纯化流感病毒的方法

专利名称：：纯化流感病毒的方法
技术领域：
：本发明涉及对不同量的流感病毒或其衍生物的纯化。特别地，本发明提供了一种快速有效并可放大的用于纯化可用于人类(例如预防性应用，如疫苗接种)的商业量流感病毒的方法。
背景技术：
：流感病毒属于正粘病毒科，并才艮据抗原性差异分为曱型、乙型和丙型。甲型和乙型流感病毒是重要的呼吸系统病原体，而甲型流感病毒是造成高致死率流行病的主要原因。流感病毒具有分段的、单链的负链RNA基因组。甲型流感病毒的基因组由编码ll种(有些甲型流感病毒林为10种)蛋白质的8个RNA分子组成。病毒包膜由位于基质蛋白(Ml)层上的脂双层构成。糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)包埋在脂双层中，它们分别负责病毒附着并侵入细胞以及从受感染细胞中释放出子代病毒。这两种蛋白质还决定了甲型流感病毒的亚型。由于分段的基因组所致的高突变率和频繁基因重排导致了曱型流感病毒的强免疫学变异性，特别是HA和NA抗原。乙型病毒不呈现出相同程度的抗原变异性并且主要是儿童病原体，其偶尔可以造成像甲型病毒同样严重的流行病。流感的潜伏时间为l到5天。临床发病特征为突然发烧、头疼、不适和肌肉疼痛。全身症状通常持续3天。尽管没有所有国家的流感相关死亡4的准确数据，但在美国，在年龄大于65岁的A^中与流感相关的死亡为每100000人中30到150人。在流感流行时，1%-5%的发病率是非常常见的，但;UC病率也可以达到40%-50%。因此，流感流行或甚至大流行在经济上的影响可以是巨大的。疫苗接种被认为是限制流行及其有害影响的最佳方法。自从1940年代引入以来，已经发现基于培养于鸡蛋中病毒材料的疫苗能明显有效地抵抗流感的感染并显著降低高危A^中的死亡率。早期的疫苗被鸡蛋来源的成分高度污染，并且高致热且缺乏效力。为了克服这些问题，尝试了许多不同的纯化流感病毒的纯化技术和方法。Veerarghavan和Sreevalsan(1961)比较了几种不同的浓缩和纯化流感病毒的方法，并发现两轮磷酸铝处理是最好的方法，然后超速离心、红细胞吸附、单轮磷酸铝处理，最后是氧化锌方法。1960年代，报道了在磷酸钾和琼脂糖凝胶柱上对流感病毒进行小规模色镨纯化的早期尝试(Pepper，1967)，但在实验中没有测定病毒的感染性。Wallis等(1972)表明了在低于6.0的低pH条件下流感病毒可以吸附到不溶性聚电解质上，随后在高pH值条件下被洗脱。因为病毒对pH值敏感以及没有测定纯化后病毒的感染性，该方法纯化感染性流感病毒的适用性是未知的。也尝试了用聚乙二醇沉淀随后通过受控孔径玻璃珠进行凝胶渗透色镨对流感病毒进行纯化并与密度梯度方法进行比较(Heyward等，1977)。密度梯度方法所需的时间是沉淀和皿渗透色谦之组合的10倍，而两种方法获得的病毒純度是相似的。Sagar等(1980)使用带正电的"ZetaPlus，，过滤器对流感病毒进行浓缩，但如作者所建议的，仍需要进一步的纯化步骤。US-A-3632745描述了通it^"含二价金属阳离子(例如镁)的水溶液透析病毒悬液来纯化流感病毒。US-A-3485718和3547779都公开了将硫酸钡用于纯化流感病毒。US-A-3478145公开了磷酸钓在纯化流感病毒中的用途。US-A-3874999描述了由不同的离心步骤、沉淀(用MgS04)、超滤和透析组成的方法。EP-A-0171086公开了通过使用纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯的柱色i普纯化流感病毒的方法。所述专利申请仅仅公开了解决M嚢液中纯化流感病毒，并且没有根据仍然未知的病毒感染性来确定病毒的回收率。在病毒吸附到色镨柱以及清洁步骤之后，用影响病毒感染性并降低感染性病毒回收率的含有高NaCl浓度(1.49M)的緩冲液从所述柱上洗脱病毒。所述方法基于对病毒颗粒具有低动态结合能力的颗粒载体，另外所述动态结合能力还强烈地依赖于流速。这些性质显著影响下游方法，由于需要大的柱尺寸并只能使用低流速，所有这些都导致所述方法相当低的产率。US-A-6008036公开了一种用色镨从细胞系培养物中纯化病毒的一般性方法。所公开的方法包括离子交换色谱步骤，接着是阳离子交换色谱步骤，以及任选地金属结合亲和色镨步骤。流感病毒纯化的主要突破是区带超速离心的ib艮(Reimer等，1966)。该技术是流感病毒以及其它病毒疫苗纯化方法和工业生产的一场革命。到目前为止，它仍是流感病毒疫苗下游方法的基础。通常^泉嚢液中纯化流感病毒由离心澄清、超滤浓缩和超速离心纯化所组成。这些当前纯化流感病毒的方法都很繁瑣，无法轻易地用于为所要求纯度的疫苗快速大，的生产病毒原料。将来可能发生新的流感流行和大流行，而当前基于鸡蛋的疫苗生产净支术似乎无法应对大流行的危机。因此，需要能够快速生产新型流感疫苗的系统。其中一种这样的方法是能够轻易放大的基于细胞培养的方法。但是现有的流感病毒疫苗的纯化方法跟不上该需求。最近，还有报道描述了一种包括深层过滤、灭活、超滤和凝胶过滤的可放大的流感病毒纯化方法(PrasadNayaketal,2005)。由于病毒是灭活的，用该方法纯化感染性流感病毒的适用性仍是未知的。因此，仍然需要一种快速、可放大、有效并且廉价的纯化流感病毒的下游方法以用于需要纯的具有免疫原性和/或感染性病毒的疫苗或任何其它应用。本发明公开了这样的方法。
发明内容本发明涉及一种纯化流感疫苗或其衍生物的方法，其包括提供具有流感病毒或其衍生物之来源的步骤，任选地对所述来源进行预纯化步骤，然后在平均孔径为至少20nm的多孔颗粒、灌注颗粒(perfusionparticle)、6壳包凝胶颗粒(gel-in-a國shellparticle)、触角型颗粒(tentaclelikeparticle)、膜吸附剂以及整体柱(monolith)上进行至少一个色镨步骤，然后收集洗脱的含流感病毒或其衍生物的级分，附加条件是排除纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯。在本发明一个实施方案中，在选自平均孔径为至少20nm的多孔颗粒、灌注颗粒、壳包:^颗粒、触角型颗粒、膜吸附剂以及整体柱的材料上实施所述至少一个另外的色谱步骤。术语触角型颗粒对于普通技术人员来说是公知的。在EP-A-0337144中公开了属于此类的典型材料。同样，术语壳包皿颗粒为本领域所使用的术语。例如，根据壳包皿技术生产的材料包含从在固体载体(如陶瓷载体)之大孔内聚合的高性能水凝胶所形成的结构。所述载体也可以从有机材料制备。例如，US-A-5268097或5234991中公开了这类构造。EP-A-0337144提到了包含由通过接枝聚合用至少一种共价结合的聚合物包被的含脂肪族伯羟基或仲羟基之载体的材料。这些^^质都是商品化的，其商品名为FractogelEMD和FractoPrep,可能还有一些其它的。这些名字在EP-A-0337144中没有提到。US-A-5268097提到了钝化多孔固体载体，其表现出高孔隙率、物理强度、高电荷密度、高流速和化学稳定性。通过在其多孔表面上施加薄的保护性聚合物层使钝化多孔固体载体稳定化，以免在恶劣环境条件下浸出，并且其具有以下特征，即可逆的高吸附能力并基本上不伴随非特异性吸附生物分子或与其相互作用。其商品名为HyperD。US-A-5234991提到了用具有阳离子性质的胺化多糖聚舍物包被的多孔矿物载体。术语灌注颗粒在本领域也是众所周知的。US-A-5384042、US-A-5552041、US-A-5605623和US-A-5833861中公开了属于此类的材料，并以商品名"POROS⑧，，市售。US-A-5384042、US-A-5552041、US-A'5605623和US-A-5833861公开了由相互连接的第一和第二组孔以及用于与所述第二组孔成员流体连通的溶质相互作用的高比表面积所限定的基质。所述第一和第二组孔表现为例如颗粒间的空隙和颗粒内的贯穿孔。该孔的尺寸使得在高流体itit下两組孔中发生对流，而且对流流速超过了第二组孔中溶质扩散的速率。这些参考文献和EP-A-0337144以参考形式并入本文。此外，本发明涉及制备流感病毒的方法，所述方法包括用流感病毒感染细胞、在所述细胞中扩增流感病毒、收获所述流感病毒以及根据本发明纯化流感病毒或其衍生物的方法对所收获的流感病毒或其衍生物进行纯化的步骤。本发明的方法适用于实验室和商业用量的流感病毒的纯化，例如，用作疫苗或病毒载体。本发明有利地避免了与纯化流感病毒的现有方法相关的问题，并依赖于能够简单放大所述方法的超滤和色镨技术。本发明的方法完成了从细胞裂解物中纯化流感病毒颗粒，其任选地采用了超滤，随后是病毒结合和之后从色谱栽体上洗脱的步骤，以及最后的从所剩杂质中纯化出病毒以及同时更换此步骤之前病毒所处緩沖液的步骤。本纯化方法极大的降低了流感病毒样品中的污染物水平并使得纯化后的流感病毒能够应用于人。本发明的纯化方法允许使用多种已知在实验室或工业级水平上可用于分离生物材料的市售超滤装置和色谱栽体。超滤装置可以包括平板或中空纤维设计，而色镨载体包括具有不同活性基团和不同床类型(多孔颗粒、膜、整体柱)的不同基础材料(天然和合成聚合物)。由于条件温和而能够基本上维持流感病毒的效力，如免疫原性和/或感染性，所以本发明的方法是有利的。根据本发明的一个优选实施方案，所述洗脱緩冲液包含^1MNaCl，优选地为S0.8MNaCl，优选地为^0.5MNaCl，或者为￡0.31\1&(:1。同样地，当采用本发明的方法时，还可能保持流感病毒或其衍生物的结构完整性。当采用本发明的方法时，所述流感病毒或其衍生物基本上不含DNA从而可以避免用脱氧核糖核酸酶类(DNAse)进行处理。图l:色镨图，其显示出从三根并联的CIM⑧QA8ml管式整体柱中流感病毒的洗脱曲线。图2:色语图，其表示从S印harose6FastFlow(^JM^号70/卯，2000ml)中流感病毒的洗脱曲线。图3:在CIMQA整体柱和Sepharose6FastFlow柱上纯化的级分的SDS-PAGE和Western印迹分析。图4:在CIMQA整体柱上纯化的级分的Southern印迹分析。图5:色镨图，其显示出CIMDEAE盘式整体柱上流感病毒的洗脱曲线。图6:色旙图，其显示出CIM⑧QA盘式整体柱上流感病毒的洗脱曲线。图7:色镨图，其显示出CIM⑧EDA盘式整体柱上流感病毒的洗脱曲线。图8:流感病毒在QSepharoseXLVims上的纯化。图9:流感病毒在CIM⑧QA盘式整体柱上的纯化。图10:流感病毒在MustangQ膜上的纯化。图11:流感病毒在Sepharose6FastFlow上的洗脱曲线。图12:流感病毒在Fractoge^BioSEC上的洗脱曲线。图13:流感病毒在ToyopearlHW-75上的洗脱曲线。发明详述本发明涉及对有用量的任何流感病毒或其衍生物的纯化方法的开发，特别是满足实验室或工业规模需要而用作疫苗或病毒载体的流感病毒或其衍生物。本发明避免了与现有流感病毒纯化方法有关的问题并依赖于使得过程放大简单易行并能提高生产效率的超滤和色镨技术。现有的流感病毒纯化方法基于超速离心，因此持续时间长，效率低并难以放大。根据本发明，通过下列步骤纯化流感病毒或其衍生物，所述步骤为提供含有流感病毒或其衍生物的来源，任选地对所述来源进行预纯化步骤，然后在平均孔径为至少20nm的多孔颗粒、膜吸附剂和整体柱上进行至少一个色谦步骤，收集洗脱的含有流感病毒或其衍生物的级分。通常，具有9约10nm到约50nm颗粒尺寸的所述多孔颗粒按压汞法测得具有约20nm到约500nm或更大的平均孔径。在本发明的另一实施方案中，可以在优选地选自平均孔径为至少20nm的多孔颗粒、灌注颗粒、壳包凝胶颗粒、触角型颗粒、膜吸附剂以及整体柱的材料上实施至少一个另外的色谱步骤。优选地，流感病毒的洗脱在温和条件(即洗脱緩冲液的离子强度低)下实施。在本发明的另一个实施方案中，在多孔颗粒、膜吸附剂和整体柱上实施至少一个色镨步骤后，实施超滤和/或过滤除菌。在多孔颗粒、膜吸附剂和整体柱上实施的所述至少一个色谱步骤可以釆用离子交换、亲和、疏水或亲水相互作用、体积排阻材料或其组合来实施。在另一个实施方案中，可以在色镨步骤之前或之后加入DNA核酸酶。任何已知的流感病毒或其衍生物的上游生产方法可用于生产本发明纯化方法所用的起始材料。流感病毒或其衍生物的合适来源为任何支持流感病毒复制的真核细胞。优选的宿主细胞为支持流感病毒感染和复制的哺乳动物宿主细胞系。根据本发明，流感病毒的衍生物特别地是遗传改造的流感病毒或病毒样颗粒或递送外源物质(如生物或药物活性物质，例如生物聚合物以及小分子)的流感病毒颗粒(病毒载体)。生物聚合物特别地为蛋白质，如抗体、受体酶；核酸(反义核酸)、脂类或多糖。可以例如从真核细胞表达的流感病毒蛋白或者通过体外操作流感病毒和/或包含流感病毒的分子产生流感病毒样颗粒。对流感病毒基因组的遗传操作可以包括突变、缺失、插入或对流感病毒基因组的任何其它操作。特别地，所述流感病毒含有NS1基因的至少一种修饰和/或缺失。因此，在本发明的方法中，所述流感病毒或其衍生物选自野生型流感病毒、含有修饰(包括替换、突变、插入和/或缺失)的流感病毒和免疫原性流感病毒样颗粒。根据本发明的纯化方法还用于生产流感病毒的方法中，其包括用流感病毒感染细胞、在所述细胞中扩增流感病毒、收获流感病毒以及对所收获的流感病毒或其衍生物实施本发明纯化方法的步骤。特别地，本发明公开并要求保护一种生产或纯化流感病毒或其衍生物的方法，所述方法包括以下步骤-用流感病毒感染细胞；-在所述细胞中扩增所述流感病毒；-收获所述流感病毒；-在具有300kDa截断值的平板或中空纤维装置上用切向流过滤浓缩所收获的流感病毒；-将浓缩后的流感病毒加到CIMQA整体柱；-将从CIMQA整体柱上洗脱的流感病毒级分加到Sepharose6FF柱；画从Sepharose6FF柱收集流感病毒级分；-对流感病毒ii行过滤除菌。本发明的主题还包括可以根据本发明流感病毒或其衍生物纯化方法得到的流感病毒或其衍生物的级分，以及任选地包含佐剂和/或可药用载体的疫苗。可根据本发明得到的包含流感病毒载体的级分也是本发明的主题。流感病毒载体可以包含可以从流感病毒载体转移到宿主细胞的异源核酸序列。异源核酸序列可以编码治疗性蛋白质、治疗性核酸或者可以在生物体内产生免疫应答的蛋白质。将异源核酸引入到病毒载体中的方法在本领域中是公知的。在本发明方法的一个实施方案中，所述预纯化步骤包括离心、过滤、超滤、选择性沉淀、膨胀床色镨、包含磁性珠的批处理色镨或其组合。通常在预纯化步骤中，从细胞裂解物中除去细胞碎片和其它污染物，其可以另外地调节到最适于下一步纯化的条件。特别地，预纯化步骤可以包括离心、过滤和超滤。还可进行使用聚乙二醇或任何其它化合物的选择性沉淀，其造成流感病毒或污染物沉淀。膨胀床色镨和批处理色谱可用作预纯化步骤以避免如色镨柱被细胞碎片阻塞和堵塞的问题。无论是野生型、突变体或是重组病毒或病毒样颗粒，任何流感病毒都可以通过本发明进行纯化。根据本领域已知的方法，可以制备和培养流感病毒。在本发明的一个实施方案中，所述流感病毒或其衍生物选自野生型流感病毒、包含突变(包括插入和缺失)的流感病毒以及流感病毒样颗粒。突变是核,列的改变，其导致相关基因所编码的蛋白质的M^列的改变。缺失是指某核酸区域被消除的突变。插入是指在核酸序列中插入另外一段>^#。流感病毒样颗粒可以从不同真核细胞所表达的流感病毒蛋白产生。特别地，流感病毒样颗粒A^疫原性的，其意味着当这些颗粒i^某一生物体后引M疫应答。本文中所描述的方法允许在水性介质中回收高浓度的纯化感染性流感病毒颗粒。所述方法适用于制备实验室或工业用量的任何流感病毒颗粒。更详细地描述本发明，但本发明并不限于所述的实施方案。可以通过本领域已知的任何方法扩增和制备流感病毒。所述病毒可以根据文献中所说明的已知方法培养于鸡蛋中或细胞培养物中。优选地，流感病毒收获自病毒感染的细胞，例如Vero细胞。为了优化产率，可以在高感染复数下感染细胞。可以使用任何适于从感染细胞中回收病毒的方法。可以通过离心然后过滤来除去细胞碎片。离心后过滤或不过滤都是可行的，但是在本发明中两种方法的组合可能是最稳健的澄清方法。对于较小的体积，可以进行批处理离心，但^l:对于较大的体积(大于50L)，连续离心优于批处理方法。可以考虑过滤步骤以进一步除去细胞碎片并增加方法的可靠性。维持良好澄清度和总产率之间的平衡需要研究大量过滤形式。一种示例性过滤使用0.65-0.45pm的醋酸纤维素过滤器。接着可以对包含流感病毒的澄清的裂解物使用色镨技术，或它可以首先用超滤浓缩然后再在色镨柱上纯化。优选釆用切向流超滤，并且可以使用不同的装置(例如，Millipore公司的Proflux和LabscaleTFF系统)。所选的具体超滤膜的尺寸足够小到截留流感病毒但又足够大到有效清除杂质。才艮据生产厂家和膜类型的不同，100到1000kDa的标称截留分子量12可能是合适的(例如，GEHealthcare公司的UFP-750-E-5A;Millipore公司的BiomaxNMWC1000)。所述膜的组成可以是但不限于再生纤维素、聚醚砜、聚砜。膜可以是平板膜或中空纤维膜。超滤过程中，浓缩倍数将是培养M(包括培养基、细胞密度和病毒生产效率)的函数，并可以由技术人员进行调整。近似地，例如，以本身公知的方式，IO倍浓缩是有用的。应该优化的典型^lt有通量率和跨膜压。结合标称截留分子量，这两个^t应能够同时实现有效杂质去除和高病毒产率。技术人员知道如何处理这些参数并能轻易地设计优化实验。超滤时，特别地至少80%的宿主细胞蛋白质与流感病毒分离开并能在渗透液中检测到。特别地，通过使用截留分子量为300kDa、500kDa和750kDa的膜，通常，超过卯％的蛋白质与病毒分离，而所述病毒则保留在保留物(retenate)中。所述病毒可以根据其表面电荷进行进一步纯化。如所提到的，可以用离子交换色语纯化澄清裂解物或通^滤制备的浓缩物。澄清裂解物或浓缩物可以直接上样于色i普柱，或者为了实现本方法的最大效率可以调整到某些M下上样。不同的緩冲溶液可用于调节和离子交换色谱步骤。可以在离子交换色镨步骤中使用的緩沖液实例包括磷酸盐、柠檬酸磷酸盐、Tris-HCl、MOPS、HEPES等。还可以配制加入了稳定剂(例如，如蔗糖的二糖类)的緩沖液。离子交换色谱步骤允许使用多种已知用于生物材料分级分离的市售色镨材料。不同基础材料(天然或合成聚合物)的色镨载体可在本发明中使用。这些基础材料可以具有不同的形状，包括颗粒载体、膜和M柱。阴离子交换色谱可以通过采用多种官能团来实施，所述官能团包括但不限于DEAE(二乙基胺)、EDA(乙二胺)和QA(季铵)。这些官能团可以连接到任何适用于本发明的树脂上。阳离子交换色镨也可以用于流感病毒的纯化，其包括但不限于，连接到任何适合树脂上的S03(磺酰基)和CM(羧甲1^)官能团。将澄清裂解物或通it^滤制备的浓缩物调节到下述条件，即在此IHf下流感病毒可以结合到所述色镨载体表面上带正电荷(阴离子)和负电荷(阳离子)的官能团上。1^，使用离子强度增加的緩冲液将结合的病毒13颗粒从色镨载体上洗脱下来。优选地，在本发明方法的离子交换色谱步骤中使用基于聚(甲基丙烯酸缩7jc甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)基质并带有季铵(QA)官能团的整体柱载体(例如，CIIV^QA整体柱)。澄清细胞裂解物或超滤浓缩物可以调节到能使流感病毒结合到色镨载体带正电官能团上的条件。优选地，此步骤采用了pH值介于7到8之间的具有高緩冲能力的緩冲液(例如Tris、HEPES)。在此条件下，带负电荷的病毒颗粒结合到整体柱载体表面上带正电荷的官能团。例如通过增加緩冲液的离子强度(特别地，使用氯化钠)实现所述病毒颗粒的洗脱。该阴离子交换色镨步骤也可以用于除去DNA。由于宿主细胞DNA带负电荷，它将会结合到色镨载体表面的官能团上。相比于流感病毒，在更高的离子强度下从所述阴离子交换载体上洗脱DNA。在适于流感病毒洗脱的离子强度下，从阴离子交换柱上洗脱下来的物质将不包含宿主细胞DNA。因而，在优选的实施方案中，不需要用脱氧核糖核酸酶(例如，Merck7〉司的Benzonase)处理含流感病毒的溶液。与此相反，优选在本发明中不使用脱氧核糖核酸酶，因为DNA断裂和尺寸的减小会增加最终流感病毒汇集物中的DNA含量，同样也必须从预期用于人的终产品中除去脱氧核糖核酸酶。可以根据其大小进一步纯化从阴离子交换柱上洗脱下来的流感病毒样品。优选地，与此同时，将病毒从阴离子交换柱上洗脱下来的緩冲液也会或多或少地发生交换。在本发明的方法中，优选体积排阻色镨和切向流过滤。两种方法都能在几乎相同的时间里实现杂质去除和緩冲液交换。切向流超滤是一种可用于除去残留蛋白质和核酸以及将工作緩冲液交换成最终制剂緩冲液的方法。优选使用切向流的超滤，并且可以使用不同的装置(例如，Millipore公司的Proflux和LabscaleTFF系统)。所选的具体超滤膜应具有足够小到可以保留流感病毒但又大到能够使杂质穿过的过滤孔径。才艮据生产厂家和膜类型的不同，标称截留分子量为100到1000kDa(例如，GEHealthcare公司的UFP-750-E-5A;Millipore公司的BiomaxNMWC1000)可能是合适的。所述膜的组成可以是，但不限于，再生纤维素、聚醚砜、聚砜。膜可以是平拟度或中空纤维膜。必须进行优化的主要M为通量率和跨膜压。结合标称截留分子量，这两个M能够获得有效的纯化和緩沖液交换以及高病毒产率。体积排阻色谱(SEC)也能同时实现的杂质移除和緩冲液交换。SEC允许使用多种已知可用于生物材料SEC的市售色谱材料。本发明中可以使用不同M材料(天然和合成聚合物)的色谱载体。SEC载体可以具有不同的颗粒尺寸和孔径。优选地，在本发明中使用具有导致流感病毒颗粒完全被排除在树脂颗粒的孔之外并因此洗脱在柱的空体积中之孔径的SEC栽体。与此同时，树脂颗粒孔径应^吏得杂质能够i^而导致与流感病毒颗粒相比较长的洗脱体积，以便进一步纯化所述产品。特别地，在一组分离模式中，SEC载体如Sepharose6FF(GEHealthcare)、FractogelEMDBioSEC(MerckkGaA)和ToyopearlHW-75(TosohBioscience)可以用于流感病毒的纯化。可以在SEC步骤中使用的緣冲液包括磷酸盐、檬酸盐磷酸盐和其它生物相容性緩冲液。还可以使用稳定剂(例如，如蔗糖的二糖类和/或去污剂)来配制緩冲液。还可以在所述緩沖液中加入防止SEC树脂和流感病毒之间离子相互作用的化合物，如氯化钠。作为附加步骤，可以实施过滤除菌来消除生物负荷。因此可以用0.22fim过滤器过滤SEC洗脱液或超滤步骤的最终保留物。所述过滤器可以用多种材料构建，其可包括但不限于聚丙烯、纤维素、纤维素酯、尼龙、聚醚砜、或符合低非特异性流感病毒结合要求的任何其它材料。所述过滤器可以具有单层膜或多于一层或者可掺入用相同或不同材料制成的预过滤器。经过滤的流感病毒可以冷冻保存或在约4'C保存以备1^操作使用。本发明描述了由超滤和色镨方法构成的流感病毒纯化方法。这样的超滤和色谱方法的放大在本领域中是众所周知的。本公开的发明可以用于实验室级或可以使用前述方法转到中试或工业级别。当然，当对流感病毒颗粒没有严格的高纯度要求时(这特别地适用于在实验室级别应用)，可以省略最后一步，即过滤除菌，或最后两步，即过滤除菌和SEC(或超滤)。实施例实施例1本实施例证明了使用顺序如下的切向流过滤、阴离子交换色镨、体积排阻色谱和过滤除菌的本发明优选的流感病毒纯化方法。在GibcoTMOptiPROTMSFM培养基中的Vero细胞中培养具有NS1基因缺失和IVR-116的A/PR/8/34Mt.Sinai重排流感病毒。通过在室温下以2400rpm离心10分钟澄清约15000ml细胞裂解物。收集上清液并通过具有0.65-0.45醋酸纤维素膜的SartobranP500cm2的嚢式过滤器进行过通过釆用Proflux系统(Millipore)和具有750kDa标称截流分子量和0.12m2面积的中空纤维TFF滤筒(GEHealthcare,UFP-750-E-5A)的切向流过滤对所述滤液ii行浓缩。跨膜压为0.2到0.3bar.浓缩液的最^f^积为1400ml。接着用三根并列的CIMQA8ml管式整体柱(BIASeparations,总床体积为24ml)进一步纯化浓缩液。使用下列緩冲液緩冲液A:50mMHEPES(pH=7.5),緩冲液B:50mMHEPES/0.3MNaCl(pH=7.5)，緩冲液C:50mMHEPES/2.0MNaCl(pH=7.5)。流速为每分钟300ml。在使用之前，用40倍柱体积的1MNaOH(接触时间2小时)清洁CIMQA8ml管式整体柱。用20倍柱体积的緩冲液C然后再用20倍柱体积的緩冲液A进行平衡。将1350ml包含所述流感病毒的浓缩液上样于所述色镨柱，之后用20倍柱体积的緩冲液A清洁色镨柱。用緩沖液B洗脱流感病毒，收集到115ml洗脱液。用緩冲液C洗脱结合在柱上的残留杂质(图1)。最后，用40倍柱体积的1MNaOH(接触时间2小时)清洁色镨柱。使用体积排阻色谱作为最终纯化和緩沖液交换步骤。用Sepharose6FastFlow(GEHealthcare,17-0159-05)填充M^号70/950色镨柱至2000ml床体积(N:4664/m)。采用SPG緩冲液(0.218M蔗糖、0.0038MKH2P04、0.0072MK2HP04、0.0049谷氨酸钾；pH8.0±0.2)，流速为20ml/分。用5倍柱体积的1MNaOH(接触时间2小时)清洁色镨柱并用5倍柱体积的SGP緩沖液平衡。40mlCIMQA洗脱液(2%的柱体积)上样于所述色镨柱。包含流感病毒的级分洗脱在所述色镨柱的空体积中并收集到128ml洗脱液(图2)。检测所收集级分中宿主细胞蛋白含量(图3)、DNA大小(图4)，用BCA法测定蛋白含量、用Picogreen法测定DNA含量，用TCID50检测法测定病毒滴度(表1)。结果证实所述方法能够快速(1天)有效的纯化流感病毒。图3显示了对在CIMQA整体柱和Sepharose6FastFlow上所纯化级分的SDS-PAGE和Western印迹分析。A:用4艮染试剂盒PlusOne(GEHealthcare)染色的PAGEGoldTris誦甘氨酸^M(10-20%)(Cambrex)。泳道1:PageRulerProteinLadder(Fermentas，200、150、120、100、85、70、60、50、40、30、25、20、15、10kDa);泳道2:TFF浓缩物；泳道3:CI]VfQA洗脱液；泳道4:SEC洗脱液；泳道5:Vero宿主细胞蛋白。B:用兔多克隆抗血清和HRP缀合抗-兔抗体检测Vero宿主细胞蛋白。泳道l:PageRulerProteinLadder(Fermentas，200、150、120、100、85、70、60、50、40、30、25、20、15、10kDa);泳道2:TFF浓缩物；泳道3:CI]V^QA洗脱液；泳道4:SEC洗脱液；泳道5:Vero宿主细胞蛋白。图4描绘了对在CEV^QA整体柱上所纯化级分的Sou仇ern印迹分析。A:用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳。泳道1:DNA标准品(1kbPlusDNALadder,Invitrogen);泳道2:带DIG标记的DNA分子量标记III(Roche);泳道3:Vero细胞DNA;泳道4:Vero细胞DNA;泳道5:TFF浓缩物；泳道6:CIIV^QA洗脱液。B:采用地高辛标记探针进行的Vero细胞DNA的Southern印记和检测(DIGHighPrimeDNA标记和检测初步试剂盒II)。泳道l:DNA标准品(1kbPlusDNALadder,Invitrogen);泳道2:DIG标记的DNA分子量标记III(Roche);泳道3:Vero细胞DNA;泳道4:Vero细胞DNA;泳道5:TFF浓缩物；泳道6:CIM^QA洗脱液。表l:在纯化方法的不同步骤中所收集样品的分析病毒滴度(TCID50/ml)DNA(ng/ml)蛋白质(|jg/ml)收获物1.0E+07--浓缩物1.0E+081510950CIMQA洗脱液6.3E+081.5240SEC洗脱液1.5E+082.417实施例2在本实施例中，比较了三种不同的阴离子交换官能团。本实施例说明了不同的阴离子交换官能团可用于流感病毒颗粒的纯化。在GibcoTMOptiPROSFM培养基中Vero细胞中培养了具有NS1基因缺失和IVR-116的A/PR/8/34Mt.Sinai重排的流感病毒。通it^室温下以2400rpm离心10分钟来澄清细胞裂解物。收集上清液并通过使用LabscaleTFF系统(Millipore)和截留分子量300kDa的PelliconeBiomax膜(Maiipore，PXB300C50)的切向流过滤进行浓缩。浓缩液用于比较三种CI1V^盘式整体柱CIM⑧QA盘式、CIMDEAE盘式和CIMEDA盘式整体柱(BIASeparations),4吏用以下的緩冲液緩沖液A:50mMHEPES(pH=7.5),緩冲液B:50mMHEPES/0.3MNaCl(pH=7.5)，緩沖液C:50mMHEPES/1.5MNaCl(pH=7.5)。将6ml浓缩液上样于每根色镨柱上，并用緩沖液B以分步梯度将所述病毒洗脱下来。CIMDEAE盘式柱上的流速为6ml/分(图5)，CIMQA盘式柱(图6)和CIM⑧EDA盘式柱(图7)上的流速为3ml/分。用血凝素检测法分析洗脱级分中的流感病4^量并计算病毒产率(表2)。结果证实尽管强阴离子(QA)交换柱看上去是最适合的，但是不同的阴离子交换功能基团都可以用于流感病毒的纯化。表2:不同阴离子交换CI1V^盘式整体柱上的流感病毒回收率18病毒产率00CIMDEAE25CIM50CIMEDA25实施例3在本实施例中，比较了三种不同类型的色谱栽体。本实施例说明多孔颗粒载体、膜和整体柱可用于流感病毒的纯化。在GibcoTMOptiPROTMSFM培养基中的Fm>细胞中培养了具有NS1基因缺失和IVR-116的A/PR/8/34Mt.Sinai重排的流感病毒。通it^室温下以2400rpm离心10分钟澄清细胞裂解物。收集上清液并通过^^用LabscaleTFF系统(Millipore)和截留分子量300kDa的PelliconeBiomax膜(Millipore,PXB300C50)的切向流过滤进行浓缩。浓缩液用于比较三种不同的色镨载体CIMQA盘式整体柱(BIASeparations)、病毒许可的QS印haroseXL(GEHealthcare)和MustangQcoin(Pall)。4吏用以下的緩冲溶液緩沖液A:50mMHEPES(pH=7.5)，緩冲液B:50mMHEPES/0.3MNaCl(pH=7.5)，緩沖液C:50mMHEPES/1.5MNaCl(pH=7.5)。将一等分试样的含流感病毒浓缩液以1ml/分的流速上样到病毒许可的QSepharoseXL柱(1ml床体积)上。用緩冲液B以分步梯度方法洗脱所述病毒。用緩沖液C洗脱包括宿主细胞DNA的残留杂质(图8)。将另一等分试样的病毒浓缩液以3ml/分的流速上样到MustangQcoin(0.35ml床体积)柱上，而另一等份以6ml/分的流速上样到CIMQA盘式整体柱上(0.34ml床体积)。用緩冲液B以分步梯度方式从所有单元中洗脱病毒，并且在CIMQA的色i脊图(图9)中观察到两个峰，而在MustangQcoin的色镨图(图10)中只存在1个峰。用TCID50检测法分析所收集级分中的流感病毒含量并分析其中的宿主细胞DNA存在情况(Picogreen检测法)(表3)。表3.从不同阴离子交换载体上洗脱的含流感病毒级分的分析。19<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例4在本实施例中，比较了三种不同类型的体积排阻色谱(SEC)载体。本实施例说明了不同的SEC栽体可用于流感病毒的纯化。在GibcoTMOptiPROTMSFM培养基中的细胞中培养了具有NSl基因缺失和IVR-116的A/PR/8/34Mt.Sinai重排的流感病毒。通it^室温下以2400rpm离心10分钟澄清细胞裂解物。收集上清液并通过4吏用LabscaleTFF系统(Millipore)和截留分子量300kDa的PelliconeBiomax膜(Millipore,PXB300C50)的切向流过滤进行浓缩。如实施例1中所描述，所述浓缩液在CIMQA整体柱上进一步纯化(BIASeparations)。将在50mMHEPES/0.3MNaCI(pH=7.5)中从CIMQA整体柱上洗脱的流感病毒用于SEC载体的比较。用Sepharose6FF(GEHealthcare)、ToyopearlHW-75(TosohBioscience)和FractogelEMDBioSEC(Merck)装填HR16/50色镨柱至床体积100ml并比较它们的分离曲线图和回收率。对于所有实验，都采用了SPG緩冲液((U18M蔗糖、0.0038MKH2P04、0.0072MK2HP04、0.0049K-谷氨酸；pH8.0±0.2)。以1ml/分(30cm/小时)的流速，将从CIMQA整体柱上洗脱的含流感病毒级分上样到不同的SEC载体上。用血凝素检测法分析所收集级分中的流感病毒含量并计算病毒产率(表4)。在Sepharose6FF(图ll)和FractogelEMDBioSEC(图12)上，流感病毒洗脱在色镨柱的空体积中，而在ToyopearlHW-75柱(图13)上，病毒与载体相互作用并较晚被洗脱。表4:不同SEC载体上的流感病毒回收率回收Sepharose6FF40.0ToyopearlHW-7546.9FractogelEMDBioSEC54.5实施例5在本实施例中，针对动态结合流感病毒颗粒的能力而论，比较了四种不同类型的色谱载体。本实施例一方面说明了膜、整体柱和颗粒之间的差别，另一方面与才艮据EP-A-0171086的材料(以Cdufinesulfate为代表)进行比较。在GibcoTMOptiPROTMSFM培养基中的细胞中培养了具有NSl基因的缺失和IVR-116的A/PR/8/34Mt.Sinai重排的流感病毒。通过在室温下以2400rpm离心10分钟来澄清细胞裂解物。收集上清液并通过使用LabscaleTFF系统(Millipore)和截留分子量300kDa的PelliconeBiomax膜(Millipore，PXB300C50)的切向流过滤进行浓缩。浓缩液用于比较四种不同的色镨载体CIMQA盘式整体柱(BIASeparations)、病毒i午可的QSepharoseXL(GEHealthcare),MustangQcoin(Pall)和Celufinesulfate(Chisso)。使用以下緩冲液緩冲液A:50mMHEPES(pH=7.5),緩冲液B:50mMHEPES/0.5MNaCl(pH=7.5)，緩冲液C:50mMHEPES/2.0MNaCl)(pH=7.5)。以限定的流速将浓缩液泵过每根色镨柱，收集级分并分析存在的流感病毒。在穿透处计算每种载体的动态结合能力(表5)。一方面在颗粒载体之间(Celufinesulfate和QS印haroseXL)另一方面在整体柱和膜之间(CIMQAandMustangQ)存;着10到100倍的动态结合能力的差异。这些差异可以显著影响纯化方法的设计。表5:不同载体对流感病毒的动态结合能力21<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例6在本实施例中，比较了4种不同类型的色镨载体。本实施例说明了颗粒载体、膜和整体柱都可用于流感病毒的纯化，但是也可观察到显著影响纯化方法的差异。在GibcoTMOptiPROTMSFM培养基中的Vero细胞中培养了具有NS1基因和IVR-116缺失的A/PR/8/34Mt.Sinai重排的流感病毒。通it^室温下以2400rpm离心10分钟来澄清细胞裂解物。收集上清液并通过4吏用LabscaleTFF系统(Millipore)和截留分子量300kDa的PelliconeBiomax膜(Millipore，PXB300C50)的切向流过滤进行浓缩。浓缩液用于比较四种不同的色镨载体CIMQA盘式整体柱(BIASeparations)、病毒许可的QSepharoseXL(GEHealthcare)、MustangQcoin(Pall)和Celufmesulfate(Chisso)。使用以下緩冲液緩冲液A:50mMHEPES(pH-7.5)，緩沖液B:50mMHEPES/0.5MNaCl(pH=7.5),緩沖液C:50mMHEPES/2.0MNaCl(pH=7.5)。以0.5ml/分的流速，将包含流感病毒的等分试样浓缩液上样到病毒许可的QSepharoseXL柱(0.34ml床体积)和Cdufinesulfate(0.35ml床体积)柱上。将另一等份病毒浓缩液以3.5ml/分的流速上样到MustangQcoin(0.35ml床体积)，将又一等份以3ml/分的流速上样到CIMQA盘式整体柱上(0.34ml床层体积)。用緩冲液B以分步梯度洗脱的方式将病毒从所有色镨柱上洗脱下来。用緩冲液C洗脱包括宿主细胞DNA的残留杂质。用TCID50和血凝素检测法分析所收集级分中的流感病毒含量，并用Picogreen检测法分析宿主细胞DNA含量以及用BCA检测法分析蛋白含量(表6)。从所测试的栽体上洗脱的级分中病毒、DNA和蛋白含量各有不同。在CIMQA上得到了最高的病毒滴度和病毒回收率，并且该级分具有最高的蛋白含量和低的DNA浓度。从Celufinesulfate上洗脱下来的级分具有最低的病毒滴度和最低的病毒回收率，以及最高的DNA浓度。表6:用緩冲液B从不同阴离子交换载体上洗脱的含流感病毒级分的分析<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>参考文献PrasakNayakD,LehmannS,ReichlU.DownstreamprocessingofMDCKcel卜derivedequineinfluenzavirus.JChramatograpB,823(2005),75-81.PepperDS.Achromatographicprocedureforthepurificationofinfluenzavirus.JGenVirol,1(1967),49-55.WallisC,HommaA,MefnicJLConcentrationandpurificationofinfluenzavirusoninsQlublepolyelectrolytes.ApplMicrobiol,23(1972),740-744.HeywardJT,KlinasRA,StappMD,ObijeskiJF.Therapidconcentrationandpurificatfonofinfluenzavirusfromallantoicfluid.ArrchVirol,55(1977),107-119.SagarMG,HanssenH,GerbaCP.Simplemethodfortheconcentrationofinfluenzavirusfromallantoicfluidonmicroporousfilters.ApplEnvironMicrobiol39(1980),500-504.ReimerCB,BakerRS,NewlinTE,HavensMLInfluenzaviruspurificationwiththezonalultracentrifuge.Science152(1966),1379-1381.VeeraraghavanNfSreevalsanT.,Evaluationofsomemethodsofconcentrationandpurificationofinfluenzavirus.BullWorldHealthOrgan24(1961),695-702.权利要求1.一种纯化流感病毒或其衍生物的方法，其包括以下步骤提供具有流感病毒或其衍生物的来源；任选地对所述来源实施预纯化步骤；随后在选自平均孔径为至少20nm的多孔颗粒、灌注颗粒、壳包凝胶颗粒、触角型颗粒、膜吸附剂和整体柱的色谱材料上实施至少一个色谱步骤；收集洗脱的含流感病毒或其衍生物的级分；附加条件是排除纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯。2.根据权利要求1所述的方法，其中在选自平均孔径为至少20nm的多孔颗粒、灌注颗粒、壳包皿颗粒、触角型颗粒、膜吸附剂和整体柱的材料上实施至少一个另外的色镨步骤。3.根据权利要求l和/或2所述的方法，其中所述多孔颗粒由压汞法测得具有20nm到约500rnn或甚至更大的平均孔径。4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述预纯化步骤为离心、过滤、超滤、选择性沉淀、膨胀床色谙、包含磁性珠的批处理色谦或其组合。5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中在多孔颗粒、膜吸附剂和整体柱上的所述至少一个色谱步骤之后，实施超滤和/或过滤除菌。6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中在所述至少一个色谱步骤中，釆用了离子交换、亲和、提供色谱材料与样品之疏水或亲水相互作用的基团，和/或体积排阻材料。7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述流感病毒或其衍生物选自野生型流感病毒、含有包括替换、突变、插入和/或缺失之修饰的流感病毒，和免疫原性流感病毒样颗粒。8.根据权利要求1到7中任意一项所述的方法，其中所述流感病毒包含NS1基因的至少一处<參饰和/或缺失。9.纯化或生产流感病毒或其衍生物的方法，其包括以下步骤用流感病毒感染细胞；在细胞内扩增所述流感病毒；收获所述流感病毒；和对所述收获的流感病毒或其衍生物进行根据权利要求1到7中任一项的纯化。10.根据权利要求9所述的纯化流感病毒或其衍生物的方法，其包括以下步骤用流感病毒感染细胞；在细胞内扩增所述病毒；1^所述流感病毒；在具有300kDa截留分子量的平板或中空纤维装置上用切向流过滤浓缩所收获的危感病毒；4吏所浓缩的流感病毒通过CIMQA整体柱；使从CIMQA整体柱上洗脱的流感病毒级分通过S印harose6FF柱；从Sepharose6FF柱收集流感病毒级分；对流感病毒级分进行过滤除菌。11.可根据权利要求1到10中任一项所述的方法得到的流感病毒或其衍生物级分。12.可根据权利要求1到10中任一项的方法得到的疫苗，其任选地包含佐剂和/或可药用载体。13.可根据权利要求7得到的包含流感病毒载体的级分。全文摘要一种纯化流感病毒或其衍生物的方法，其包括以下步骤提供具有流感病毒或其衍生物的来源；任选地对所述来源实施预纯化步骤；随后在选自平均孔径为至少20nm的多孔颗粒、灌注颗粒、壳包凝胶颗粒、触角型颗粒、膜吸附剂和整体柱的色谱材料上实施至少一个色谱步骤；收集洗脱的含流感病毒或其衍生物的级分；附加条件是排除纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯。文档编号C12N7/02GK101490248SQ200780025988公开日2009年7月22日申请日期2007年7月6日优先权日2006年7月11日发明者伊丽莎白·莫勒,彼得拉·克兰贝格尔,托马斯·穆斯特尔,阿莱斯·斯特兰卡尔,马塔贾兹·彼得卡,马尔科·巴尼亚茨申请人:比亚分离公司;格林希尔生物技术有限责任公司