。进一步以pDolABC为模板，使用引物A(参照SEQIDNO:力)和引物B(参照SEQIDNO:."进行PCR,扩增含有基因aciC(参照SEQIDNO:.3的碱基1978~碱基3192)的DNA片段，然后用限制酶BamHI和HindIII处理，其中基因aciC编码来自不动杆菌OC4株的铁氧化还原蛋白还原酶。将该片段通过T4DNA连接酶与质粒A的BamHI和HindIII位点连接，将所得质粒作为质粒B。接着，为了除去质粒B的两个T7启动子中后面一侧的一个，将质粒B用限制酶EcoRV和NotI处理，使用BKL试剂盒(宝酒造公司)使其平滑化，然后通过T4DNA连接酶连接，将所得质粒作为质粒C。另一方面，以自养假诺卡氏菌ATCC33795林的基因组DNA作为模板，使用引物C(参照SEQIDNO:.8)和引物D(参照SEQIDNO:,9)进行PCR，扩增作为间隔DNA序列的DNA片段，用限制酶BglII和BamHI处理。将该片段通过T4DNA连接酶与质粒C的BglII和BamHI位点连接，将所得质粒作为pETAciBC-SD载体。(2)质粒pETAciBC画50AABP195以不动杆菌OC4林的基因组DNA作为模板、使用引物E(参照SEQIDNO:.10)和引物F(参照SEQIDNO:.ll)进行PCR，扩增编码来自不动杆菌OC4抹的链烷氧化性P-450酶AciA的N末端部分的DNA片段(SEQIDNO:.3的碱基398~碱基541的DNA片段)，用限制酶Ndel和Spel处理。另一方面，以指孢嚢菌/6^/訓vw/as/wn/m)IFO14104抹的基因组DNA为模板，使用引物BP195F(参照SEQIDNO:.12)和引物BP195R(参照SEQIDNO:.13)进行PCR,扩增编码P-450酶的BP195基因(参照SEQIDNO:.2的碱基1~碱基1203),用限制酶Spel和BamHI处理。将这些DNA片段通过T4DNA连接酶与pETAciBC-SD载体的Ndel和BamHI位点连接，将所得质粒称作pETAdBC-50AABP195。(3)质粒pETAciBC-50AAvdh以自养假诺卡氏菌ATCC33795抹的基因组DNA作为模板，使用引物vbhF(参照SEQIDNO:.14)和引物vbhR(参照SEQIDNO:,15)进行PCR，扩增编码P-450酶的vdh基因(参照SEQIDNO:.l的碱基320~碱基1531)，用限制酶Spel和BglII处理。将这些DNA片段通过T4DNA连接酶与pETAciBC-50AABP195的Spel和BamHI位点连接，将所得质粒称作pETAciBC-50AAvdh。(4)质粒pETduet-boxA将质粒pETAciBC-SD载体用限制酶BamHI和HindIII处理，将含有基因aciC的DNA片段通过T4DNA连接酶连接，其中基因aciC编码与铁氧化还原蛋白还原酶具有同源性的蛋白，将所得质粒称作pETduetaciC。接着，使用引物boxBNcoF(参照SEQIDNO:.16)、boxBBamR(参照SEQIDNO:.17)和链霉菌(5^印tom;/c"s/.)TM-7林的基因组DNA,扩增含有boxB基因(参照SEQIDNO:.4的碱基l782~碱基1973)的DNA片段，用限制酶Ncol和BamHI处理，其中boxB基因编码附随在密实菌素氧化性P-450酶上的铁氧化还原蛋白。将该DNA片段通过T4DNA连接酶与用限制酶Ncol和BamHI处理的pETduetaciC连接，将所得质粒称为pETduetboxB。进一步使用引物boxANdeF(参照SEQIDNO:.18)、boxAXhoR(参照SEQIDNO:.19)和链霉菌TM-7林的基因组DNA，扩增含有boxA基因(参照SEQIDNO:.4的碱基544~碱基1761)的DNA片段，用限制酶Ndel和Xhol处理，其中boxA基因编码密实菌素氧化性P-450酶。将该DNA片段通过T4DNA连接酶与用限制酶Ndel和Xhol处理的pETduetboxB连接，将所得质粒称为pETduet-boxA。(5)质粒pTrcRat以洋葱伯克霍尔德氏菌(SwA/zoWen'ac印acz'a)895-3抹的基因组DNA作为模板，使用引物ExratF(参照SEQIDNO:.20)和引物ExratR(参照SEQIDNO:.21)进行PCR，扩增编码(R)-a-曱基色胺氨基转移酶的ratA基因(参照SEQIDNO:.5的碱基序列230~碱基1330)，用限制酶Pstl和EcoRI处理。将该DNA片段通过T4DNA连接酶与pTrcHisA(>f:x匕'卜口'-工》公司)的Pstl和EcoRI位点连接，将所得质粒称作pTrcRat。(6)质粒pHSG-ZAR以泥色黄杆菌IFO3084抹的基因组DNA作为模板，使用引物latSacF(参照SEQIDNO:.24)和引物latXhoR(参照SEQIDNO:.25)进行PCR，扩增编码赖氨酸氨基转移酶的lat基因(参照SEQIDNO:.30),用限制酶Sacl和Xhol处理。另外，以泥色黄杆菌IFO3084抹的基因組DNA为模板，使用引物ZARXhoF(参照SEQIDNO:.26)和引物ZARBamR(参照SEQIDNO:.27)进行PCR，扩增编码N-苄氧基羰基-L-氨基己二酸-^半醛还原酶的zar基因(参照SEQIDNO:.31)，用限制酶Xhol和BamHI处理。进一步以枯草芽孢杆菌(5ad〃wsra^'fc)str.l68ATCC23857抹的基因组DNA作为模板，使用引物rocGBamF(参照SEQIDNO:.28)和引物rocGXbaR(参照SEQIDNO:.29)进行PCR,扩增rocG基因(参照SEQIDNO:.32)，用限制酶Sacl和Xbal处理。将这三个DNA片段通过T4DNA连接酶与pHSG298(夕力，"4才公司)的SacI和XbaI位点连接，得到依次整合了lat、zar、rocG的质粒pHSG-ZAR。实施例4:由维生素D3向25-羟基维生素D3的微生物转化使用质粒pETAciBC-50AAvdh转化大肠杆菌BLstarTolCAcrAB抹、BlstarTolC林、BLstarAcrAB林和BL21star(DE3)抹，将所得的菌抹分别称为BlstarTolCAcrAB/pETAciBC-50AAvdh林、BlstarTolC/pETAciBC-50AAvdh抹、BlstarAcrAB/pETAciBC-50AAvdh林和BL21star/pETAciBC-50Aavdh抹。同样，使用质粒pETAciBC-50AABP195转化大肠杆菌BLstarTolCAcrAB抹、BLstarTolC抹、BLstarAcrAB株和BL21star(DE3)林，将所得菌林分别称为BlstarTolCAcrAB/pETAciBC-50AABP195抹、BLstarTolC/pETAciBC-50AABP195抹、BLstarAcrAB/pETAciBC陽50AABP195抹和BL21star/pETAciBC-50AABP195抹。将这些抹接种于含有羧节西林钠(IOO〃g/mL)的M9SEED液体培养基(3.39。/。Na2HP04、1.5%KH2P04、0.25%氯化钩、0.5%氯化铵、1°/。水解酪蛋白氨基酸、0.002%胸腺嘧啶、0.1mM氯化钩、O.lmM硫酸铁、0.4%葡萄糖、0.001mM氯化镁)中，在25。C下、以220rpm振荡培养24小时。将200//L该培养液添加到25mL含有羧千西林钠(100;Wg/mL)和OvernightExpressAutoinductionSystems(Novagen公司)的M9Main液体培养基(3.39。/oNa2HP04、1.5%KH2P04、0.25。/。氯化钠、0.5%氯化铵、1。/。水解酪蛋白氨基酸、0.002%胸腺嘧，定、O.lmM氯化钙、O.lmM硫酸铁、80//g/mL5-氨基乙酰丙酸)中，然后在25。C下、以220卬m振荡培养24小时。通过离心回收菌体，悬浮于5mL的CV2緩冲液(50mM磷酸钾緩冲液、2%甘油、50^g/mL羧千西林、O.IMIPTG)中，得到了相对于培养液浓缩了5倍的菌体悬浮液。向lmL该菌体悬浮液中添加25^L含r/。维生素D3的DMSO溶液(终浓度250^g/mL)和部分曱基化环糊精(终浓度0.75%),在28。C下、以220rpm振荡培养24小时。然后在该反应液中加入2mL曱醇，在室温下涡旋10分钟，然后通过Eppendorf离心机、以15,000rpm离心IO分钟，将所得上清用HPLC分析，4企测到17由于底物维生素D3被氬氧化而生成的25-羟基维生素D3。该结果如表1所示。宿主大肠杆菌微生物转化反应中使用的基因和VD3氢氧化物蓄积浓度Cwg/mL)微生物转化反应中使用的基因和相对于野生抹的比活性vdhBP195vdhBP195野生林46.713.01.01.0acrAB破坏林135.123.52.91.8tolC破坏林187.030.24.02.3tolC、acrAB石皮坏才朱216.438.74.63.0需要说明的是，HPLC的测定条件如下。分析装置Agilent100系列柱J，sphereODS-H80(YMC，Inc.),75mmx4.6mmLD.流动相A:乙腈B:离子交换水梯度时间设定0分流动相A/B=30:7013.00分流动相A/B=30:7014.00分流动相A/B=100:021.00分流动相A/B=100:022.00分流动相A/B=70:3025.00分流动相A/B=70:30流速1.0mL/分钟检测UV265nm注射容量10//L柱温40。C分析时间25分钟保留时间25-羟基维生素D38.8分钟维生素Ds21.0分钟在使用表达编码P-450酶Vdh的vdh基因与编码电子传递系统的基因aciAB的大肠杆菌进行的维生素D3的微生物转化反应中，与以往的方法一使用野生型大肠杆菌作为表达宿主的情形比较，25-羟基维生素D3的蓄积是使用acrAB破坏抹时为2.9倍，使用tolC破坏林时为4.0倍，使用tolCacrAB破坏抹时为4.6倍。另外，在使用表达编码P-450酶BP195的基因和编码电子传递系统的基因aciAB的大肠杆菌进行的维生素D3的微生物转化反应中，与以往的方法一使用野生型大肠杆菌作为表达宿主的情形比较，25-羟基维生素D3的蓄积是使用acrAB破坏林时为1.8倍，使用tolC破坏抹时为2.3倍，使用tolCacrAB破坏抹时为3.0倍。实施例5:由4-胆甾烯-3-酮向25-羟基-4-胆甾烯-3-酮的微生物转化使用上述的大肠杆菌BlstarTolCAcrAB/pETAciBC-50AABP195抹、BLstarTolC/pETAciBC-50AABP195抹、BLstarAcrAB/pETAciBC-50AABP195林和BL21star/pETAciBC-50AABP195林，与实施例4同样制备菌体悬浮液。向111^该菌体悬浮液中添加25;1^1%4-胆甾烯-3-酮曱醇溶液(终浓度250pg/mL)和部分曱基化环糊精(终浓度0.75%),在28。C下、以220rpm振荡培养24小时。然后向该反应液中加入2mL曱醇，在室温下涡旋10分钟，然后通过Eppendorf离心机、以15,000rpm离心10分钟，将由此得到的上清进行HPLC分析，检测到由于底物4-胆甾烯-3-酮被氢氧化而生成的25-羟基-4-胆甾烯-3-酮。结果如表2所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>需要说明的是，HPLC的测定条件如下。分析装置Agilent100系列柱InertsilODS/350mmx4.6mml.D.流动相A:乙腈B:0.85%磷酸水溶液梯度时间设定0分流动相A/B=40:605.00分流动相A/B=100:08.00分流动相A/B=100:08.30分流动相A/B=40:6011.00分流动相A/B=40:60流速1.2mL/分钟检测UV235nm注射容量40柱温40°C分析时间11分钟保留时间25-羟基-4-胆甾烯-3-酮4,97分钟4-胆甾烯-3-酮7.45分钟在4-胆甾烯-3-酮的微生物转化反应中，与以往方法一使用野生型大肠杆菌作为表达宿主的情形比较，25-羟基-4-胆甾烯-3-酮的蓄积是:使用acrAB破坏抹时为1.4倍、使用tolC破坏林时为10.5倍，使用tolCacrAB破坏林时为11.0倍。实施例6:由密实菌素向普伐他汀的微生物转化使用上述的质粒pETduet-boxA转化大肠杆菌BLstarTolCAcrAB抹和BL21star(DE3)林，将所得菌抹分别称为BLstarTolCAcrAB/pETduet-boxA抹和BL21star/pETduet-boxA株。使用这些菌抹，与实施例4同样制备菌体悬浮液。向1mL该菌体悬浮液中添加30//L的25mg/mL密实菌素(终浓度750^g/mL)，在28°C下、以220rpm振荡培养8小时。进一步追加添加30^L的25mg/mL密实菌素(终浓度1500〃g/mL)，在28。C下、以220rpm振荡培养16小时。然后向该反应液中加入1mL曱醇和1mL乙腈，在室温下涡旋10分钟，然后通过Eppendorf离心机、以15,000rpm离心10分钟，将所得上清用HPLC分析，检测到由于底物密实菌素被氢氧化而生成的普伐他汀。该结果如表3所示。宿主大肠杆菌微生物转化反应中使用的基因和密实菌素氢氧化物蓄积浓度C"g/mL)微生物转化反应中使用的基因和相对于野生林的比活性boxAboxA野生林acrAB破坏林tolC破坏林tolC、acrAB破坏抹51.11.0NTNTNTNT1689.033.1HPLC的测定条件如下。分析装置Agilent100系列才主ChromolithPerformanceRP-18e100mmx4.6mml.D.流动相A:曱醇:三乙胺:乙酸=100:0.1:0.1B:水:三乙胺:乙酸=100:0.1:0.1梯度时间设定0分流动相A/B=50:50213.00分流动相A/B=90:103.50分流动相A/B=90:103.51分流动相A/B=50:505.00分流动相A/B=50:50流速2.0mL/分钟冲企测UV238nm注射容量15^L柱温40°C分析时间6分钟保留时间普伐他汀1.77分钟密实菌素3.23分钟在使用表达编码P-450酶BoxA的基因和编码该电子传递系统的基因boxD及acrC的大肠杆菌进行的密实菌素的微生物转化反应中，与以往的方法^使用野生型大肠杆菌作为表达宿主的情形比较，使用tolCacrAB破坏林时蓄积了33.1倍的普伐他汀。实施例7:由(R)-a-曱基色胺向吲哚-3-丙酮的微生物转化使用上述的质粒pTrcRat转化大肠杆菌BLstarTolCAcrAB林和BL21star(DE3)林，将所得菌抹分别称为BLstarTolCAcrAB/pTrcRat株和BL21star/pTrcRat林。将这些抹接种于含有羧千西林钠(100^wg/mL)的L液体培养基(1.0%聚胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠、pH7.2)中，在37。C下、以220rpm振荡培养8小时。将50/^L该培养液添加到25mL含有羧千西林钠(100//g/mL)和OvernightExpressAutoinductionSystems(Novagen,>司)的L液体培养基中，然后在30°C下、以220rpm振荡培养20小时。通过离心回收菌体，悬浮于2.5mL硼酸緩冲液(200mM、pH9.0)中，得到相对于培养液浓缩了IO倍的菌体悬浮液。向0.5mL该菌体悬浮液中添加0.5mLL液体培养基、25//L50%甘油溶液、1.2550mg/mL羧爷西林钠、10/^L100mMIPTG、以及250^L"mM(R)-a-曱基色胺，在30。C下、以220rpm振荡培养18小时。然后向该反应液中加入50,L5N氢氧化钠溶液和2mL乙酸乙酯，在室温下涡旋10分钟，然后通过Eppendorf离心机、以15,000rpm离心IO分钟，将所得上清浓缩干燥，溶解于300甲醇中。将其用HPLC进行分析，检测到从底物(R)-a-曱基色胺(R-MT)中游离出氨基而生成的吲哚-3-丙酮。该结果如表4所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>保留时间(R)-a-曱基色胺6.5分钟巧l咮-3-丙酮11.4分钟在使用表达编码(R)-a-曱基色胺氨基转移酶RatA的基因的大肠杆菌进行的(R)-a-曱基色胺的微生物转化反应中，与以往的方法一使用野生型大肠杆菌作为表达宿主的情形比较，使用tolCacrAB破坏林时蓄积了1.2倍的。引咮-3-丙酮。实施例8:由N-千氧基羰基-L-赖氨酸(Z-Lys)向N-千氧基羰基-6-羟基-L-正亮氨酸(Z-HNL)的微生物转化通过质粒pHSG-ZAR的lat基因所编码的赖氨酸氨基转移酶，使Z-Lys转化为N-千氧基羰基-L-氨基己二酸J-半醛(Z-ASA)，通过zar基因所编码的Z-ASA还原酶将Z-ASA转化为Z-HNL，进一步通过rocG基因所编码的谷氨酸脱氢酶再生辅酶NADPH。使用上述质粒pHSG-ZAR转化大肠杆菌BLstarTolCAcrAB林和BL21star(DE3)林，将所得抹分另'J称为BLstarTolCAcrAB/pHSG-ZAR抹和BL21star/pHSG-ZAR抹。将这些抹接种于含有卡那霉素硫酸盐(25^g/mL)的M9SEED液体培养基(3.39。/。Na2HP04、1.5%KH2P04、0.25%氯化钓、0.5%氯化铵、1%水解酪蛋白氨基酸、0.002%胸腺嘧啶、0.1mM氯化钓、O.lmM硫酸铁、0.4%葡萄糖、0.001mM氯化镁)中，在25。C下、以220rpm振荡培养24小时。将200//L该培养液添加到25mL含有卡刃卩霉素石危酉吏盐(80^g/mL)和OvernightExpressAutoinductionSystems(Novagen公司)的M9ZAR液体培养基(3.39。/。Na2HP04、1.5%KH2P04、0.25%氯化钠、0.5%氯化铵、1%水解酪蛋白氨基酸、0.002%胸腺嘧啶、O.lmM氯化钙)中，然后在30。C下、以220rpm振荡培养7小时，然后在25。C下、以140rpm振荡培养17小时。通过离心回收菌体，悬浮于5mL的CV3緩冲液(50mM磷酸钾緩沖液、2%甘油、20/^g/niL卡那霉素硫酸盐、0.1MIPTG)中，得到相对于培养液浓缩了5倍的菌体悬浮液。向1mL该菌体悬浮液中添加40^L25mg/mLZ-Lys溶液(终浓度1000^g/mL)和y-环糊精(终浓度2%),在28。C下、以220rpm振荡培养24小时。然后向该反应液中加入2mL曱醇，在室温下涡旋10分钟，然后通过Eppendorf离心机、以l5,000rpm离心10分钟，将所得上清用HPLC分析，；险测到由底物Z-Lys24[表5]宿主大肠杆菌微生物转化反应中使用的基因和Z-HML蓄积浓度Cg/mL)微生物转化反应中使用的基因和相对于野生抹的比活性lat、zar、rocGlat、zar、rocG野生抹2881acrAB破坏抹N.T.N.T.tolC破坏林N.T.N.T.tolC、acrAB破坏抹4201.5HPLC的测定条件如下。分析装置Agilent100系列柱J，sphereODS-H80(YMC，Inc.),75mmx4.6mml.D.流动相A:乙腈B:0.85%磷酸水溶液梯度时间设定0分流动相A/B-20:806.00分流动相A/B=20:808.00分流动相A/B=60:4010.00分流动相A/B-20:80流速1.5mL/分钟检测UV220nm注射容量10pL柱温40。C分析时间10分钟保留时间Z-HNL3.1分钟在使用表达分别编码赖氨酸氨基转移酶、N-千氧基羰基-L-氨基己二酸-3-半醛还原酶和谷氨酸脱氢酶的基因的大肠杆菌进行的Z-Lys的微生物转化反应中，与以往的方法一使用野生型大肠杆菌作为表达宿主的情形比较，使用tolCacrAB破坏株时蓄积了1.5倍的Z-HNL。产业实用性本发明应用于利用微生物转化法的化合物的制备领域。权利要求1.转化体，该转化体是向宿主微生物中整合来自异种生物的基因而得到的，其中，所述宿主微生物是编码多药运出蛋白的基因中的任意一种基因缺损的宿主微生物。2.权利要求1所述的转化体，其中，编码多药运出蛋白的基因缺损的宿主微生物是大肠杆菌。3.权利要求1或2所述的转化体，其中，编码多药运出蛋白的基因是选自tolC、acrA和acrB的任意一种基因。4.权利要求1~3中任一项所述的转化体，其中，来自异种生物的基因是编码选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和合成酶的任意一种酶的基因。5.权利要求13中任一项所述的转化体，其中，来自异种生物的基因是编码细胞色素P-450酶或氨基转移酶的基因。6.权利要求1-3中任一项所述的转化体，其中，来自异种生物的基因是编码细胞色素P-450酶的基因。7.微生物转化方法，其是使用权利要求4~6中任一项所述的转化体进行的微生物转化方法。8.微生物转化方法，其是使用权利要求4-6中任一项所述的转化体进行的^t生物转化方法，其特征在于在底物化合物中单加氧。9.权利要求8所述的方法，其中，底物化合物选自维生素D3、4-胆甾烯-3-酮和密实菌素。全文摘要本发明的目的在于提供改善在现有的使用整合来自异种生物的基因的转化体进行的微生物转化中可见的转化效率低的方法。使用编码多药运出蛋白的基因缺损的微生物作为宿主，向其中整合来自异种生物的基因来制备转化体，将其应用于微生物转化，由此可以非常高效率地将疏水性或两亲性的底物化合物转化为目标化合物。以大肠杆菌作为宿主时，编码缺损的多药运出蛋白的基因例如有tolC、acrA、acrB等。文档编号C12N15/09GK101675157SQ20088000674公开日2010年3月17日申请日期2008年2月28日优先权日2007年3月1日发明者伊藤将士,株本浩树,町田和弘,落合淳,藤井匡,藤井良和申请人:美露香株式会社