靶定脂肪体的蛋白质的制作方法

专利名称：：靶定脂肪体的蛋白质的制作方法靶定脂肪体的蛋白质本发明涉及通过融合将目的蛋白质靶定至细菌细胞的胞内疏水内含体的方法，所述融合物包含与所述目的蛋白质有效连接的疏水目标肽；本发明涉及通过重组细菌宿主微生物制备目的亲脂化合物的方法，所述重组细菌宿主包含具有至少一种酶(其参与靶定至所述内含体的所迷亲脂化合物的生物合成)的胞内内含体；本发明还涉及相应的融合物、编码序列、表达载体及重组宿主。
背景技术：
：大多数生物能够累积疏水化合物，如三酰甘油(TAG)、蜡酯类(waxesters,WE)、固醇酯类(sterolsesters)或聚羟基链烷酸酯(PHA)。这些质和多聚体沉积为胞内内含物，并主要作为能量和碳储备，或用于膜脂及固醇生物合成的前体起作用。真核生物中的初级能量贮存化合物为TAG,而大多数原核生物可以合成PHA[18，24。在细菌中，储备TAG和WE主要限定在诺卡氏菌形放线菌(nocardioformactinomycetes)、链霉菌(streptomycetes)和一些革兰氏阴性菌中[3,31。作为最显箸的实例，富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)H16能够累积高达90%其细胞干重的聚3-羟基丁酸(PHB)(Steinbtichel，[24j)。细菌的中性脂质内含物在结构上与真核生物中的那些内含物相关。两者均由磷脂单层包围的脂质核心组成，其隔离内含物与细胞质，因而防止胞质蛋白质因疏水性相互作用而聚结或变性。细菌中TAG和WE内含物的生物发生和蛋白质装配截然不同于真核生物的脂质内含物。在真核生物中，推测脂质内含物通过在内质网(ER)5的磷脂小叶(phospholipidleaflet)间累积脂质并随后通过脂肪体出芽发出。具有来自外侧ER小叶的磷脂单层膜的出芽颗粒最终释放至细胞质中[5，18]。相反，细菌中，通过蜡酯合酶/酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶(WS/DGAT辨为结合到质膜胞质面的小滴上的小型酶合成TAG和WE。这些小滴凝聚成更大的结构，推测它们在释放至细胞质之前被磷脂包被[ll，30]。然而在动物和大多数植物中，脂肪体单层与陷入蛋白质(embeddedprotein)相关，已知没有这样的蛋白质包围细菌的脂质内含物[12，30。围脂滴蛋白(，rilipin)是最具特征的哺乳动物脂肪体蛋白质，并且参与细胞器的构造及形成，并通过激素敏感性脂肪酶调节脂解作用来控制脂质平衡[17]。三个围脂滴蛋白同种型A、B和C由单个基因转录的备选剪接形式的mRNA编码[9，16。所有围脂滴蛋白具有共同的N末端，其也非常类似于厶DRP和IIP47的N末端，它们共同组成了PAT蛋白质家族[15]。围脂滴蛋白A是最大的同种型和与脂肪细胞脂肪体相关的最丰富的蛋白质，而ADRP和TIP47具有广泛的组织分布。围脂滴蛋白和ADRP特异地与脂肪体表面结合，而TIP47在细胞质中也较多[4，17]。关于PAT家族蛋白质是在游离核蛋白体上合成还是与植物中的油质蛋白类似，经翻译插入到沿ER的新生脂肪体中的报道是对立的[5，8，15，20]。油质蛋白[1，13是在干旱耐受植物的种子中与脂肪体结合的主要蛋白质。因为它们可以防止脂肪体在种子脱水及萌发过程中发生聚结，于是推测它们在维持脂肪体的稳定性中起关键作用[181。推测油质蛋白由ER上的多核糖体合成并在出芽过程中共翻译掺合至脂肪体中。因为也已经成功地将玉米的油质蛋白耙定至欧洲油菜(Brassicanapus)的种子脂肪体中，并也成功地将其耙定至重纟且酵母(酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae))中14,26j，该ER介导的靶定过程看起来在真核生物中是普遍的。原核PHA内含物，与真核WE或TAG内含物之间在蛋白质组成及形成方面也显示出巨大差异。然而已知没有特定蛋白质与细菌TAG和WE内含物大量结合，PHA内含物被泽漆皂甙(phasin)包被，其代表了独特种类的蛋白质(？66『&Steinbiichel18c；WSltermann&Steinbiichel[31J;Steinbiichel等[24b)。代表富养罗尔斯通氏菌H16中PHA内含物表面上关键泽漆皂甙的PhaPl在这些内含物的形成及构造中起重要作用，因为它的存在或缺失影响了细胞中内含物的数量和大小及PHB的量(Wieczorek等[31al，P6tter等，[18dl，P(itter等[18el，York等32!)。根据最公认的模型，PHA内含物由可溶性PHA合酶将3HB-CoA的3-羟基丁酸(3HB)聚合成PHB，以及同时释放CoA而形成。因为PHA合i^f呆持共价连接到生长的PHB链上，于是形成了由亲水性合酶和延长的多聚体链组成的两亲复合体(Gemgross等，[8a)。认为这些复合体凝聚成微团样结构，所述结构因PHA链的继续延伸而扩大成PHA颗粒。在颗粒生长过程中，认为泽漆皂甙和磷脂迁移至多聚体核的疏水面，因而在疏水核与细胞质间产生界面(Stubbe&Tian，[24c)。然而，仍然不曾报道过泽漆皂甙蛋白质的三维结构，并且对介导和影响它们靶定至PHA颗粒的因素和基序知之甚少(Pi印er-Ftirst等[18b)。与此相反并如上已描述的，TAG和WE在质膜的细胞质位置由蜡酯合酶/酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶(WS/DGAT)形成。酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶是用于细菌中这些脂质生物合成的关键酶并结合到脂滴上。这些小滴聚结成更大的结构，其然后释放至细胞质并最终呈现为大的脂质内含物。需要允许将功能性多肽(例如功能性酶)靶定至例如由细菌细胞形成的脂肪体(例如TAG)的系统，所述功能多肽保持与所述脂肪体结合足够长时间以在所述细胞中发挥它们的功能。发明概述上述问题令人惊奇地通过用融合的编码序列转化产生脂肪体的细菌细胞得以解决，所述融合物包含与功能多肽有效连接的目标肽，例如功能性酶。7附图简述图1:(A)通过使用SDS-PAGE研究乙酰胺诱导对携带构建表达质粒的耻垢分枝軒菌(M,s函egniatis)中PhaPl、eGFP和C末端PhaPl-eGFP融合物的合成影响(左)，及通过使用Western印迹分析对各重组蛋白质<fe、汰JA^m",+、頃工々疋a;i"J/v、^i"aaA/Jr二工闭rtr"j八工U-、/士HV化队^WJ、>TI/。丌JJ^2T\KW/J/iT工W，^/U丫十、'J、JtijT0CHU，刀J主々'J、,1^泳道1，缺少乙酰胺时的耻垢分枝杆菌pJAM2::phaPl;耻垢分枝杆菌；泳道2，用0.5%(w/v)乙酰胺诱导的pJAM2::phaPl;泳道3，缺少乙酰胺时的耻垢分枝杆菌pJAM2::egfp;泳道4，用0.5%(w/v)乙酰胺诱导的耻垢分4支軒菌pJAM2::egfp;泳道5，缺少乙酰胺时的耻垢分枝杆菌pJAM2::phaPl-egfp;泳道6，用0.5%(w/v)乙酰胺i秀导的pJAM2::phaPl-egfp。(B)携带pJAM2::phaPl的耻垢分枝杆菌中重组PhaPl合成及稳定性的时间过程分析。细胞粗提物的电泳图(左)和在补充有0,5%(w/v)乙酰胺的铵减少MSM中生长24小时(泳道l)、48小时(泳道2)、72小时(泳道3)和96小时(泳道4)后，在对应于SDS-PAGE的Western印迹上通过4吏用抗PhaPlIgG对PhaPl进4亍的免疫检测(右)。(A)和(B)的SDS-PAGE凝胶中存在的蛋白质通过考马斯亮蓝R250显现。(C)通过TLC揭示不同浓度的乙酰胺对在铵减少MSM中生长72小时后的耻垢分枝杆菌中胞内TAG积累的影响。Std，油酸甘油酯标准；泳道l，0.5%(w/v);泳道2,0.3%(w/v);泳道3，0.1%(w/v);泳道4，0.05%(w/v);泳道5，0.01%(w/v);泳道6，0.005%(w/v),泳道7，0.001%(w/v)。图2:对细胞粗提物中PhaPl、eGFP和PhaPl-eGFP融合物，及从混浊红球菌(R.opacus)野生型细胞和携带质粒pJAM2::phaPl、pJAML:egfp或pJAM2::phaPl-egfp的各重组菌林中获得的亚细胞部分的免疫检测。左图显示粗提物和细胞部分的SDS-PAGE电泳图，而中间和右边的图显示在对应于SDS-PAGE的Western印迹上分别使用抗PhaPlIgG和抗eGFPIgG的免疫测定。用考马斯亮蓝R250对凝胶中的蛋白质进行染色。Std，分子量标准；泳道l;野生型细胞的粗提物；泳道2，野生型细胞的可溶性部分；泳道3，从野生型细胞中分离的TAG内含物；泳道4，携带pJAM2::phaPl的细胞的粗提物；泳道5,从携带pJAM2::phaPl的细胞中获得可溶性部分；泳道6，从携带pJAM2::phaPl的细胞中分离的TAG内含物；泳道7，携带pJAM2::egfp的细胞的粗提物；泳道8，携带pJAML:eg印的细胞可溶性部分；泳道9，携带pJA!VK::egfp的细胞的TAG内含物；泳道10，携带pJAM2::phaPl-eg印的细胞的细胞粗提物；泳道11，携带pJAM2::phaPl-egfp的细胞的可溶性部分；泳道12，从pJAM2::phaPl-egfp携带细胞中分离的TAG内含物。细胞在补充有0.5%(w/v)乙酰胺的铵减少MSM中生长72小时。图3:在(A)Stdl培养基和铵减少MSM中生长24小时(B)、48小时(C)或72小时(D)的混浊红球菌的重组细胞中尼罗红和PhaPl-eGFP融合物的荧光显樣t定位。每一图(panel)上方的图像显示相差(PH)、微分干涉相差(DIC)和将PH、尼罗红(NR)和eGFP荧光图像合并的三通道荧光显微叠加图像。每一图下方的图像显示单通道eGFP和NR图像及将NR和eGFP荧光合并的两通道荧光显微叠加图像。此外，图A显示在Stdl中生长的混浊红球菌的去叠合图像，其在细胞质膜处显示微弱的PhaPl-eGFP荧光(箭头)，而图D中另一去叠合图4象证实PhaPl-eGFP荧光位于在铵减少MSM中生长72小时的细胞中的胞内TAG内含物的表面。(E)从在储存条件下生长72小时的表达phaPl-eg印的混浊红球菌细胞中分离的TAG内含物的PH及去叠合两通道eGFP/NR荧光图像，其显示了表面上融合物的分布和通过NR对内含物核中的脂质进行的标记。(F)在储存条件下生长48小时的转化有pJAM2::egfp的混浊红球菌细胞的PH和荧光图像，其显示了未融合eGFP的弥散细胞质荧光(上图)，而胞内TAG内含物在两通道eGFP/NR荧光图像中通过NR被清晰标记(下图)。所有图像均从在0.5%(w/v)乙酰胺存在的情况下培养的细胞获得。除非另有说明，标尺代表liam。图4:耻裙分枝杆菌mc2155的重组细胞中PhaPl-eGFP融合物的荧光显微定位。左边的图像显示相差图像，而右边的图像显示相应的荧光图像。9携带pJAM2::egfp的对照菌抹的细胞显示了未融合的eGFP在整个细胞质中的弥散荧光(A)。Stdl培养基中生长的转化有pJAM2::phaPl的耻垢分枝杆菌mc2155细胞在其细胞的一极显示单个荧光TAG内含物(B)。铵减少MSM中生长24小时(C)和48小时(D)的携带pJAM2::phaPl-egfp的细胞显示标记有PhaPl-eGFP的TAG内含物数量增加(箭头)。所有图像均从在缺少乙酰胺的情况下培养的细胞获得。图5:PhaPl在重组混浊红球菌PD630中与胞内TAG内含物;M:膜结合。使用兔抗PhaPlIgG，随后使用18nm金缀合山羊抗兔猪IgG(黑点)在冷冻切片上进行免疫细胞化学。在如方法部分所述进行切片制备前，细胞用pJAM2::phaPl进行转化并且在储存条件下生长72小时。缩写CW，细胞壁；CY,细胞质；TAG,TAG内含物；标尺-200nm。图6:从重组混浊红球菌PD630细胞中分离的离体TAG内含物的P-半乳糖苷酶活性。(A)从携带pJAM2::phaPl-lacZ的混浊红球菌PD630细胞中分离的TAG内含物的P-半乳糖苷酶活性。(B)如在方法部分中所述通过过滤去除TAG内含物后分，析物(A)的P-半乳糖苷酶活性。(C)从携带作为对照的pJAM2::phaPl的混浊红J求菌PD630细胞中分离的TAG内含物的P-半乳糖苷酶活性。(D)去除TAG内含物后分析物(C)的P-半乳糖苷酶活性。图7:对耻垢分枝杆菌mc2155的重组细胞的蛋白质粗提物中玉米油质蛋白和鼠围脂滴蛋白A表达的免疫检测。(A)SDS-PAGE:Std，分子量标准；泳道1和3，耻垢分枝杆菌pJAM2;泳道2，耻垢分枝杆菌pJAM2::oleo呵"泳道4,耻裙分枝杆菌pJAM2::perA,。(B和C)对应于SDS-PAGE(A)的玉米油质蛋白(B)和鼠围脂滴蛋白A(C)的免疫印迹检测。图8:围脂滴蛋白A的eGFP融合物在重组混浊红球菌PD630中的分布。左图显示相差图像，而右边显示相应的荧光图像。(A)在储存条件下生长24小时的pJAM2::egfp转化混浊红球菌PD630细胞显示了未融合eGFP弥散的胞质荧光。箭头指示因胞内无标记10TAG内含物而排除在外的区域。(B)在表达eGFP融合物的鼠围脂滴蛋白A的储存条件下分别生长0、24或48小时的转化有pJAM2::perAmur-egfp的细胞。eGFP融合物的荧光与胞内TAG内含物(箭头)结合。(C)从在储存条件下生长48小时的围脂滴蛋白A-eGFP表达混浊红球菌PD630细胞中分离的TAG内含物。分离到所述TAG内含物后，用尼罗红对核心脂质进行复染。图9:TIP47的eGFP融合物在重组混浊红球菌PD630中的分布。相差图像示于左图，相应的荧光图像示于右图。(A)时间重叠实mt实了重组混浊红球菌PD630中胞内TAG内含物的形成及TIP47-eGFP蛋白质与这些内含物的结合。(B)分离的TAG内含物与携带结合的TIP47-eGFP融合物的尼罗红形成对比。TAG内含物从在脂质储存条件下生长48小时的培养细胞中分离。图10:ADRP的eGFP融合物在重组混浊红球菌PD630中的分布。显示了相差图像(左图)和对应的荧光图像(右图)。细胞用pJAM2::adrphum-egfp进行转化并在储存条件下生长0、24和48小时。图11:冷冻切片并冷冻断裂的重组混浊红球菌PD630细胞的胞质TAG内含物的免疫金标记。(A)使用豚鼠抗人IgG，然后使用18nm金缀合的驴抗豚鼠IgG在冷冻切片上对TIP47进行的免疫金标记。细胞用pJAM2::tip47进行转化并在储存条件下生长24小时。在凹面破裂细胞(B)和凸面破裂细胞(C)中胞内TAG内含物的核心上对其TIP47部分的融合蛋白进行的免疫金(12nm金)标记。(D)通过它们在横向破裂TAG内含物的核心中的eGFP-标签对TIP47-eGFP进行的免疫金(12nm金)标记。缩写Cw，细胞壁；Cy,细胞质；TAG，TAG内含物。标尺-200mn。发明详述1.优选实施方案第一方面，本发明涉及将目的蛋白质靶定至重组细菌细胞的胞内疏水性内含体的方法，所述方法包括在所述细菌细胞中异源表达编码融合蛋白的核苷酸序列，所述融合蛋白包含与所述目的蛋白质有效连接的疏水性目标肽。通常，所述内含体是TAG、WE或HA型。它们优选为TAG内含体。如本方法中所用的目标肽选自原核生物或真核生物的肽，并尤其选自细菌、动物或植物来源的肽。优选为细菌和动物来源的目标分子。具体而言，目标分子来自在其天然状态下与原核PHA内含体(尤其是细菌PHA内含体)结合的蛋白质；或来自在其天然状态下与真核TAG或WE内含体(尤其是动物或植物TAG或WE内含体)结合的蛋白质。关于目标分子的特定种类，可提及聚羟基链烷酸酯体结合泽漆皂甙，例如PhaPl;目标蛋白质的PAT家族成员，尤其是围脂滴蛋白，例如围脂滴蛋白A、B或C;脂肪分化相关蛋白质(ADRP)也称为adipophilin;和尾部相互作用蛋白质(TIP),例如TIP47。目标分子的非限定性实例选白a)PhaPl(SEQIDNO:19)b)围脂滴蛋白A(SEQIDNO:27)c)ADRP(SEQIDNO:35)d)TIP47(SEQIDNO:31)或其功能等同物。在靶定方法的优选实施方案中，所述目的蛋白质为酶，例如参与疏水或亲脂目的化合物的生物合成的酶。例如，所述酶可参与以下物质的生物合成a)亲脂维生素、其衍生物和前体，b)饱和或不饱和脂肪酸和脂肪族醇，尤其是长链脂肪酸或相应的具有10至30或18至25个碳原子的脂肪族醇，例如多不饱和脂肪酸(PUFA),或c)调p木物质。对于a)组化合物的非限定性实例，可提及类胡萝卜素，例如P-胡萝卜素、叶黄素、番痴红素、cantaxanthine、玉米黄素、astaxantine;维生12素，例如维生素E和QIO。对于b)组化合物的非限定性实例，可提及PUFA(具有18至22个碳原子，和3至6个C二C键)，例如w3脂肪酸18:3w3、18:4co3、20:3co3、20:4co3、20:5(03(即二十碳五烯酸，EPA)、22:5co3、22:6co3(即二十二碳六烯酸，DHA);或w6月旨肪酸18:2co6、18:3co6、20:2co6、20:3co6(即双高-Y-亚麻酸，DGLA)、20:4co6(即花生四烯酸，ARA)、22:30)6、22:4co6或22:5co6。对于c)组化合物的非限定性实例，可提及来自异戊烯-PP的调味化合物，例如薄荷醇。对于目的酶的非限定性实例，可提及参与类胡萝卜素生物合成的酶，例如由基因ispA(法呢基-二磷酸合酶)、crtE(忙牛儿基忙牛儿基二磷酸合酶)、crtB(八氢番茄红素(phytoen)合酶)和crtl(八氢番茄红素去饱和酶)编/5马的那些酶。亲脂化合物(尤其是如上所述的那些化合物)的生物合成所需的酶为本4页域所熟知(参阅例力口GerhardMichal，BiochemicalPathways,SpektrumAkademischerVerlagHeidelberg,Berlin(1999);D.Schomburg和D.Stephan，EnzymeHandbook1-12，SpringerBerlinHeidelberg(1996)，特此引入作为参考)。本发明所用的细菌细胞选自具有产生PHA、TAG或WE型内含体的能力的天然或重组细菌，例如尤其是产生TAG的诺卡氏菌形放线菌，尤其是红球菌属(Rhodococcus)细菌、分枝杆菌属(Mycobacterium)细菌、诺卡氏菌属(Nocardia)细菌、戈登氏菌属(Gordonia)细菌、Skermania细菌和Tsukamurella细菌；及产生TAG的链霉菌；产生WE的不动杆菌属细菌(Acinetobacter)和Alcanivorax细菌；及埃希氏菌属(Escherichia)(尤其是大肠杆菌(E.coli))、棒杆菌属(Corynebacterium)(尤其是谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum))和芽孢杆菌属(Bacillus)(尤其是枯草芽孢杆菌(B.subtilis))的重组菌林。例如，细菌细胞选自混浊红球菌PD630(DSM44193)和耻裙分枝杆菌mc2155(ATCC700084)。13根据所述靶定方法的其他实施方案，用包含所述融合蛋白的编码序列的表达构建体转化细菌细胞，所述编码序列在所述细菌宿主细胞中处于有效的启动子序列的调控之下。本发明的其他方面涉及微生物产生目的亲脂化合物的方法，所述方法包括培养包含胞内内含体的重组细菌宿主，所述胞内内含体包含至少一种参与以上述方式乾定至所述内含体的所述亲脂化合物生物合成的酶，所述方法还包括在支持产生所述亲脂化合物的条件下培养所述宿主。优选地，分离携带所述目的亲脂化合物的所述内含体并从所述内含体中回收所述目的亲脂化合物。所述亲脂化合物优选选自a)亲脂维生素、其衍生物和前体，b)如上定义的脂肪酸和脂肪族醇，或c)调味物质。本发明的其他方面涉及用于将目的蛋白质靶定至细菌细胞的胞内疏水性内含体的融合蛋白，所述融合蛋白包含与所述目的蛋白质有效连接的目标肽。所述融合蛋白尤其将目的蛋白质靶定至TAG、WE或PHA型内含体，优选靼定至TAG内含体。所述目标肽优选如上文所定义。在优选的实施方案中，所述融合蛋白包含目标分子，所述目标分子选白a)PhaPl(SEQIDNO:19)b)围脂滴蛋白A(SEQIDNO:27)c)ADRP(SEQIDNO:35)d)TIP47(SEQIDNO:31)或其功能等同物。在所述融合蛋白中，所述目的蛋白质优选为上文定义的酶。本发明的其他方面涉及编码本发明融合蛋白的核苷酸序列；包含如此处定义的至少一个融合蛋白的编码序列的表达载体，所述编码序列处于至少一种调控序列下；重组细菌宿主细胞系，其携带如上文定义的表达载体。主细胞系来自如上定义的孩i生物。2.—般术语的解释术语"油体"、"脂肪体，，或"内含体，，此处同义4吏用，并必须广义理解它们，其包含如上所述的TAG、WE和PHA型的那些。所述术语包括任何胞内结构，其为生物所用以储存能量、碳或生物合成亲脂产物所需的化合物。如此处所用的所述术语包括任何或所有三酰基甘油酯(triacylglyceride)、磷脂、蜡酯、PHA或完整结构中存在的蛋白质组分。因为它们的组成和结构，所述体可从重悬它们的不同密度的脂质中容易并快速地分离。例如，在密度高于油体密度的水性介质中，它们将在重力或应用的离心力的影响下漂浮。也可通过基于大小进行分级分离的方法(例如通过使用孔径小于它们直径的膜滤器)从存在于溶液或悬浮液中的脂质和其他固体中分离油体。术语"目标肽"包括与任何上述胞内细胞器结合的任何蛋白质或任何功能性蛋白质(即靶定其片段)。3.本发明的其它实施方案3.1本发明的蛋白质本发明不仅限于明确公开的"目标肽"或"目的蛋白质"或其融合蛋白，也扩展到其功能等同物。具体公开的酶的"功能等同物"或类似物在本发明范围内为其多种多肽，其还具有期望的生物学功能或活性，例如靶定功能或酶活性。例如，"功能等同物"指在用于酶活性测验中显示至少20%,优选50o/o，尤其优选75%，特别尤其优选高于或低于卯％如此处定义的酶的活性的酶。目标多肽的"功能等同物"是如果与此处提及的目标多肽的特定实例相比，以更高或更低效率靶定至内含体的那些。例如，目标分子的效率可通过如此处定义的免疫方法或酶促方法来分析，并在实验部分得以阐明。根据本发明"功能等同物，，也尤其指突变体，其在上述氨基酸序列的至少一个序列位置上具有不同于具体说明的氨基酸的氮基酸，但尽管如此还具有一种上述生物学活性。"功能等同物"因而包含通过一个或更多M酸添加、取代、缺失和/或倒置获得的突变体，其中所述改变可在任何序列位置中发生，假如它们导致具有本发明性质谱的突变体。也特别提供功能等同物，如果反应性模式在突变体和未改变多肽间在性质上一致，即如果例如相同底物以不同速率进行转化。合适的M酸替代的实例示于下表中原始残基取代实例laSer「gLyssnGin;HisspGluysSerInAsnluAsplyProisAsn;Gin3Leu;Val3ulie;Val《Arg;Gin;Gluetl_eu;lieheMet;Leu;TyrsrThrhrSer「pTyrTrp;Pheallie;Leu"功能等同物"在上述意义上也指所述多肽的"前体"，及所述多肽的"功能衍生物"和"盐"。"前体，，在该情况下指具有或不具有期望生物学活性的多肽的天然或合成前体。表述"盐"指本发明蛋白质分子的羧基盐及其氨基的酸加成盐。盐可以以已知方式产生并包含无机盐，例如钠、钙、铵、<铁和锌盐，和具有有机碱的盐，例如胺，如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等。酸加成AAAACGGGHk::l:TMpsTTTV16盐，例如具有无机酸的盐，如盐酸或硫酸，和具有有机酸的盐，如乙酸和草酸也涵盖于本发明中。也可使用已知技术在功能氨基酸侧基上或在它们的N末端或C末端处产生本发明多肽的"功能等同物"。这种衍生物包含例如羧,团的脂族酯、羧睃基团的酰胺(通过与氨或伯胺或仲胺反应获得)；游离氨基的N酰基衍生物，其通过与酰基反应产生；或游离羟基的O酰基衍生物，其通过与酰基反应产生。"功能等同物，，也包含从其他生物获得的多肽，及天然发生的变体。例如，可通过序列比较确定同源序列区域的范围，并且可在本发明具体参数的^出上测定等同酶。"功能等同物"也包含片段，优选包含本发明多肽的各结构域或序列基序，其例如显示了期望的生物学功能。此外，"功能等同物"为融合蛋白，其具有上述多肽序列中的一种或来自其的功能等同物，和至少一种其他在功能上不同的与功能性N末端或C末端结合的异源序列(即与融合蛋白部分之间没有实质上的相互功能损伤)。这些异源序列的非限定性实例是例如信号肽、组氨酸锚或酶。本发明也包括的"功能等同物，，是具体公开的蛋白质的同源物。根据Pearson和Lipman，Proc.Natl,Acad，Sci.(美国)85(8)，1988，2444-2448的算法计算，它们与具体公开的M酸序列具有至少60%，优选至少75%，尤其至少85%，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同源性。本发明同源多肽的百分比同源性尤其指氨基酸残勤目对于一种此处具体描述的M酸序列总长度的同一性百分比。在可能的蛋白质糖基化情况下，本发明的"功能等同物"包含去糖基化或糖基化形式;5U'务饰形式(所述形式可通过改变糖基化;漠式获得)的上文指明类型的蛋白质。可通过诱变(例如通过点突变、蛋白质的延长或缩短)产生本发明蛋白质或多肽的同源物。可通过筛选突变体(例如截短突变体)的组合数据库来鉴定本发明蛋白质的同源物。例如，可在核酸水平上通过组合诱变(例如通过S^1连接合成寡核苷酸的混合物)来产生蛋白质变体的多样数据库。有很多方法可用于从简并寡核苷酸序列产生潜在同源物的数据库。可在自动DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，然后可将合成的基因连接到合适的表达载体中。使用简并基因组使得以混合物的形式提供所有序列成为可能，所述序列编码期望组的潜在蛋白质序列。合成简并寡核苷酸的方法为本领域技术人员已知(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron39:3;Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等，(1984)Science198:1056;Ike等(1983)NucleicAcidsRes.11:477)。在现有技术中，已知若干技术用于筛选组合数据库(其通过点突变或截短产生)的基因产物，并用于筛选cDNA文库寻找具有所选性质的基因产物。这些技术可适用于快速筛选由本发明的同源物组合诱变产生的基因库。所述^L术最经常用于筛选大的基因库，其基于高流通量分析，包括在可复制的表达载体中克隆基因库、用所得载体数据库转化合适的细胞并在期望活性的检测有利于载体分离(所述载体编码其产物被检测的基因)的条件下表达组合基因。增加数据库中功能突变体频率的技术RecursiveEnsembleMutagenesis(REM)可用于与筛选实验组合以鉴定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS89:7811-7815;Delgrave等(1993)ProteinEngineering6(3):327-331)。3.2编码核酸序列本发明还涉及编码此处定义的融合蛋白的核酸序列。本发明还涉及与此处明确公开的序列具有某些程度"同一性"的核酸。两核酸间的"同一性，，指在每种情况下核酸全长范围内核苷酸的同一性，尤其是通过Informax公司(美国)的VectorNTISuite7.1程序，使用ClustalMethod(HigginsDG，SharpPM.Fastandsensitivemultiplesequencealignmentsonamicrocomputer.ComputAppl.Biosci.1989年4月；5(2):151-1)，在下面设置下计算的同一性18多重比对参数空位开方文罚分10空位延伸罚分10空位分离罚分范围8空位分离罚分关比对延迟的％同一性40残基特异性空位关亲水残基空位关转换权衡0配对比对参数FAST算法开K-tuple大小1空位罚分3窗孔大小5最佳对角线的数目5可以以已知方式通过从核苷酸结构单元化学合成(例如通过双螺旋各自重叠互补的核酸结构单元的片段缩聚)来产生此处提及的所有核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)。例如可以以已知方式通过phosphoamidite方法进行寡核苷酸的化学合成(Voet，Voet，第二版，WileyPress,NewYork,第896-897页)。合成寡核苦酸的积累、通过DNA聚合酶Klenow片段填补空位、连接反应及一般克隆技术描述于Sambrook等(1989)中，参阅下文。本发明还涉及编码一种上述多肽及它们功能等同物的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)，其例如可使用人工核普酸类似物获得。本发明涉及分离的核酸分子，其编码本发明的多肽或蛋白质或其生物活性的区段，还涉及核酸片段，其例如可用于鉴定或扩增本发明编码核酸的杂交探针或引物。本发明的核酸分子此外含有来自编码遗传区域3'和/或5'末端的非翻译序列。本发明还涉及与具体描述的核苷酸序列或其区段互补的核酸分子。本发明的核苷*列使得产生探针和引物成为可能，所述探针和引物可用于鉴定和/或克隆其他细胞类型和生物中的同源序列。此类探针或引物通常包含核苷酸序列区域，其在"严格"条件(见下文)下与本发明核酸序列的有义链或相应的反义链的至少约12个，优选至少约25个，例如约40、50或75个连续核苷酸上杂交。"分离的，，核酸分子是从存在于所述核酸天然来源中的其他核酸分子中分离的，此外，如果它由重组技术产生，则基本上没有其他细胞物质或培养基，或如果它是化学合成的，则没有化学前体或其他化学品。可通过分子生物学的标准技术和本发明提供的序列信息来分离本发明的核酸分子。例如，可使用一种作为杂交探针的具体公开的完整序列或其区段及标准杂交技术从合适的cDNA文库中分离cDNA(例如在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.第二版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中描述)。此外，可使用在该序列基础上构建的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应来分离包含一种公开序列或其区段的核酸分子。以该方式扩增的核酸可在合适的载体中克隆，并可通过DNA测序对其进行表征。本发明的寡核苷酸也可通过合成的标准方法(例如使用自动DNA合成仪)来产生。例如可通过常用的杂交技术或PCR技术从其他细菌(例如经基因组或cDNA文库)中分离本发明的核^列或其衍生物、这些序列的同源物或部分。这些DNA序列与本发明的序列在标准条件下进行杂交。"杂交"指多核苷酸或寡核苷酸在标准条件下结合几乎互补序列，而在这些条件下，在非互补配偶体间并不发生非特异性结合的能力。为此，这些序列可以90-100%互补。例如在Northern印迹或Southern印迹或20PCR或RT-PCR中使用互补序列能够特异性结合其他一条序列的性质。保守区域的短寡核苷酸有利地用于杂交。然而，使用本发明核酸的较长片段或完整序列用于杂交也是可能的。这些标准条件根据用于杂交的核酸(寡核苷酸、较长片段或完整序列)或根据使用哪种类型的核酸-DNA或RNA而不同。例如，DNA:DNA杂交体的解链温度比相同长度DNA:RNA杂交体的解链温度低约10。C。例如，根据特定的核酸，标准条件指浓度在0.1至5xSSC(1XSSC=0.15MNaCl、15mM柠檬酸钠，pH7.2)的水性緩冲液中温度为42至58。C，或额外地在5(T/。曱酰胺存在下在5xSSC,50%甲酰铵中为42°C。有利地，DNA:DNA杂交体的杂交条件是0.1xSSC，温度约为20。C至45匸，优选约在20'C至45X:间。对于DNA:RNA杂交体，杂交条件有利地为0.1xSSC，温度约为30。C至55。C，优选约在45。C至55'C间。这些用于杂交的所述温度是长度约100个核苷酸并且在不存在甲酰胺、G+C含量约50%的情况下核酸的计算的解链温度值的实例。用于DNA杂交的实验条件描述于相关遗传教科书，例如Sambrook等，1989中，并可使用本领域技术人员已知的公式，例如根据核酸的长度、杂交体类型或G+C含量来计算。本领域技术人员可从以下教科书中获得进一步的杂交信息Ausubel等(编辑)，1985,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork;Haines和Higgins(编辑)，1985，NucleicAcidsHybridization:APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford;Brown(编辑)，1991，EssentialMolecularBiology:APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford。尤其可在严格条件下进行"杂交"。这种杂交条件例如描述于Sambrook,J.，Fritsch，E.F"Maniatis，T"MolecularCloning(ALaboratoryManual),第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989，第9.31-9.57页或CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。"严格"杂交条件尤其指在42。C，由50%曱酰胺、5xSSC(750mMNaCl，75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt溶液、10%葡聚糖硫酸酯和20g/ml变性剪切鲑精DNA组成的溶液中温育过夜，然后在65。C用O.lxSSC洗涤滤膜。本发明还涉及具体公开的或衍生的核酸序列的衍生物。因此，本发明的其他核酸序列可来自此处明确公开的序列，并且可通过一个或几个核苷酸的添加、取代、插入或缺失而不同，此外还编码具有期望性质"^普的多肽。本发明还包括核酸序列，其包含所谓的沉默突变，或与具体所述的序列相比根据特定起源或宿主生物的密码子选择已经发生改变的变体，及天然发生的变体，例如其剪接变体或等位变体。它还涉及可通过保守核苷酸替代获得的序列(即所述氨基酸被相同电荷、大小、极性和/或溶解性的氨基酸替换)。本发明还涉及通过序列多态性来自具体公开的核酸的分子。这些遗传多态性因天然变异而存在于群体中的个体间。这些天然变异通常在基因核苷酸序列中产生1%至5%的变异。本发明核酸序列的衍生物指例如等位变体，其在来源氨基酸水平上具有至少60%同源性，优选在整个序列范围内具有至少80%同源性，非常特别优选至少卯％同源性(关于氨基酸水平上的同源性，应该参考上文给出用于多肽的细节)。有利地，所述同源性在序列部分区域范围内可以更高。此外，也可以将衍生物理解为本发明核酸序列的同源物，例如动物、植物、真菌或细菌同源物、截短序列、编码和非编码DNA序列的单链DNA或RNA。例如，在DNA水平上，同源物在此处明确-&开的序列中给定的完整DNA区域范围内具有至少40%,优选至少60%，尤其优选至少70%，非常特别优选至少80%的同源性。此外，将衍生物理解为例如具有启动子的融合物。添加至所述核苷酸序列上的启动子可通过至少一个核苷酸交换、至少一个插入、倒置和/或缺失(但不损害所述启动子的功能或效力)修饰。此外，启动子的效力可通过改变它们的序列来提高，或甚至用不同属生物的更有效启动子来进行完全交换。3.3本发明的构建体本发明还涉M达构建体，其含有在调节核酸序列遗传控制下的核酸序列，所述核酸序列编码本发明的多肽或融合蛋白；还涉及包含至少一种这些表达构建体的栽体。根据本发明"表达单元，，指具有表达活性的核酸，其包含如此处定义的启动子，其在与待表达的核酸或基因功能性连接后调节表达，即该核酸或该基因的转录和翻译。因此在该上下文中，其也^f皮称作"调节性核,列"。除启动子外，也可存在其他调节元件，例如增强子。根据本发明"表达盒"或"表达构建体"指表达单元，其与待表达的核酸或待表达的基因功能性连接。与表达单元相反，表达盒因而不仅包含调节转录和翻译的核酸序列，还包含因转录和翻译而表达为蛋白质的核酸序列。在本发明的上下文中，术语"表达"或"过表达"描述了微生物中一种或更多种酶的胞内活性的产生或提高，所述酶由相应的DNA编码。为此，例如在生物中插入基因、用另一个基因替换现有基因、增加所述一个基因或多个基因的拷贝数、使用强启动子或使用编码具有高活性的相应酶的基因，并且任选地将这些措施组合是可能的。此类本发明构建体优选包含来自各编码序列的5'上游启动子，和3'下游终止子序列，并任选地包含其他常用调节元件，在每种情况下其与编码序列功能连接。才艮据本发明"启动子"、"具有启动子活性的核酸，，或"启动子序列"指与待转录的核酸功能性连接的核酸，其调节该核酸的转录。在该上下文中，"功能"或"有效，，连接指例如具有启动子活性的一种核酸和待转录的核酸序列，及任选地其他调节元件(例如使核酸能够转录的核酸序列),和例如终止子以每个调节元件在所述核酸序列转录中可以行使其功能的方式连续排列。这并不必须需要化学意义上的直接连接。遗传控制序列(如增强子序列)也可在来自更远位置或甚至来自其他DNA分23子的耙序列上行使它们的功能。优选其中将待转录的核酸序列置于启动子序列之后(即在3'末端处)的排列，这使得两条序列彼此共价结合。启动子序列和待经转基因表达的核列间的距离可以少于200bp(碱基对)，或少于100bp或少于50bp。除启动子和终止子外，可提及的其他调节元件的实例是目标序列、增强子、多腺苷酸化信号、可选标记、扩增信号、复制起点等。合适的调剂序歹'j例如描述于Goeddd，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)中。本发明核酸构建体尤其包含选自此处明确提及的那些序列或其衍生物和同源物，及来自此处明确提及的氨基酸序列的核酸序列，其有利地与一个或多个用于控制(例如提高)基因表达的调节信号有效或功能性连接。除了这些调节序列外，这些序列的天然调节仍可存在于天然结构基因之前，并任选地已经被遗传改变，使得天然调节关闭并且所述基因的表达已4皮提高。所述核酸构建体也可以是更简单的设计，即在编码序列前面不插入任何额外的调节信号，而且不除去天然启动子及其调节。相反，将所述天然调节序列沉默，使得不再发生调节，基因表达得以提高。优选的核酸构建体有利地也含有一个或多个上述与启动子功能连接的增强子序列，其允许所述核酸序列增强表达。额外的有利序列(如其他调节元件或终止子)也可插入到所述DNA序列的3，末端。在构建体中可含有一个或多个拷贝的本发明核酸。构建体也可含有任选地用于在构建体上进行选择的其他标记(如抗生素抗性或营养缺陷型补体基因)。启动子或在入P^启动子(其在革兰氏阴性菌中有利扩增)涵盖的合适的调节序列的实例如cos-、tac画、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、T7陽、T5-、T3画、gal-、trc-、ara-、rhaP(rhaPBAD)SP6-、入-Pr-。在例如革兰氏阳性菌启动子中涵盖的其他有利的调节序列是ace、amy和SP02中，在酵母或真菌启动子中涵盖的是ADC1、MFoc、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。人工启动子也可用于调节。为了表达，将核酸构建体插入到宿主生物中，有利地插入载体中(例如允许基因在宿主中最优表达的质粒或噬菌体)。除了质粒和噬菌体外，也将载体理解为本领域技术人员已知的所有其他载体，例如病毒，如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬菌粒、粘粒，和线性或环状DNA。这些载体在宿主生物中可自主复制或在进行染色体复制。这些载体代表本发明的另一实施方案。合适的质粒是，例如大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223画3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-Bl、入gtll或pBdCI;诺卡氏菌形放线菌中的pJAM2;链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361;杆菌中的pUB110、pC194或pBD214;棒杆菌中的pSA77或pAJ667;真菌中的pALSl、pIL2或pBB116;酵母中的2aM、pAG誦l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。上述质粒代表了可能质粒的少量选项。其他质粒为本领域技术人员所熟知，并例如将见于教科书CloningVectors中(PouwelsP.H.等编辑Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444904018)。在栽体的其他实施方案中，含有本发明核酸构建体或本发明的核酸的载体可有利地以线性DNA的形式插到微生物中并通过异源或同源重组整合到宿主生物的基因组中。该线性DNA可包含线性化的载体(如质粒)，或仅包含本发明的核酸构建体或核酸。为了异源基因在生物中的最优表达，根据生物中使用的特定密码子选择来改变核酸序列是有利的。可在所述生物的其他已知基因的计算机评估基础上容易地确定密码子选择。本发明表达盒的产生基于合适的启动子与合适的编码核苷酸序列及终止子信号或多腺苷酸化信号融合。为此使用常见的重组和克隆技术，如在T，Maniatis,E.RFritsch和J.Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)及T.J.Silhavy，M丄.Berman和L.W.Enquist，ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)及Ausubel，F.M.等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.和WileyInterscience(1987)中描述的。将重组核酸构建体或基因构建体有利地插入宿主特异性载体中用于在合适的宿主生物中表达，以允许基因在宿主中进行最优表达。载体为本领域技术人员所熟知，并将见于例如"CloningVectors"(PouwelsP.H.等，Publ.Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)。3.4根据本发明可使用的宿主根据上下文，术语"微生物"指初始樣史生物(野生型)或根据本发明遗传修饰的微生物，或指这两者。根据本发明，术语"野生型"指相应的初始微生物，并且不需要必须对应于天然发生的生物。通过本发明的载体，可产生重组孩t生物，其例如已经转化有本发明的至少一个栽体，并可用于产生本发明的多肽。有利地，上文描述的本发明重组构建体插入到合适的宿主系统中并在其中进行表达。优选地，使用本领域技术人员熟悉的常见克隆和转染方法(例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等)以保证所述核酸在各表达系统中的表达。合适的系统描述于例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.Ausubel等，Publ.WileyInterscience,NewYork1997，或Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual.笫二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中。原则上，可i/v为所有原核生物是本发明核酸或核酸构建体的重组宿主生物。有利地j吏用细菌作为宿主生物。它们优选选自天然的或重组细菌，所述细菌具有产生PHA、TAG或WE型内含体的能力，尤其是产生TAG的诺卡氏菌形放线菌，尤其是红球菌属、分枝杆菌属、诺卡氏菌属、戈登氏菌属、Skermania和Tsukamurella;及产生TAG的链霉菌；产生WE的不动杆菌属和Alcanivorax;及埃希氏菌属(尤其是大肠杆菌)、棒杆菌属(尤其是谷氨酸棒菌)和杆菌属(尤其是枯草杆菌)的重组菌抹。这样，本发明的意指或多种宿主生物优选含有至少一种该发明中描述的核酸序列、核酸构建体或载体，其编码(产生)根据上文定义的酶活性。根据宿主生物，以本领域技术人员熟悉的方式生长或培养本发明方法中所用的生物。通常，微生物在液体培养基中生长，所述液体培养基含有通常是糖形式的碳源、通常是氮的有机来源形式的氮源(如酵母提取物或盐，如硫酸铵)、微量元素(如铁、锰和镁盐)和任选地维生素，温度在0'C至100。C之间，优选在10。C至60。C之间，并进行氧通气。液体营养培养基的pH可维持在固定值，即在生长过程中接受调整或不接受调整。可分批式、半分批式或持续进行生长。可在发酵开始，或随后半持续或持续提供营养物。3.5重组产生亲脂化合物本发明还涉及通过培养产生融合蛋白的微生物(其表达本发明的融合蛋白)并从培养物中分离期望的化合物来制备本发明亲脂化合物的方法，其中在允许酶促产生所述亲脂化合物的条件下进行培养。也可以在工业规模上以该方式制备所述化合物，如果想要的话。所述微生物可表达一种或更多种融合蛋白，所述融合蛋白提供所需的酶活性或用于合成期望的亲脂化合物的活性。由于酶活性和脂肪体的非常接近，预计所产生的亲脂产物将与脂肪体结合(即掺入和/或吸附到所述脂肪体中)。这将改变酶促反应的平衡以进一步向期望的产物方向进行。此外，与脂肪体结合的产物可更容易地从大批生物质中分离，并通过常规纯化方法(例如提取和色镨)进行纯化。在开始生物合成期望的亲脂产物之前，注意在细菌细胞内提供充足的脂肪体当然是有益的。这可通过在所谓的储存条件(例如在所附实施例中对特定菌林阐明的条件)下培养细胞方便地(conviently)完成。然后同时诱导所需融合蛋白的重組表达，使得具有足够酶促活性靶定至脂肪体。在细菌细胞不能(完全不能或不能以足够量)产生酶促产生期望的亲脂终产物所需的底物和/或共同底物的情况下，可向培养基中加入所需离析物。可以用分批法或补料分配式方法或重复补料分配式方法连续或不连续地培养根据本发明所用的微生物。培养的已知方法的综述将见于Chmiel(Bioprocesstechnik1.EinftihrungindieBioverfahrenstechnik(GustavFischerVerlag,Stuttgart,1991))的教科书或Storhas(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen(ViewegVerlag，Braunschweig/Wiesbaden,1994》的教科书。待使用的培养基必须以适当方式满足特定菌林的需要。在"ManualofMethodsforGeneralBacteriology"oftheAmericanSocietyforBacteriology手册(WashingtonD.C.,美国，1981)中给出了对用于多种微生物的培养基的描述。可根据本发明使用的这些培养基通常包含一种或更多种碳源、氮源、无才几盐、维生素和/或^:量元素。优选碳源是糖，如单糖、二糖或多糖。非常好的碳源是例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。糖也可以通过络合物(如糖蜜)或来自糖精炼的其他副产物添加到培养基中。添加多种碳源的混合物也是有益的。碳的其他可能来源是油和脂肪(如大豆油、葵花子油、花生油和椰子油)、脂肪酸(如软脂酸、硬脂酸或亚油酸)、醇(如甘油、甲醇或乙醇)和有机酸(如醋酸或乳酸)。氮源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的物质。氮源的实例包括氨气或铵盐(如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵)、硝酸盐、尿素、氨基酸或氮的复合物来源(如玉米浆、豆粉、大豆蛋白质、酵母提取物、肉膏等)。氮源可单独使用或作为混合物使用。可在培养基中存在的无机盐化合物包含钓、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。不仅无4几含石克化合物(例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物)，而且有机硫化合物(如硫醇和巯基化合物)可用作石危源。磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可用作辨源。28可将螯合剂加入培养基中以维持溶液中的金属离子。尤其合适的螯合剂包含二羟基苯酚(dihydroxyphenol)(如儿茶酚或原儿茶酸盐)，或有机酸(如柠檬酸)。根据本发明所用的发酵培养基通常也含有其他生长因子(如维生素或生长促进剂)，其包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡喷醇。生长因子和盐通常来自培养基的复杂成分，如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。此外，可将合适的前体加入培养基中。培养基中化合物的精确组成主务农赖于特定的实验，并且必须根据每一特殊情况单独确定。关于培养基优化的信息可见于教科书"AppliedMicrobiol.Physiology,APracticalApproach"(Publ.P.M.Rhodes,P.F.Stanbury，IRLPress(1997)第53-73页，ISBN0199635773)。也可从商业供应商(如Standard1(Merck)或BHI(Brainheartinfusion,DIFCO)等)获得生长培养基。通过加热(1.5巴，121°C,20分钟)或通过过滤除菌将培养基的所有成分灭菌。所述组分可一起进行灭菌，或如果需要可单独进行灭菌。培养基的所有成分在生长的开始时就存在，或任选地可连续或通过补料分配式加入。培养物的温度通常在15。C至45。C之间，优选在25'C至40X:之间，并可保持恒定或在实验过程中变化。培养基的pH值应该在从5至8.5的范围内，优选在7.0左右。可在生长过程中通过添加碱性化合物(如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水)或酸性化合物(如磷酸或硫酸)来控制用于生长的pH值。消泡剂(例如脂肪酸聚乙二醇酯)可用于控制发泡。为了维持质粒的稳定性，可向培养基中加入具选择作用的合适物质(例如抗生素)。向培养物中加入氧气或含氧气体混合物(例如环境空气)以维持有氧条件。培养物的温度通常为20。C至45°C。连续培养直至已形成最大量的期望产物。这通常在10小时至160小时内完成。任选地可通过高频超声；高压(例如在弗氏压碎器中)；渗透；去污剂、分解酶或有机溶剂的作用；通过勻浆器或通过若干种所列方法的组合来破碎细胞。以下实施例仅用于阐明本发明。对本领域技术人员显而易见的多数可能变型也在本发明范围内。实验部分1.材料和方法a)菌林、质粒和培养条件大肠杆菌菌林XL1blue细胞(Stratagene)和S17-l细胞(Simon等22a])在Luria-Bertani(LB)培养基中进行常规培养(Sambrook等[21)。混浊红球菌PD630细胞(DSM44193，Alvarez等[2)和耻垢分枝杆菌mc2155细胞(ATCC700084，Snapper等[23)在StandardI(Stdl)培养基(Merck)中进行培养。为了促进TAG的生物合成和内含物的形成，将细胞转移至含有0.1gr1NH4C1的无机盐培养基(MSM)中并培养24、48和72小时(Schlegel等，[22)。此外，耻垢分枝杆菌mc2155也在Sauton，s培养基(SM)(Darzins，1958)中进行培养。为了促进SM中TAG的积累，将磷酸钾浓度降至0.05gr1。对于混浊红球菌PD630或耻垢分枝杆菌mc2155，分别以葡糖酸钠或葡萄糖(10g1")向MSM和SM中提供碳。为了维持质粒pJAM2和衍生物，根据Sambrook等[21]以50照ml"的终浓度^f吏用卡那霉素。通过向各培养物中添加0.5%(w/v)乙酰胺实现对pJAM2和衍生物乙酰胺酶(ace)启动子的诱导(Triccas等[29])。所有液体培养均在装配有挡板的Erlenmeyer摇瓶中分别于37°C(大肠杆菌)或30°C(混法红球菌PD630和耻垢分枝杆菌mc2155)进行。通过加入18gl"琼脂来制备固体培养基。b)电转化感受态细胞的制备在2550型电转化仪(Eppendorf画Netheler画Hinz,Hamburg,德国)中通过电穿孔将质粒转移至混浊红球菌PD630和耻垢分枝杆菌mc2155中。对于混浊红球菌PD630,如Kalscheuer等[IO]描述进行电转化感受态细胞的制备，对于耻垢分枝杆菌mc2155，如Snapper等[23]描述进行电转化感受态细胞的制备。c)细胞粗提物、可溶性部分和TAG内含物的制备混浊红球菌和耻垢分枝杆菌的细胞在如上述具有降低铵浓度的MSM中生长，离心(20分钟，6000xg,4°C)收集并重悬于两倍体积的0.1M磷酸钠緩冲液(pH7.5)中。三次经过弗氏压碎器(1000MPa)后，获得粗提物。为了获得可溶性部分，通过在4。C,16000xg离心30分钟，随后在SorvallDiscovery90SE超速离心机中4。C，100000xg离心90分钟从粗提物中除去细胞碎片。通过100000xg超速离心步骤沉淀膜碎片，并随后在O.lmM磷酸钠緩冲液(pH7.5)中洗涤后重悬于相同的緩沖液中。通过向不连续甘油梯度顶部加入l-2ml粗提物来制备TAG内含物。不连续甘油梯度由用0.1M磷酸钠緩冲液(pH7.5)配制的22、44和88%(v/v)的甘油各3ml组成。梯度在4'C,170000xg离心1小时。抽取TAG内含物并随后在0.1M磷酸钠緩冲液(pH7.5)中洗涤两次用于进一步分析。d)在分离的TAG内含物上测定P-半乳糖普酶活性如上文描述，制备分离自作为对照的携带pJAM2::phaPl-lacZ或pJAM2::phaPl的混浊红球菌PD630细胞的TAG内含物。将内含物(10mg湿重)重悬于100]iil的0.1M磷酸钠緩冲液(pH7.5)中，随后加入由17ml0.1M磷酸钠緩冲液(pH7.5)、3ml邻硝苯基-(5-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)溶液(8%,w/v)、1mM氯化镁、45mM卩-巯基乙醇和4plSDS溶液(20%，w/v)组成的650pl反应溶液。试样(assay)在37°C温育30分钟。为了终止反应，加入400|^11M碳酸钠。其后，通过过滤从试样中除去TAG内含物，并在405nm处测定过滤物的吸光度以分析剪接的ONPG的量。为了计算酶活性，4.6mM_1cm"的s405nm用于各产物ONP(邻位硝基苯酚)。由于去除所述内含物后，试样中不会发生ONPG的进一步剪接，因此测定的P-半乳糖苷酶活性基本上与TAG内含物相关。e)免疫印迹分析根据相当蛋白质浓度，将已知量的细胞裂解物或亚细胞部分溶解在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶中，并根据Towbin等[28]的方法将其转移到聚偏乙烯(PVDF)膜上。用丽春红S将膜上的蛋白质染色并31分别使用多克隆鸡抗玉米油质蛋白IgG[19、多克隆兔抗鼠PATIgG(C.Londos惠赠)、在豚鼠中针对代^ATIP47(GP30;ProgenBiotechnik)的N末端(氨基酸1-16)的合成多肽产生的多克隆抗体、多克隆兔抗PhaPlIgG(Wieczorek等，[31a)和针对代表人ADRP(AP125;ProgenBiotechnik)的N末端(^J^酸5-27)的合成肽的小鼠单克隆抗体进行免疫分析。分别使用山羊抗兔、抗鼠或抗鸡IgG碱性磷酸酶缀合物，并将5-溴_4-氯-3-丐1咮-磷酸二钾/氯化硝基四氮唑蓝(Sigma)转化成不溶的深色产物来使IgG在免疫印迹上可见。f)显微镜检查通过在含有0.5照ml"尼罗红(二甲基亚砜中储存液0.5照ml")的0.1M磷酸钠緩冲液(pH7.5)中于4。C温育样品30分钟来制备尼罗红标记的细胞和分离的TAG内含物。标记后，细胞和内含物通过在4°C,16000xg离心而沉淀，并重悬于O.lM磷酸钠緩冲液(pH7.5)中。通过静电作用将细胞和TAG内含物附着到载玻片上，所述载玻片通过聚(a-L-赖氨酸)(PL)氬溴化物(hydrobromide)的吸附而带正电荷。为了用PL氬溴化物包被玻璃表面，用自来水彻底冲洗干净的载玻片，将其浸入甲醇中，并用软化水再次沖洗。然后加入一滴0.01%(w/v)PL氢溴化物溶液。在空气中干燥后，用软化水冲洗载玻片，并加上一滴细胞悬浮液或TAG内含物。15分钟后，用软化水冲洗包被的载玻片，以去除松弛附着的细菌或TAG内含物，并将其转移至荧光显微镜下。在配有lOOx/1.4NA油浸Plan-Apochromat物镜和4x或2.5x辅助镜筒透镜(auxiliarytubelens)的ZeissAxioImagerMl正置宽视野荧光显微镜上以相差(PH)或微分干涉差(DIC)模式检查载玻片。通过使用peltier冷却AxioCamMRm16比特数字单色电荷耦合器件照相机(CCD)来采集图像。2/3"大小的CCD芯片由1388(H)x1040(V)像素组成，每一个大小为6.45x6.45nm。使用ZeissHBO103W/2高压汞弧灯来激发尼罗红和eGFP荧光。通过使用发射带通滤色片在EX/EM470±40/525±50nm处对eGFP进行单通道和多通道荧光图像的记录，并在EX/EM550±3225/605±70nm处对尼罗红进行单通道和多通道荧光图像的记录。通过使用高精确度可移动的xyz镜台在以0.275pm增量区分的聚焦位置处采集图像来产生图像叠层(该图像叠层由覆盖整个z轴光学切面的45-96个位面组成)。才艮据样品和萸光通道，曝光时间在50到1000毫秒间变动以获得适于去叠合的足够饱和的图像。为了减少光漂白，通过Zeiss高速开闭器装置来控制光照。小心避免待记录的区域曝光于荧光光源直至已经开始记录并且已经调整好照相机以提供最佳图像。将图像存储为zvi数据格式用于其后的图像数据处理。使用ZeissAxiovision4.5软件获得(aquired)所有图像。其中指出，使用ZeissAxioVision3D去叠合模块进行所获(aquired)图像的限制性反复去叠合。所有图像处理均在Siemens2.8GHzLineCelsiusR630工作站上进4亍。g)冷冻断裂、冷冻切片和免疫金标记对于冷冻切片，通过加入等体积的用磷酸盐緩沖盐水(PBS)(pH7.4)配制的4%(w/v)低聚甲醛预先固定细胞悬浮液5分钟。细胞在相同緩冲液中短暂洗涤并在4%(w/v)低聚甲醛中进一步固定l小时，随后在含有作为冷冻保护剂的0.9M蔗糖和90%(w/v)聚乙烯吡咯酮25(用50mM碳酸钠(pH7.0)进行緩冲)的4%(w/v)低聚甲醛中温育l小时。通过离心将细胞浓缩，置于小体积冷冻保护剂中的针上，并冻于液氮中。如Tokuyasu[17]描述制作超薄切片。对于冷冻断裂，通过在4°C,6，000xg离心30分钟沉淀细胞悬浮液(700ml)，重悬于30%(w/v)甘油中(<30秒)，固定在用液氮冷却的Freon22中，并在-100°C，BA310冷冻断裂单元(BalzerAG)中冷冻断裂。通过在38。和卯°角度处铂碳的电子束蒸发立即制备新断裂细胞的复制物，并使厚度为2到20rnn。所述复制物在5%(w/v)SDS中温育过夜以除去除直接附着到复制物上的那些分子之外的细胞物质，在蒸馏水中洗涤，并在免疫染色之前在5%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)中短暂温育。对于冷冻断裂复制物和冷冻切片的免疫染色，使用如上面提及的相同第一抗体，随后分别使用驴抗豚鼠18nm金缀合物、山羊抗鼠12nm金缀合物或山羊抗兔12nm金缀合物(均来自JacksonImmunoresearch)。此外，为了通过它们的eGFP标签揭示eGFP融合蛋白的细胞分布，使用在兔中产生的针对eGFP的第一抗体(BDBiosciences)。在没有第一抗体情况下制备的对照样品上基本没有金颗粒。2.合成实施例合成实施例1:phaPl编码构建体的制备a)克隆pJAM2的ace启动子下游的phaPl使用标准的分子生物学方案(Sambrook等，[21)。首先将所有聚合酶链式反应(PCR)产物克隆至TA载体(pGEM-TEasy;Promega)中。连接产物首先通过DNA测序进行控制，然后在将它们克隆至表达载体pJAM2(其代表含1.5kbpace启动子区(SEQIDNO:17)的大肠杆菌-分枝杆菌/红球菌穿梭载体)之前用适当的限制酶消化释放(Triccas等，[29])。对于亚克隆，将限制酶识别位点(下划线，见下文)掺入寡核苷酸的序列中。使用寡核苷酸phaP1-5'(5'-AAAGGATCCATCCTCACCCCGGAACAAG丌-3')(SEQIDNO:1)和phaP1-3'(5'画AAAGGATCCCGATATGCTTTGCCAACGGAC-3')(SEQIDNO:2).，通过PCR从富养罗尔斯通氏菌H16基因组DNA中扩增不含天然起始密码子和终止密码子(582bp)的PhaPl(SEQIDNO:18)的编码区。随后，将PCR产物共线性克隆至pJAM2ace启动子的BamHI位点中。由此产生与amiE基因前6个密码子有功能的框内融合，生成pJAM2::phaPl。构建的融合物中phaPl基因缺少其自身的终止密码子，但在pJAM2的His6-标签接头后含有终止密码子。因此，氨基酸SRHHHHHH出现在所述蛋白质的C末端区。b)构建phaPl-eg印和phaPl-lacZ融合表达质粒使用携带天然终止密码子(双下划线)的PCR引物egfp-5'(5'-AAATCTAGAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3')(SEQIDNO:3)和egfp-3'〖5'AAATCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG曙3')(SEQIDNO:4),，从质粒pEGFP-N3(BDBioscienceClontech)中扩增不^^始密码子的720-bp片段，所述片段代表来自7jc母(Aequoriavictoria,SEQIDNO:20)的完整eGFP基因。然后将PCR产物共线性克隆至pJAM2::phaPlace启动子，以及phaPl下游的Xbal位点中，生成pJAM2::phaPl-egfp。为了研究对照实验中未融合的eGFP的表达和分布，通过BamHI限制酶切和重新连接将pJAM2::phaPl-egfp的phaPl部分从表达质粒上释放，生成pJAM2::egfp。对于pJAM2::phaPl-lacZ的构建，使用携带天然终止密码子(双下划线)的PCR引物lacZ-5'(5'-AAATCTAGAACCATGATTACGGATTCACTGG-3')(SEQIDNO:5)和lacZ-3'(5'-AAATCTAGATTATTTTTGACACCAGACCAACTG画3')(SEQIDNO:6)从E.coliS17-l的基因组DNA中扩增lacZ的不含天然起始密码子的3075-bp编码区。然后将PCR产物共线性克隆至pJAM2::phaPlace启动子，以及phaPl下游的Xbal位点中。合成实施例2:制备编码围脂滴蛋白A、tip47、ADRP、油质蛋白和油质蛋白D的构建体a)克隆pJAM2ace启动子下游的增强gfp(egfp)使用标准的分子生物学方案[21]。首先将所有聚合酶链式反应(PCR)的产物克隆至TA载体(pGEM-TEasy;Promega)中，通过DNA测序进行控制，然后在将它们克隆至表达载体之前用适当的限制酶消化释放(见下文)。为了利于亚克隆，将限制酶识别位点(下划线，见下文)掺入寡核苷酸序列中。通过^f吏用携带天然终止密码子(双下划线)的PCR引物印fp-5'(5'-AAATCTAGAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3')(SEQIDNO:3)和egfp画3'，〖5'AAATCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG陽3')(SEQIDNO:4)从pEGFP-N3(BDBioscienceClontech)中扩增不^^始密码子的720个碱基对(bp)的片段，其含有egfp(SEQIDNOJ0)的完整编码序列。然后将PCR产物共线性克隆至pJAM2(其为含有1.5-kbpace启动子区[29](SEQIDNO:17)的大肠杆菌-分枝杆菌/红球菌穿梭载体)ace启动子的Xbal35位点中，以产生与amiC基因前6个密码子有功能的框内融合，并生成pJAM2::egfp。b)构建脂肪体蛋白质-eGFP融合物表达质粒扩增各蛋白质不含其天然起始密码子和终止密码子的编码区，以利于产生功能融合物构建体。使用寡核苷酸perA-5'(5'画AAAAGTACTTCAATGAACAAGGGCCCAACC-3')(SEQIDNO:7)和perA-3'(5'-AAAAGTACTGCTCTTCTTGCGCAGCTGGC-3')(SEQIDNO:8).通过PCR从携带鼠围脂滴蛋白AcDNA[8的逆转录病毒表达载体pSRaMSVtkneo中扩增鼠围脂滴蛋白A编码区(1551bp)(SEQIDNO:26)。使用寡核苷酸tip47-5'(5'-AAAGGATCCTCTGCCGACGGGGCAGAGGC画3')(SEQIDNO:9)和tip47-3'(5'-AAAGGATCCTTTCTTCTCCTCCGGGGCTT-3')(SEQIDNO:10).从质粒pQE31[7]中扩增人TIP47cDNA(1302bp)(SEQIDNO:30)。使用寡核苷酸adrp-5'(5'-AAAAGTACTAGTTTTATGCTCAGATCGCTGG-3')(SEQIDNO:11)和adrp-3'(5'-AAAAGTACTGCATCCGTTGCAGTTGATCCAC-3')(SEQIDNO:12).从C.Londos(细胞与发育生物学实验室，国家健康研究所(Laboratoryofcellularanddevelopmentalbiology,NationalInstitutesofHealth)，Bethesda)提供的ADRPcDNA片段中扩增人ADRPcDNA(1311bp)(SEQIDNO:34)。将包含PAT家族基因的每一PCR产物共线性克隆至pJAM2::egfpegfp区域上游ace启动子的BamHI或Seal位点中，分别产生pJAM2::perAmur-egfp、pJAM2::tip47hum-egfp和pJAM2::adrphum-egfp。使用寡核苷酸oleo-5'(5'-AAAGGATCCGCGGACCGCGACCGCAGCGG-3')(SEQIDNO:13)和oleo-3'(5'-AAAGGATCCCGAGGAAGCCCTGCCGCCG-3')(SEQIDNO:14)从质粒pL2土[19中扩增代表18kDa玉米油质蛋白(SEQIDNO:38)的cDNA编码区的567bp片段，然后将其克隆至pJAM2::egfp的BamHI位点中，产生pJAM^:oleo呵s-egfp。类似的，使用寡核苷酸0leoHD-5'(5'-AAAGGATCCGCGCTGACGGTGGCGACGCTG國3')(SEQIDNO:15);和oleoHD-3'(5'-AAAGGATCCCGCCGTGTTGGCGAGGCACGT-3').(SEQIDNO:16)通过PCR构建与截短的玉米油质蛋白融合的eGFP，所述截短的玉米油质蛋白仅代表其中间疏水结构域(SEQIDNO:39的第48-113位^J^酸)。该质粒净皮称为pJAM2::oleoHD-egfp。然后，通过Xbal限制酶和重新连接从每一构建的表达质粒上释放每一个融合物的egfp部分，分别产生pJAM2::perA隨、pJAM2::tip47hum、pJAM2::adrphum、pJAM2::oleomays和pJAM2::oleoHD。因为每一个构建的融合物中的脂肪体蛋白质基因缺少其自身的终止密码子，但在pJAM2的His6-标签接头序列之后含有一个终止密码子，所以氨基酸SRHHHHHH添加到各蛋白质的C末端。3.表达实验A.使用phaPl的实验实施例Al:phaPl在耻垢分枝杆菌mc2155和混浊红球菌PD630的重组菌林中的表达和翻译产物在亚细胞部分中的分布为了测定egfp、phaPl和phaPl-egfp在重组;故线菌中的异源表达，通过在方法部分中描述的SDS-PAGE和Western印迹分析在铵减少条件下生长72小时的细胞的细胞粗提物和细胞部分。当用0.5%(w/v)乙酰胺诱导时，携带pJAM2::phaPl的耻垢分枝杆菌细胞的电泳图显示出表观分子量为25kDa的额外蛋白质。该分子量(MW)很好地对应于His6-标记的PhaPl的计算分子量。使用抗PhaPlIgG在相应的Western印迹上容易地识别His6-标记的PhaPl。然而，His6-标记的PhaPl的合成相比于合成52kDaPhaPl-eGFP融合物和未融合的27kJDAeGFP的菌林显著较少，所述未融合的27kDAeGFP通过使用抗PhaPl和抗eGFPIgG也在Western印迹上得以证实。所有IgG在未经诱导的培养物的细胞粗提物中未识别到蛋白质，说明在耻垢分枝杆菌中重组蛋白质的合成受添加乙酰胺的严格调控。因为在携带pJAM2::phaPl和pJAM2::egfp的细胞的电泳图和Western印迹中37没有检测到较低MW的产物，所以这些蛋白质似乎对细胞质中的蛋白水解是稳定的。然而，在耻垢分枝杆菌pJAM2::phaPl-egfp的粗提物上应用抗PhaPl和抗eGFPIgG揭示了融合蛋白发生微弱的剪接。此外，耻垢分枝杆菌细胞粗提物的所有SDS-PAGE电泳图显示了44kDa的额外蛋白质，其很可能代表了当用0.5%(w/v)乙酰胺诱导细胞时染色体编码的乙酰胺酶(图1A)。通过延长表达时间至96小时也证实了重组耻垢分枝杆菌中PhaPl的胞内稳定性(图1B)。我们设法确定PhaPl在耻垢分枝杆菌重组细胞的亚细胞部分中的分布。不幸的是，甚至当乙酰胺浓度降至0.05%时，用乙酰胺诱导细胞也会导致TAG积累和TAG内含物数量的严重减少(图1C)。这可能是因为染色体编码的乙酰胺酶对诱导物进行剪接，因而为细胞生长提供了足够的铵。为在如方法部分中描述的SM中磷酸盐受限的条件下实现TAG内含物的足够积累的尝试因发育不全和很少的脂质积累而失败(数据未显示)。为了绕过该障碍，随后将所有构建的质粒引入至混浊红球菌中。与耻垢分枝杆菌相反，混浊红球菌相应重组菌林的粗提物的SDS-PAGE电泳图揭示与从在铵减少MSM中生长72小时的野生型(甚至在用0.5%(w/v)乙酰胺诱导的细胞)获得的粗提物相比，没有额外的可见蛋白质条带，说明由耻垢分枝杆菌ace启动子控制的基因表达在混法红球菌中显著较低。然而，根据在重组耻垢分枝杆菌中获得的结果，抗PhaPlIgG在Western印迹中识别从携带pJAM2::phaPl的细胞粗提物中获得的25kDa蛋白质，虽然泽漆皂戒的免疫识别显著低于在重组耻垢分枝杆菌中的识别。与在耻垢分枝杆菌中类似，在混浊红球菌中没有检测到泽漆皂甙的降解产物。类似地，如通过应用抗eGFPIgG证实，分别在携带pJAML:egfp和pJAM2::phaPl-egfp的细胞粗提物的Western印迹上容易地识别eGFP和PhaPl-eGFP融合物(图2)。与耻垢分枝杆菌相反，向培养物中添加0.5%(w/v)乙酰胺并不影响混浊红球菌中TAG的积累(未显示)。为了研究PhaPl、eGFP和PhaPl-eGFP融合物在混浊红球菌中的细胞分布，将诱导细胞的粗提物分级分离为可溶性级分、膜级分和代表TAG内含物的级分。在混浊红球菌pJAM2::phaPl各级分的Western印迹上，在代表TAG内含物的级分中通过抗PhaPlIgG识别泽漆皂戒，然而在可溶性级分中没有信号出现。这表明在重组混浊红球菌中PhaPl与TAG内含物结合。也通过在携带pJAM2::phaPl-eg印的菌林的Western印迹上使用抗eGFPIgG对PhaPl-eGFP融合物进行定位，证实了混浊红球菌的细胞部分中PhaPl分布结果。在该重组菌林中，所述融合蛋白也只出现在代表TAG内含物的级分中。我们也设法在所述重组菌林的总膜级分的电泳图中定位PhaPl和其eGFP融合物，但失败了(数据未显示)。如期望，未融合的eGFP仅定位在携带pJAM2::egfp的对照菌林的可溶性级分中(图2)。实施例A2:PhaPl-eGFP融合蛋白在重组混浊红球菌PD630和耻祐分枝杆菌mc2155中的分布。为了证实混浊红球菌中PhaPl-eGFP与TAG内含物的结合，通过荧光显微镜，在Stdl培养基中生长并也当细胞质中发生大的胞内TAG内含物形成时允许TAG积累的条件下，在铵减少MSM中生长24、48和72小时的细胞中研究了融合蛋白的分布。所述融合蛋白的荧光在它们形成的所有阶段均主要与TAG内含物结合。然而在Stdl培养基中生长的细胞中，荧光与质膜处的新生TAG内含物结合，而在铵减少MSM中生长24、48和72小时的细胞中它主要与细胞质中的成熟TAG内含物结合(图3A-D)。如从Stdl生长细胞获得的图像的限制性重复去叠合(deconvolution)揭示，焚光也以相同程度出现在细胞壁和质膜区域。然而，当与胞内TAG内含物的荧光相比时，这些区域的荧光弱得多(见图3A中的去叠合图像)。在铵减少MSM中72小时后，细胞内充满明亮的荧光TAG内含物。实际上，去叠合后，这些细胞中大的TAG内含物经常显示荧光环，表明融合蛋白在内含物表面上的定位(图3D)。融合蛋白的荧光在TAG积累的所有阶段始终与尼罗红焚光可区分，其除了标记TAG内含物，也清楚地标记细胞膜(图3A-D)。细胞破碎后，观察到PhaPl-eGFP的荧光与分离的TAG内含物结合，39表明融合蛋白与所述内含物稳定结合。与在完整细胞中的观察结果类似，在去叠合图像中，分离的内含物在它们外周显示绿色荧光环(图3E)。与此相反，当在没有尼罗红标记的情况下进行观察时，来自表达未融合eGFP的细胞的TAG内含物显示没有荧光(未显示)。表达未融合eg印的细胞(其作为阴性对照)在整个细胞质中显示弥散的绿色焚光，然而通过它们的尼罗红荧光可容易地检测到胞内TAG内含物(图3F)。表达未融合eg印的耻垢分枝杆菌mc2155细胞在细胞质中显示弥散的荧光，这与在混浊红球菌PD630中观察到的现象类似(图4A)。对应于重组混浊红球菌PD630中的结果，在不用乙酰胺诱导的携带pJAM2::phaPl-egfp的耻垢分枝杆菌mc2155细胞中，在它们形成的任何阶段的TAG内含物位置上观察到荧光，表明泽漆皂甙也靶定至内含物。然而，因为耻垢分枝杆菌mc2155中TAG内含物的数量和大小从未达到混浊红球菌PD630中那些内含物的数量和大小，TAG内含物仅作为荧光离散点出现在细胞质中(图4B-D)。相反，在乙酰胺诱导的细胞中，在细胞中出现非常强的荧光，其可能与亚细胞结构无关(数据未显示)。这4艮可能是因为细胞中高丰度的融合蛋白。实施例A3:冷冻切片的免疫金标记为了研究PhaPl-eGFP仅靶定至混浊红球菌PD630中TAG内含物的表面还是也靶定至细胞的其他成分，通过包埋后免疫金标记将融合蛋白固定在冷冻切片上。从在储存条件下生长72小时的重组细胞中制备超薄冷冻切片。为了免疫金标记冷冻切片，兔抗PhaPlIgG与山羊抗兔IgG金缀合物组合使用。在冷冻切片的混浊红球菌PD630细胞中，TAG内含物呈现为内部结构很少的近乎球形、电子半透明的区域。在内含物的表面发现了PhaPl-eGFP的强标记，而在细胞质中几乎没有观察到标记。在质膜处也检测到标记。然而，细胞周围的PhaPl-eGFP标记的浓度低于TAG内含物表面处的浓度(图5)。球菌PD630中TAG内含物上的固定一旦证实了天然PhaPl及PhaPl-eGFP融合物与TAG内含物的结合，则研究PhaPl是否可用作在TAG内含物表面固定活性酶的锚定物。为此，将作为报告基因的大肠杆菌LacZ与phaPl的3，末端区的融合物构建到质粒pJAM2中。将所得质粒pJAM2::phaPl-lacZ转移至混浊红球菌PD630中，并将细胞培养72小时。随后，分离所述TAG内含物并用于ONPG的酶促转化。对于对照实验，携带pJAM2::phaPl的细胞以相同方式使用。含有对照菌林的TAG内含物的样品仅显示低的P-半乳糖苷酶活性。因为混浊红球菌PD630也表达染色体编码的P-半乳糖苷酶，预计在对照样品中也具有低的酶活性。此外，显示多种胞质蛋白质非特异性结合TAG内含物，所述蛋白质然后与所述内含物共纯化(Kalscheuer等[10a];Waitermann&Steinbtichel[31])。然而，在含有从phaPl-lacZ表达菌林中分离的TAG内含物的样品中酶活性显著很高。当从分析物中去除TAG内含物时，ONPG的转化在所有实验中立即结束。该结果排除了游离P-半乳糖苷酶分子的参与，其通过纯化步骤不能被去除(图6)。这些数据证实LacZ通过PhaPl作为锚定物稳定固定于细菌TAG内含物上。表达实施例的讨论-部分A在实验的该部分中，显示转化有富养罗尔斯通氏菌H16phaPl基因的混浊红球菌PD630和耻垢分枝杆菌mc2155重组菌林的细胞合成泽漆皂戒PhaPl。这些实验的关键发现是所述泽漆皂武在细胞中保持稳定，并且该PhaPl和PhaPl融合蛋白靶定至TAG内含物。这是关于泽漆皂戒蛋白质结合TAG内含物的第一例报道。在富养罗尔斯通氏菌H16中，PhaPl与PHB颗粒部分严密结合，并且它的表达因转录抑制物PhaR施加的调控作用而与PHB合成高度相关(P6tter等[18d])。仍然不曾鉴定到将泽漆皂甙靶定至富养罗尔斯通氏菌H16中PHB颗粒的PhaPl的基序。然而，PHB颗粒及TAG内含物分别具有聚酯或脂质的疏水核，认为所述核被单层磷41月旨包围(deKoning&Maxwell[6b；Hocking&Marchessault[9a；Mayer&Hoppert[16a];WSltermann等[30)。该常见结构允许PhaPl耙定至PHB颗粒，并也明显地粑定至如这些实验中证实的TAG内含物。因此，本数据表明PhaPl靶定至富养罗尔斯通氏菌H16中PHB颗粒很可能不受泽漆皂甙与颗粒中多聚物的直接相互识别的介导。该结果表明PhaPl明显具有结合任何类型疏水内含物的能力，与PHA或不同疏水性化合物是否存在于所述内含物的核心无关。此外，参与PHA代谢的其他还未鉴定的组分介导PhaPl靶定至内含物也是不太可能的，因为该组分在我们的研究所用的菌林中应该是不存在的。最可能的是，PhaPl与内含物的结合仅受两亲界面(amphiphilicinterphase,所述界面由内含物和周围细胞质之间的单层膜組成)的存在、或核的疏水表面的存在、或两者组合的介导。电子显微镜和包埋后免疫细胞化学组合揭示PhaPl主要分布在TAG内含物的两亲表面上。然而，与其在富养罗尔斯通氏菌H16中PHB颗粒表面上的唯一分布相反，证明了一些PhaPl也存在于混浊红球菌PD630细胞中的质膜和细胞壁区域。该分布也由Pieper-Fiirst等在研究赤红球菌(Rhodococcusruber,其也能够合成等量的TAG和聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酉旨(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate))共聚物)中14kDa泽漆皂戒的细胞分布时报道[18a。虽然还不知道赤红球菌TAG和聚(3HB-co-3HV)是单独出现在内含物中还是同时出现在内含物中，但证明了在该菌林中泽漆皂甙出现在细胞中任何内含物的表面上，并也出现在质膜的胞质位点处。根据最近提出的模型，原核生物中TAG内含物的起源是质膜的胞质位点(Waitermann等[31])。因此，泽漆皂甙与合成位点处的新生TAG内含物的结合是对该分布最可能的解释。在富养罗尔斯通氏菌H16中，PHB的量和颗粒的数量直接受细胞中泽漆皂甙的量的影响(Wieczorek等[31a；Piitter等[18d)。泽漆皂甙的存在既不改变混浊红球菌PD630中TAG的量，也不影响TAG内含物的大小或数量。如本表达分析所揭示，细胞中PhaPl的总量非常低，因为蛋白质的表达受质粒pJAM2的ace启动子的限制。大量泽漆皂甙的存在是否42影响细胞中的TAG代谢有待于阐明。证实了用PhaPl-LacZ融合物标记的TAG内含物显示体外P-半乳糖苷酶活性。酶和其他种类的蛋白质在表面或确定的颗粒上的固定提供了令人感兴趣的应用。一个实例是功能化纳米颗粒(例如用于分析目的的这种运输抗体，或激素和其他治疗剂)的合成。这种納米颗粒易于从细胞粗提物中纯化。Moldes等[17a]使用PHA颗粒作为基质和来自恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的泽漆皂戒PhaF的N末端作为连接物建立了用于合成并纯化酶的系统。此外，已经成功地证明重组大肠杆菌中PHB颗剪接亲和标记作为用于目标蛋白质纯化的基质(Banki等[3a)。Moloney[17c;17d]也使用TAG内含物作为酶纯化的基质。该作者通过油质蛋白将目标酶附着到油体上建立了基于植物细胞的系统。上文描述的两个纯化系统均取得专利权并可通过商业途径获得(Prieto等ES专利200102240[18fJ;Moloney:美国专利5650554[17bj和6924363[17e])。此外，通过PhaPl标签将酶和其他蛋白质锚定至TAG内含物上提供了在胞内TAG内含物的单层表面上建立备选生物改造途径的重要可能性。B.利用原核生物脂肪体蛋白质的实验实施例B1:原核脂肪体蛋白质在重组放线菌中的表达将鼠围脂滴蛋白A(SEQIDNO:26)、人ADRP(SEQIDNO:34)、人TIP47和玉米油质蛋白(SEQIDNO:38)基因的编码区作为His6-标记的融合物克隆至大肠杆菌-红球菌/分枝杆菌穿梭载体pJAM2中。使用在材料和方法部分中列出的抗体，通过SDS-PAGE和免疫印迹分析各转化的耻垢分枝杆菌mc2155和混浊红球菌PD630细胞粗提物中围脂滴蛋白A、ADRP、TIP47和油质蛋白的表达。所有抗体均不识别未转化的红球菌/分枝杆菌细胞中的任何蛋白质。鸡抗玉米油质蛋白IgG容易地识别转化有pJAM2::okOmays的耻垢分枝杆菌mc2155细胞中的19-kDa蛋白质(图7)。然而，即使与不经乙酰胺诱导的耻垢分枝杆菌mc2155细胞比较，在携带pJAM2::oleomays的混浊红球菌PD630细胞中表达很低并仅在曝光过度的免疫印迹上观察得到(未显示)。该19-kDa蛋白质应该是来自pJAM2::oleomaize中玉米基因的His6-标记的油质蛋白。在混浊红球菌PD630和耻垢分枝杆菌mc2155中没有检测到较低Mr的蛋白水解降解产物，表明所述蛋白质相对于细胞内蛋白质水解作用是稳定的。携带质粒pJAM2::perA,.的耻垢分枝杆菌mc2155和混浊红球菌PD630中His6-标记的鼠围脂滴蛋白A的表达导致在免疫印迹上有58kDa的单个信号(与重组油质蛋白表达的信号具有类似的强度)，表明所述蛋白质也是稳定的，并且细胞内蛋白质水解并没有出现(图7)。在分别携带pJAM2::tip47hum或pJAM2::adrphum的耻裙分枝杆菌mc2155和混浊红球菌PD630的粗提物中，在免疫印迹上没有检测到可见的合成蛋白质。使用尼罗红作为染料的薄层色谱和荧光显樣t术揭示与不存在乙酰胺的野生型相比，质粒的存在和蛋白质的表达并不改变细胞的脂质含量或脂质内含物的数量、性状或大小。与此相反，当向培养物中加入多于0.01%(w/v)的乙酰胺时，耻垢分枝杆菌mc2155的细胞中含有量显著减少的TAG和数量显著减少的脂质内含物(未显示)。实施例B2:PAT蛋白质和油质融合物在重组混浊红球菌PD630和耻垢分枝杆菌mc2155中的荧光定位进行实验以通过免疫印迹分析在重组混浊红球菌PD630的亚细胞部分中定位围脂滴蛋白A和玉米油质蛋白，但因合成的蛋白质量少并且免疫印迹测定的灵敏度低而失败了。为了揭示PAT蛋白质和油质蛋白的亚细胞定位和与细菌TAG内含物的结合性质，脂肪体蛋白质在重组菌株中作为与eGFP的融合物变得可见。转化有各PAT蛋白质eGFP融合物表达质粒的混浊红球菌PD630和耻垢分枝杆菌mc2155细胞在储存条件下培养0、24和48小时，并检查它们的荧光才莫式。携带表达未融合eGFP的质粒pJAM2::egfp的细胞作为阴性对照。在这些条件下及这些时期过程中，细胞增加了它们的脂质含量并在细胞质中积累了大量的脂质内含物，根据早44期的观察所述脂质内含物来自周边脂质区域[6，30。未融合的eGFP在混浊红球菌PD630和耻垢分枝杆菌mc2155的整个细胞质中显示出广泛并弥散的荧光。然而，相比于从混浊红球菌PD630获得的那些图像，从耻垢分枝杆菌mc2155获得的图像因其显著的汇合生长而显得弱，树艮好地对应于在混浊红球菌PD630的重组菌林中获得的所有结果。从脂质积累晚期出现的大的脂质内含物中排除所述荧光(图8A)。相反，携带pJAM2::perAmui-egfp的菌林仅在脂质积累的早期阶段在附着到质膜的小脂质内含物中显示荧光。在进行中的TAG积累及胞质脂质内含物的形成过程中，围脂滴蛋白A-eGFP荧光看起来与胞质脂质内含物结合，并经常作为围绕所述内含物的外周环而被观察到(图8B)。为了揭示该荧光才莫式不是产生于脂质内含物的围脂滴蛋白A-eGFP荧光的单纯排除，从各重组混浊红球菌PD630菌林中分离脂质内含物并在荧光显孩i镜下进行研究。此外，用尼罗红对内含物核中的脂质进行染色。来自围脂滴蛋白A-eGFP表达细胞的分离的内含物在它们的表面显示出清晰的环状荧光，伴随有因掺合的尼罗红染料引起的脂质核心的红色荧光(图8C)。相反，表达未融合eGFP的细胞中的脂质内含物当不用尼罗红标记进行观察时显示没有荧光。这些数据表明围脂滴蛋白A-eGFP与重组混浊红球菌PD630中脂质内含物的表面紧密结合，并且在细胞破碎过程中也保持稳定结合。也进行检测分别携带pJAM2::adrphum-egfp或pJAM2::tip47h圆-eg印的重组混浊红球菌PD630菌林中ADRP-eGFP和TIP47-eGFP的亚细胞定位的时间重复实验。两种重组菌林均合成与在野生型及围脂滴蛋白A-eGFP表达菌林中观察到的那些相似的脂质内含物。与免疫印迹分析相反，在携带pJAM2::tip47hum-egfp的混浊红球菌PD630和耻裙分枝杆菌mc2155中观察到清晰的荧光。这些荧光在脂质积累的开始仅定位于胞内周边脂质区域中。在储存条件下24和48小时后，大的胞质脂质内含物出现。与在合成围脂滴蛋白A-eGFP的混浊红球菌PD630中获得的结果类似，TIP47-eGFP荧光经常以围绕大的脂质内含物的环的形式被观察到(图9A)。该标记方式也在分离的TIP47-eGFP标记的内含物上得以证实(图459B)。在携带pJAM2::adrph咖-egfp的菌林中，荧光在脂质积累的早期阶段非常弱，但可清楚地与用野生型混浊红球菌PD630进行的对照实验中的自发荧光区分开。ADRP-eGFP在脂质积累24和48小时后的脂质内含物中清晰可见。然而，也观察到背景荧光，这可能是因为在图像记录过程中延长的曝光时间(图10)。实施例B3:重组混浊红球菌PD630的冷冻切片和冷冻断裂复制物的免疫金标记。为了证实通过荧光显微研究揭示的PAT家族蛋白质在混浊红球菌PD630和耻垢分枝杆菌mc2155中胞内TAG内含物上的唯一定位，使用针对在材料和方法部分中列出的PAT家族蛋白质和eGFP标签产生的抗体在冷冻切片上进行包埋后免疫金标记。然而，免疫金标记的混浊红球菌PD630和耻垢分枝杆菌mc2155重组细胞(其表达围脂滴蛋白A或ADRP的eGFP融合物)的冷冻切片与各对照实验无法区分，其中在ADRP的情况下，可能是因为合成的蛋白质的量低。仅使用豚鼠抗人TIP47抗体的实验产生了可信并精确的结果，并对应于我们先前的观察，TIP47-eGFP在携带pJAM2::tip47humr-egfp的混浊红球菌PDMO中仅与TAG内含物结合(图IIA)。因为细菌中TAG内含物的形成是乳状液聚集驱动过程(其可引起脂质结合蛋白质胶嚢化进入脂质核心)，所以进行冷冻断裂实验以揭示PAT家族蛋白质在重组细胞中TAG内含物的表面及核心上的分布。通常，当将细菌细胞冷冻断裂，断裂平面出现在细胞膜的两个小叶之间。有时，断裂平面跨越细胞和胞内脂质内含物，使得能够对内含物的核心有横面断裂的视角。在混浊红球菌PD630的冷冻断裂复制物(其为一系列紧密压缩的、不同深度的备选定向脂质层)出现在TAG内含物的断裂核心，这与先前在横面断裂的真核和原核TAG内含物中观察到的类似[20，30。认为这些层的最外层来自周围磷脂层。为了对冷冻断裂复制物中PAT蛋白质进行免疫金标记，混浊红球菌PD630的重组细胞在储存条件下生长48小时。对应于在冷冻切片上进行的标记实验，混浊红球菌PD630的ADRP和围脂滴蛋白A表达细胞的标记复制物没有显示出可信结果，并且与各对照无法区分。然而，在对从携带pJAM2::tip47h画的菌林获得复制物进行标记后，脂质内含物中的许多种位置被标记(图11B+C)。没有获得细胞外周、细胞质和质膜的不同面的显著标记。也在表达eGFP-标记的TIP47的各菌林的复制物上证实了TIP47在重组混浊红球菌PD630中的分布，其中使用兔抗eGFPIgG作为第一抗体进行标记(图11C)。表达实施例的讨论-部分B在实验的该部分中，证实了哺乳动物脂肪体蛋白质围脂滴蛋白A、ADRP和TIP47在TAG积累放线菌中的合成及它们靶定至胞内TAG内含物。先前发现围脂滴蛋白和ADRP仅与真核细胞中的脂肪体结合，但将它们靶定至脂肪体的机制仍不清楚[5]。在该研究中，定位实验的一个最有趣的结果是预先存在的脂肪体通过细胞质在体内发生PAT蛋白质的包被。此外，PAT家族蛋白质必须与脂质直接相互作用，因为其他特异蛋白质介导的间接锚定因它们在原核系统中不存在而被去除。在文献中已经报道了用于靶定少数脂滴蛋白质的序列。例如，推测围脂滴蛋白的靶定和锚定受蛋白质的中心25%区域中的三个疏水序列的介导，虽然精确的靶定机制仍待于阐明[25。冷冻断裂免疫金标记显示TIP47不仅存在于两亲表面上，还存在于重组混浊红球菌PD630中TAG内含物的疏水核中。该分布模式很可能是因为细菌中脂质内含物形成的特歹iW几制。在细菌中，TAG合成为小的结合WS/DGAT的小滴在质膜处形成oleogenous乳化层，其凝^/聚结成脂质前体，并然后得以释放以在进行的脂质合成过程中形成细胞质定位的脂质内含物[30。通过PAT蛋白质与未包被的脂质结合，在脂质的凝聚/聚结过程中发生PAT蛋白质的胶嚢化，导致将PAT蛋白质被捕获在所述内含物的疏7JC核中。因而，本发现证实了目前用于细菌中中性脂质内含物形成的模型。本实验证实了在细菌脂质内含物的形成上的研究，并且将真核脂肪体47蛋白质靶定至这些脂质内含物是揭示它们潜在机制的合适工具。此外，目标分子(像PAT家族蛋白质)可用作细菌脂质内含物表面上锚定物生物技术相关酶的接头，其可特制用于多种生物技术应用。后面的表列出了本说明书和权利要求中涉及的所有氨基酸和核酸序列。序列列表<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>AA:氨基,列号NA:核酸序列号本发明不限于上述特定序列。应当理解本发明也包括来自上文的额外序列。根据本发明，除非另有说明，"衍生"序列(例如衍生的氨基酸和核酸序列)指与原始序列具有至少80%和至少卯％，尤其91%、92%、93%、94°/0、95%、96%、97%、98%和99%同一性的序列。参考文献1.Abell，B.M.,L.A.Holbrook,M.Abenes，D.J.Murphy,M.J.Hills，和M.M.Moloney.1997.Roleoftheprolineknotmotifinoleosinendoplasmicreticulumtopologyandoilbodytargeting.PlantCell9:1481-14932.Alvarez，H.M.，F.Mayer,D.Fabritius，和A.Steinbchel.1996.FormationofintracytoplasmiclipidinclusionsbyRhodococcusopacusPD630.Arch.Microbiol.165:377-3863.Alvarez,H.M.，和A.Steinbchel.2002.Triacylglycerolsinprokaryoticmicroorganisms.Appl.Microbiol.Biotechnol.60:367-3763a.Banki,M.R.,Gerng腦，T.U.&WoodD.W.(2005).Novelandeconomicalpurificationofrecombinantproteins:Intein-mediatedproteinpurificationusinginvivopolyhydroxybutyrate(PHB)matrixassociation.Prot.Sci.14，1387-1395.4.Barbero，P"E.Buell，S.Zulley,和S.R.Pfeffer.2001.TIP47isnotacomponentoflipiddroplets.J.Biol.Chem.276:24348-243515.Brown,D.A.2001,Lipiddroplets,proteinsfloatingonapooloffat.Curr.Biol.11:446-4496.Christensen，H.，N.J.Garton，R.W.Horobin，D.E.Minnikin，和M.R.Barer.1999.Lipiddomainsofmycobacteriastudiedwithfluorescentmolecularprobes.Mol.Microbiol.31:1561-15726a.Darzins，E.(1958).Thebacteriologyoftuberculosis.Minneapolis,MN:UniversityofMinnesotaPress.6b.deKoning，G.J.M.&MaxwellI.A.(1993).Biosynthesisofpoly画(R)画3-hydroxyalkanoate:anemulsionpolymerization.J.Environ.49Degrad.1,223-226.7.Diaz，E.，和S.R.Pfeffer.1998.TIP47:acargoselectiondeviceformannose6-phosphatereceptortrafficing.Cell93:433-4438.Garcia，A.,A.Sekowski,V.Subramanian,和D.L.Brasaemle.2003.ThecentraldomainisrequiredtotargetandanchorperilipinAtolipiddroplets.丄Biol.Chem.278:625-6358a.Gerngross,T.U.，Reilly,P.,Stubbe,J.，Sinskey,A.J.&Peoples,O.P.(1993).Immunocytochemicalanalysisofpoly-P-hydroxybutyrate(PHB)synthaseinAlcaligeneseutrophusH16:Loc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