用于获得无标记转基因植物的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于获得无标记转基因植物的方法和组合物的制作方法
用于获得无标记转基因植物的方法和组合物
背景技术：
本申请要求于2006年5月12日提交的美国临时申请系列号 60/799,875的优先权，所述美国临时申请的完整公开内容引入本文作为参考。
1. 发明领域
本发明总的来说涉及转基因植物。更具体而言，本发明涉及转基因 植物中不需要或不必要的DNA的鉴定和去除。
2. 相关领域的描述
转基因植物中不必要或不需要的转基因DNA的鉴定已成为众多研 究的主题，并且在从此种植物中消除这些转基因序列的努力中已检查了 许多不同方法(例如Hanson等人，1999; Dale等人，1991; Ebinuma 等人，1997; Yoder等人，1994; Kononov等人，1997; Hare和Chua, 2002; Scutt等人，2002; Puchta, 2003; deVetten等人，2003; Halpin, 2005;美国公开申请20030110532;美国公开申请20040237142;美国 专利6,458,594 )。 一般而言，鉴定不包括不有助于转基因植物中农业上 有用性状的转基因DNA的植物是有利的。
通过土壤杆菌属(^4gra6a"enwm )介导的转化用于在植物中引入转 基因的许多方法利用T-DNA(转化DNA)，所述T-DNA整合转基因和 相关遗传元件，并且将这些转移到植物的基因组内。 一般地，转基因以 右边界DNA分子(RB)和左边界DNA分子(LB)为边界，并且被转 移到植物基因组内，整合在一个或多个基因座上。已观察到当DNA构 建体包含超过一种T-DNA时，这些T-DNAs和其中包含的转基因可以 被整合到植物基因组内分开的基因座上(Fmmond等人，1986 )。这称 为共转化。
共转化过程可以通过用土壤杆菌属菌林的混合物递送T-DNAs来达 到，所迷土壤杆菌属菌林用携带分开的T-DNAs的质粒进行转化。共转 化还可以通过用2种或更多DNA构建体转化一种土壤杆菌属菌林来达 到，所述DNA构建体各自包含一种T-DNA。另外的方法利用在单个DNA 载体上的2种T-DNAs且鉴定已在不同基因座上整合T-DNAs的转基因细胞或植物。在非土壤杆菌属介导的转化系统中，例如用于引入DNA 的物理方法包括用微粒轰击，2种DNA分子可以独立整合到靶基因组 内，并且随后在随后世代中独立分离。也已描述了允许序列的独立插入 及其遗传分离的2种T-DNA构建体的使用(例如美国专利5,731,179; Zhou等人，2003; Breitler等人，2004; Sato等人，2004)。尽管前文 已促进了本领域的理解，但仍需要改善的方法和组合物用于获得无标记 植物以使得产品开发更有效。先前描述的筛选过程是高度劳动力密集 的，例如需要DNA印迹或PCRTM分析随后为R0和/或Rl植物材料的生 长。
美国公开20060041956描述了与土壤杆菌属介导的转化结合的视觉 标记基因的使用。然而，该出版物未描述其中此种标记与选择或筛选标 记基因连接且不与目的基因连接的任何方法。因此，本领域非常需要将 改善容易和效率的方法和组合物，使用所述方法和组合物可以鉴定和消 除缺乏标记序列和/或其他转基因DNA的植物，所述标记序列和/或其他 转基因DNA不是农业上有用的。
发明概述
在一个方面，本发明提供了由转基因植物制备无标记种子的方法， 其包括下述步骤a)获得用第一种DNA区段和第二种DNA区段转化 的转基因植物的种子，所述第一种DNA区段包含目的核酸，且所述第 二种DNA区段包含与DNA盒物理和/或遗传连接的植物标记基因，所 述DNA盒与在种子中有功能的启动子可操作地连接，其中所述DNA盒 对包含DNA盒的种子赋予可检测表型；b)就可检测表型的不存在筛选 种子；和c)选择缺乏可检测表型的至少第一个种子以获得无标记基因 的种子。在一个实施方案中，步骤c)进一步包括就目的核酸的存在测 定种子，并且选择包含目的核酸且缺乏选择标记基因的种子。在某些实 施方案中，标记基因是选择或筛选标记基因。
在某些实施方案中，DNA盒可以与选择标记基因翻译或转录地融 合；即，它可以编码与选择标记基因翻译或转录地融合的RNA。在进一 步的实施方案中，DNA盒包含具有与内源基因同源的至少19或21 bp 的反义或有义DNA片段，例如其中反义或有义DNA片段与在种子中有 功能的启动子可操作地连接。在另外一个实施方案中，DNA盒包含一对
8反向重复的DNA片段，其中每个片段大小为至少19或21 bp,且其中 DNA片段与内源基因同源，与在种子中有功能的启动子可操作地连接。 与内源基因同源的反向DNA片段重复也可以包埋在选择标记基因内的 内含子中。在某些实施方案中，DNA盒编码包含至少19或21个核苷酸 的有义或反义RNA，其中DNA片段与内源基因同源。
在根据本发明制备无标记种子的方法中，所选择的种子可以缺乏筛 选或筛选基因和DNA盒。获得转基因植物的种子可以包含用在分开的 DNA构建体上的第 一种和第二种DNA区段转化或共转化转基因植物或 其任何前代的祖先。获得转基因植物的种子还可以包含用包含第一种和 第二种DNA区段的单个DNA构建体转化转基因植物或其任何前代的祖 先。第一种和第二种DNA区段由不同的T-DNA边界序列限制范围。在 本发明的方法中，通过用DNA构建体转化植物或其任何前代的祖先来 产生转基因植物，所述DNA构建体包含(i)侧面为左和右T-DNA边 界的第一种DNA区段，和(ii)侧面为第二组左和右T-DNA边界的第 二种DNA区段，其中所述第二种DNA区段进一步包含与在转基因植物 中有功能的启动子可操作地连接的选择标记基因。第一种和第二种DNA 区段在转基因植物中可以遗传连锁或不遗传连锁。
通过经由选自土壤杆菌属、根瘤菌属(朋,zo&wm)、中生根瘤菌属 (M^or/zzzo6/wm )或中华根瘤菌属(^力or/n'zo6/ww )的细菌菌林介导的 转化，通过将第一种和第二种DNA区段引入植物或其任何前代的祖先 内可以生产根据本发明使用的转基因植物。还可以例如通过微粒轰击生 产转基因植物。
与本发明一起使用的选择标记可以编码选自下述的产物CP4 EPSPS、 6w、 DMO、 NptII、草甘膦乙酰转移酶、突变型乙酰乳酸合酶、 氨曱蝶呤抗性DHFR、茅草枯脱卣素酶、PMI、 Protox、潮霉素磷酸转移 酶和5-甲基色氨酸抗性邻氨基苯曱酸合酶。用于与本发明一起使用的 DNA盒序列可以选自例如crW、 gzM'、她> racy5、 /w;c、花青普合成基因、 Dey7/9-/aaA^、 ra/S、 OsCD尸iO、 y4尸2、爿/^入^AT转录因子、Z^"C2、
co6爿、AL4S4、 ^ "、玉米醇溶蛋白反向重复、B-peru和酵母 爿r尸-尸^x。所述盒可以与在组织中有功能的启动子可操作地连接，所述 组织选自胚、种子胚乳、子叶、糊粉和种皮。启动子可以例如选自油菜 籽蛋白(napin)启动子、卩-菜豆蛋白启动子、(3-伴大豆球蛋白(conglycinin)
9亚单位启动子、玉米醇溶蛋白启动子、Osgt-l启动子、油质蛋白启动子、 淀粉合酶启动子、球蛋白1启动子、大麦LTP2启动子、a-淀粉酶启动 子、壳多糖酶启动子、P-葡聚糖酶启动子、半胱氨酸蛋白酶启动子、谷 氧还蛋白启动子、HVA1启动子、丝氨酸羧肽酶II启动子、过氧化氢酶 启动子、a-葡糖苷酶启动子、(3-淀粉酶启动子、VP1启动子、USP启动 子、USP88启动子、USP99启动子、凝集素和bronze2启动子。可检测 表型可以通过检测催化活性进行测定。可检测表型可以选自种子颜色、 种子不透明度、种子发芽力、种子大小、种子生存力、种子形状、种子 紋理、以及缺陷或败育种子。种子的筛选可以通过自动化种子分选机来 完成。
在另一个方面，本发明提供了 DNA构建体，其包含(a)包含在目 的基因侧面的左和右T-DNA边界的第一种DNA区段，所述目的基因与 在植物中有功能的启动子可操作地连接，和(b)包含在种子中有功能 的启动子侧面的第二组左和右T-DNA边界的第二种DNA区段，所述启 动子与在种子中赋予可检测表型的DNA盒可操作地连接，所述种子包 含DNA盒和与在植物中有功能的启动子可操作地连接的选择标记基因。 目的基因可以赋予选自下述的性状除草剂耐受性、昆虫或害虫抗性、 抗病性、增加的生物量、改良的脂肪酸代谢、改良的碳水化合物代谢和 改良的营养质量。在所述构建体中，DNA盒和选择标记基因可以与相同 启动子可操作地连接。在一个实施方案中，DNA盒和选择标记基因与不 同启动子可操作地连接。在具体实施方案中，选择标记基因编码选自下 述的产物CP4EPSPS、膦丝菌素乙酰转移酶、DMO、 NptII、草甘膦乙 酰转移酶、突变型乙酰乳酸合酶、氨曱蝶呤抗性DHFR、茅草枯脱卣素 酶、PMI、 Protox、潮霉素磷酸转移酶和5-曱基色氨酸抗性邻氨基苯甲 酸合酶。在另一个实施方案中，DNA盒选自cw仏g^、妳、^c仏/wx、 花青苷合成基因、De/7/9-zaaM、 ro/仏OyCZ)尸AT2、爿尸2、 爿AT 转录因子、Zj C入5"/-/、 co6丄^4W、 ^"、玉米醇溶蛋白反向重复、 B-peru和酵母^ZP-尸fX。 DNA盒可以与在组织中有功能的启动子可操 作地连接，所述组织选自胚、种子胚乳、子叶、糊粉和种皮。在一个实 施方案中，DNA盒与选自下述的启动子可操作地连接油菜籽蛋白启动 子、(3-菜豆蛋白启动子、P-伴大豆球蛋白亚单位启动子、玉米醇溶蛋白 启动子、Osgt-l启动子、油质蛋白启动子、淀粉合酶启动子、球蛋白1启动子、大麦LTP2启动子、a-淀粉酶启动子、壳多糖酶启动子、P-葡 聚糖酶启动子、半胱氨酸蛋白酶启动子、谷氧还蛋白启动子、HVA1启 动子、丝氨酸羧肽酶II启动子、过氧化氢酶启动子、a-葡糖苷酶启动子、 卩-淀粉酶启动子、VP1启动子、USP88或USP99启动子、和bronze2启动子。
在另外一个方面，本发明提供了用本文提供的构建体转化的转基因 细胞和植物。在一个实施方案中，提供了用包含第一种DNA区段的DNA 构建体和包含第二种DNA区段的第二种DNA构建体共转化的转基因植 物，所述第一种DNA区段包含在目的基因侧面的左和右T-DNA边界， 所述目的基因与在植物中有功能的启动子可操作地连接，且所述第二种 DNA区段包含在种子中有功能的启动子侧面的第二组左和右T-DNA边 界，所述启动子与在种子中赋予可检测表型的DNA盒可操作地连接， 所述种子包含DNA盒和与在植物中有功能的启动子可操作地连接的选 择标记基因。还提供了此种植物的细胞。
在另外一个方面，本发明提供了包含右和左T-DNA边界的DNA构 建体，其中包含与在植物中有功能的启动子可操作地连接的目的基因的 第一种DNA区段位于右边界后，且.包含对植物种子赋予可检测表型的 DNA盒的第二种DNA区段位于左边界后，所述植物种子包含DNA盒 和与在植物中有功能的启动子可操作地连接的标记基因，例如选择标记 基因。
在另外一个方面，本发明提供了包含右和左T-DNA边界的DNA构 建体，其中包含对植物种子赋予可检测表型的DNA盒的第一种DNA区 段位于右边界后，所述植物种子包含DNA盒和与在植物中有功能的启 动子可操作地连接的选择标记基因，且包含与在植物中有功能的启动子 可操作地连接的目的基因的第二种DNA区段位于左边界后。
在另外一个方面，本发明提供了包含2个右T-DNA边界的DNA构 建体，其中包含与在植物中有功能的启动子可操作地连接的目的基因的 第一种DNA区段位于一个右边界后，且包含对植物种子赋予可检测表 型的DNA盒的第二种DNA区段位于另 一个右边界后，所述植物种子包 含DNA盒和与在植物中有功能的启动子可操作地连接的选择标记基因。
在另外一个方面，本发明提供了包含SEQIDNO: 2, SEQ ID NO: 3,或与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3具有至少70%、 75%、 85%
ii或95%同一性，且编码具有八氢番茄红素合酶活性的多肽的序列的分离
的核酸序列。在一个实施方案中，本发明还提供了包含SEQ ID NO: 2 或SEQ ID NO: 3的核酸序列的重组DNA构建体，或包含与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3具有至少71 % 、 80%、 90%、 95%、 98 %或99 %同 一性，且编码具有八氩番茄红素合酶活性的多肽的序列的重组DNA构 建体，其与在植物中有功能的异源启动子可操作地连接。包含此种序列 的宿主细胞是本发明的另 一 个实施方案，其中所述细胞是细菌细胞或植 物细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了转基因植物或种子，其包 含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 2， SEQ ID NO: 3,或 与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3具有至少71 % 、 80%、 90%、 95%、 98%或99%同一性，且编码具有八氬番茄红素合酶活性的多肽的序列。
附图简述
下述附图是本说明书的部分且被包括以进一步证实本发明的某些 方面。通过参考附图与本文呈现的具体实施方案的详细描述组合可以更 好地理解本发明。


图1. (A) pMON10338; (B) pMON10339;和(C) pMON67465
的示意图。
图2.用pMON67465转化的大豆组织中的CrtB表达。
图3.在来自事件A33908的种子中的CrtB表达。
图4.在未成熟的Rl种子中的cw仏gws和CP4/EPSPS表达。
图5.在成熟的Rl种子中的cwS表达。
图6. pMON67465种子的GUS染色。
图7.关于GUS阳性种子的CP4和CrtB PCR。
图8.用于筛选转基因事件的连锁-DNA印迹和筛选标记方法的比较。
图9.通过使用包含用于无标记种子的与CP4选择标记基因连接的 筛选基因的构建体转移的DNA序列的示意概括。A )在用于土壤杆菌属 介导的转化的一种构建体中，GOI位于一种T-DNA中，侧面为RB和 LB且与第二种T-DNA物理连接，所述第二种T-DNA包含与CP4选择 标记基因连接的筛选基因；B)包含2个边界的一种载体，将GOI置于 RB后，而将筛选和选择标记基因连同主链一起置于第二个RB后或置于
12LB后；C) GOI和筛选基因-DNAs在2种载体中分开，且转化到一种土 壤杆菌属细胞或分开的土壤杆菌属细胞中；D)来自GOI以及筛选和选 择标记基因的2种DNA区段的可能连接。只有单独的GOI将显示正常 的种子外观，而包含筛选基因的细胞显示可见表型；E)2种分开的DNA 区段包含GOI或筛选和选择标记基因用于非细菌介导的转化。 图10. pMON67420表示用于共转化的GOI构建体。 图11.质粒pMON99575,包含经由种子特异性玉米醇溶蛋白启动 子驱动的粟酒裂殖糖酵母(Sc/^oracc/ "ra附少c^ /wwZ e ) ATP依赖性果 糖磷酸激酶。
图12.表达种子特异性酵母ATP依赖性果糖磷酸激酶的玉米穗取消 了正常的仁发育。
图13.用于证实置于标记基因的内含子内的反向重复导致可见表型 的dsRNA编码构建体的示意图。
图14.包埋在内含子中的反向重复产生可见表型。
图15.玉米仁中的ct-玉米醇溶蛋白的沉默导致可见表型。
图16.包含《AS^/的pMON83530的示意图。
图17.用pMON83530转化的大豆种子的后代。左侧的种子由于表 达^4S4而皱缩并且指出选择标记的存在，而右侧的种子是正常和无标记的。
图18.包含《JW用作2T DNA构建体中的鉴定序列的
pMO画7314的示意图。
图19.包含^"基因用作鉴定基因的pMON68581的示意图。
图20.用pMON68581转化的后代大豆种子。右侧的种子由于表达
而皱缩并且指出筛选或选择标记的存在，而左侧的种子是正常和无
标i己的。
图21. 2T-DNA载体形式-示意图。
发明详述
下述是本发明的详细描述，提供用于帮助本领域技术人员实践本发 明。本领域普通技术人员可以在不背离本发明的精神或范围的情况下， 在本文描述的实施方案中进行修饰和变化。
本发明通过提供构建体和方法克服了现有技术中的缺陷，所述构建体和方法基于由种子表达的鉴定基因、序列或盒赋予的表型，允许有效 区分缺乏鉴定序列和标记基因序列但包括一种或多种目的基因(GOI ) 的种子与包含鉴定基因序列和标记基因序列的种子。具体地，在一个实 施方案中，本发明提供了用于转化植物细胞的转化构建体和方法，其包
括(i)目的基因；和(ii)在种子中表达且与选择或筛选标记基因物
理连接的鉴定序列，所述选择或筛选标记基因可以在各种植物组织中表
达，其中构建体和/或转化法这样设计，从而使得(i)和(ii)的遗传元 件可以独立整合到植物基因组内，且因此在遗传上彼此分离。
鉴定序列在种子组织中的表达或其的缺乏允许直接鉴定种子和植 物，所述种子和植物缺乏种子表达的鉴定序列和物理连接的选择或筛选 标记基因，同时允许选择仍包含目的转基因的种子和植物。在种子水平 上选择包括目的基因且缺乏标记基因序列的种子代表显著进步，因为它 避免了先前使用的相对昂贵和劳动力密集的筛选法的需要。另外可以节 省时间，因为筛选可以在发芽前或在发芽期间完成，而不需要使植物的 下一代生长至允许组织收获的大小，如例如对于连锁-DNA印迹分析所 需的。
在一个实施方案中，通过土壤杆菌属或其他根瘤菌介导的方法进行 植物组织的转化(参见例如，于2006年5月16日提交，名称为"Use of Non-y4gro/ a"e〃'ww Bacterial Species for Plant Transformation"且指定4戈 理受理号MONS: 100USP1的美国临时专利申请系列号60/800,872,所 述美国临时专利申请的完整公开内容特别引入本文作为参考)，并且包 括在种子中表达的鉴定序列和物理连接的选择或筛选标记基因的DNA 序列一起存在于转移到植物细胞内的T-DNA或其他序列(例如，载体 主链)上(例如，侧面为T-DNA RB和/或LB序列或不含边界序列)。 鉴定序列和标记基因可以物理连接地转移给植物，而目的基因存在于分 开的T-DNA上，侧面为其自身的RB和LB序列或转移到植物细胞内的 其他序列，并且可以整合到独立基因座上(例如图21)。选择和/或筛 选标记允许鉴定转化的植物组织。可以获得能育的植物并且在育种方案 中进行自交或杂交，以跟踪下一代中的表型分离。用于执行此种育种的 策略是本领域众所周知的，并且在不同植物之间在细节方面可以有变 化。鉴定序列的种子表达或缺乏表达允许就标记和鉴定序列的存在而言 容易的鉴定种子。目的基因例如可以包含编码选自下述的性状的至少一
14个植物表达盒除草剂耐受性、抗生素抗性、昆虫抗性、抗病性、抗应 激性(例如干旱和寒冷)、增强的营养物使用效率、增强的营养含量(例 如，氨基酸、蛋白质、糖、碳水化合物、脂肪酸和/或油)、不育系统、 工业酶(例如，药物和用于生物燃料的加工酶)和增强的产量。
可以转移到植物细胞内的序列(例如T-DNAs)可以存在于用于转 化的细菌菌林中的一个转化载体上。在另一个实施方案中，序列包括鉴 定序列和植物选才奪标记以及包含目的基因的序列可以存在于细菌菌株 中的分开的转化载体上。在另外一个实施方案中，可以在一起用于转化 的分开的细菌细胞或菌抹中发现，包括鉴定序列和植物选择标记的 T-DNA以及包含目的基因的T-DNA。
在另外一个实施方案中，DNA序列包括(i)目的基因；和(ii)在 种子中表达且与选择或筛选标记基因物理连接的鉴定序列可以通过物 理方法例如微粒轰击引入植物细胞内。在此种实施方案中，(i)和(ii) 的DNA序列可以位于分开的DNA片段上，所述分开的DNA片段可以 在用DNA包被微粒之前或期间混合在一起。DNA序列可以存在于单个 微粒上，或它们可以存在于分开的微粒上，所述分开的微粒在轰击前混 合在一起。
由鉴定序列传递的表型可以通过下述来达到与组成型或种子特异 性启动子连接的异源或内源基因的异位超表达，或使用反义RNA、 RNA 干扰或共抑制技术下调内源基因。内源基因的例子可以包括但不限于， 涉及糖/淀粉代谢、蛋白质代谢和脂肪酸代谢的基因。
在一个实施方案中，鉴定序列的种子表达导致在包含鉴定序列的转 基因植物的种子中的可检测表型。在某些实施方案中，表型可以通过目 测进行检测，且可以包括种子颜色、不透明度(或半透明度)、荧光、 紋理、大小、形状、发芽力、生存力、或通常任何组分或性质中的变化，
因型中发现的那种。在某些实施方案中，鉴定序列包括gwW、妳(Pang 等人，1996)、八氬番茄红素合酶、或八氢番茄红素去饱和酶编码基因、 或花青普基因(Pl、 Lc、 B-Peru、 Cl、 R、 Rc、 或侈寸^口 Selinger
等人，1998; Ludwig等人，1989; Himi等人，2005; Kobayashi等人， 2002 ))。在具体实施方案中，鉴定基因包含编码八氢番茄红素合酶的 crW基因(美国专利号5,429,939; US 6,429,356;美国专利5,545,816 ),包括包含对于在单子叶植物例如玉米植物中的表达进行了密码子最优 化的序列的基因。可以在这点上使用的基因的另 一个例子是涉及种 子色素生产的基因。
在其他实施方案中，表型可通过催化活性的检测进行测定。在另外 一个实施方案中，表型是组织切除表型，例如花粉、卵或种子组织的形 成中的阻断。还设想了包括标记基因、沉默配子生产或生存力所需的基 因从而减少或阻止受精的组合物和方法。例如，可以使用导致花粉发育 和生存力所需的基因沉默的序列。衍生自携带标记基因的减数分裂分离 子的花粉将不发育或将是不能存活的，从而阻止标记基因通过花粉传递 给后代。在异型杂交授粉中，所有后代将是无标记的。还设想了导致其
他内源基因沉默(例如，RNAi技术包括miRNA)以导致种子表型的序 列的使用。此种基因包括但不限于编码或修饰种子贮藏蛋白例如玉米 醇溶蛋白的表达的基因，Opaque2,『a矽，和编码涉及种子中的碳水化 合物、蛋白质和/或脂质积聚的蛋白质的其他基因。
赋予不能存活的花粉表型的鉴定序列的表达也是希望的，因为当携 带在花粉特异性启动子控制下的鉴定序列的转基因品系用作雄性传粉 者时，仅不含鉴定序列的花粉粒将能够使卵受精，从而增加无鉴定序列 和标记序列的种子得率。鉴定序列可以生产对于花粉致命或对于花粉萌 发抑制性的蛋白质。可替代地，与基本内源的花粉基因同源的一对反向 重复的表达可以用于沉默使得花粉不能存活的基因。花粉特异性基因和 启动子的例子是本领域技术人员已知的，并且包括例如如描述的(Eyal 等人，1995 ) LAT52和LAT59基因以及番茄启动子。
在另一个实施方案中，鉴定序列可以在种子和花粉中进行表达，用 于进一 步增强具有目的基因的种子的选择且消除具有鉴定序列和标记 基因的种子。这可以通过使用包含2种转基因的鉴定序列来达到；所述 转基因之一在种子中表达且另一种在花粉中表达。可替代地，可以在花 粉和种子中表达相同鉴定序列的启动子还可以导致在花粉和种子中的 可检测表型。在花粉和种子中表达的启动子的例子是来自玉蜀黍Waxy 基因(zmGBS; Shure等人，1983 )和稻小亚基ADP-葡萄糖焦磷酸化酶 基因(osAGP; Anderson等人，1991)的启动子。花粉和种子表达模式 也在Russell和Fromm, 1997中得到描述。
鉴定序列可以可替代地改变碳水化合物、蛋白质、脂质或者细胞或
16种子代谢的其他产物，以便产生可检测表型。在一个实施方案中，鉴定
序列允许编码果聚糖蔗糖酶或酵母ATP依赖性果糖磷酸激酶 (ATP-PFK)的McS基因的胚乳特异性表达，这取消包含鉴定序列和标 记基因的种子中的淀粉积聚(Caimi等人，1996;图12)。鉴定序列可 以是基因。鉴定序列可以进一步编码转录或翻译融合物(例如U.S. 6,307,123;美国专利公开20060064772 )。
美国专利6,307,123涉及选择标记基因("/^n )和筛选标记基因(妳) 之间的翻译融合物的构建。可以应用该方法以产生本文描述的鉴定序列 和本文描述的选择或筛选标记之间的融合物。
可以用于制备多肽融合物的另 一种方法基于泛蛋白(Ub )加工途径。 这种方法可以用于将包含2个蛋白质结构域的长多肽切割成2种分开的 活性蛋白质。在这种方法中，单个基因盒可以编码2个ORFs,其中例 如关于cw5和EPSPS-CP4的2个ORFs可以由Ub的14个C末端氨基 酸分开，随后为全长Ub序列。在体内翻译后，内源性脱遍在蛋白酶 (DUBs)将多蛋白切割成3个分开的单位l)N末端蛋白质，其包含 终止于Ub的14个C末端氨基酸的鉴定序列crW; 2)Ub单体；和3) C末端多肽，其编码选择标记EPSPS-CP4。此种方法是本领域技术人员 已知的(例如Walker等人，2007)。
通过使用内部核糖体进入位点(IRES)可以制备鉴定序列和选择或 筛选标记之间的转录融合物。例如，可以制备编码crW的ORF随后为 ESPSP-CP4的ORF的转录物，其中在它们之间放置功能IRES元件。几 种IRES是本领域技术人员已知的(参见例如引入本文作为参考的 Dinkova等人2005和其中的参考文献;和美国专利7,119,187 )。
化学、免疫学和基于核酸(例如基于PCR)的方法进行检测。鉴定序列 可以在种子组织中赋予可检测表型，其可以与标记基因的表型区分开。 由鉴定序列赋予的表型可以包括改变的种子发芽。鉴定序列可以在种子
(仁)的一个或多个部分中表达，包括胚、胚乳、子叶和种皮(外种皮)， 从而使得可以辨别表型。
鉴定序列还可以引起无种子表型。为了实现组织切除，在一个实施 方案中，鉴定序列指导6/e/7/9-wa7W或在植物中的胚珠特异性表达
(例如Rotino等人1997, Carmi等人2003 ， GenBank AM422760， X64255,
1AE009418 )，这取消了胚珠发育且导致在包含标记和鉴定序列的子房中 的无种子表型。在另外一个实施方案中，鉴定序列指导OsCDPK2在谷 类农作物中的超表达，从而破坏种子发育(Morello等人2000;例如， GenBank Y13658 )。
遗传元件还可以设计为抑制内源基因的表达，从而导致产生允许区 分包含标记基因的种子与不包含的那些的种子表型。这种鉴定序列的遗 传元件与标记基因物理连接，例如包埋在标记DNA盒内，从而使得种 子表型与标记的存在连锁，允许快速鉴定包含标记的种子。
RNAi可以用于沉默一种或多种基因，从而导致容易评分、优选可 见的种子表型。RNAi介导的种子表型所需的DNA序列位于与标记基因
将容易鉴定。此种种子将无需进行生长且就标记基因的存在进行筛选。 因此，仅不含由鉴定序列赋予的表型的种子进行生长和/或就GOI的存 在进行筛选。依赖于种子来自自花传粉还是异型杂交，这种方法减少了 需要种植且对于自交植物物种通过至少3X或对于异型杂交植物物种通 过IX筛选的种子数目。
可以用于使用RNAi相关途径沉默靶基因的广泛多样的组合物是本 领域技术人员已知的。 一个实施方案是装配DNA盒，所述DNA盒将转 录序列的反向重复，以产生双链RNA (dsRNA), —般长度是至少约 19-21 bp且对应于耙向用于沉默的 一种或多种基因的部分。dsRNA长度 可以是约19-21 bp且对应于靶向用于沉默的一种或多种基因的部分。包 括鉴定序列的这种DNA盒位于与选择标记基因相同的T-DNA内。本领 域技术人员已知的沉默基因的其他方法包括但不限于共抑制、反义、 miRNAs (天然或改造的)的表达、反式作用siRNAs的表达和核酶的表 达。如果基因沉默效应所需的序列位于与标记基因相同的T-DNA中， 那么可以使用这些方法中的任何一种。
鉴定序列可以增加或减少种子大小。在一个实施方案中，鉴定序列
予爿尸2基因(例如，GenBank U12546 )的下调，这导致包含鉴定序列 和选择标记基因的较大种子。还可以通过j/^2基因(Schruff等人，2006; 例如，GenBank登记NM—203251; NM—180913 )或JAT转录因子 (Mizukami和Fisher, 2000;例如，GenBank NM 202701、 NM 119937、NM—180024、 NM—101474、 NM—202110 )的异位表达来达到较大的种子 大小。在另一个实施方案中，鉴定序列通过反义或RNAi或共抑制技术 来传递Zj C2 (例如，GenBank AF400123 )或GenBank AB101657、 AB101656、 AB101655 )基因的下调，这导致减少的种子大小(Mendoza 等人，2005; Radchuk等人，2006)。改变的种子大小可以通过人工和/ 或机械方法经由重量、形状或筛分容易地分选。
检测表型的种子。用这种方式可以有效筛选大量种子，并且可以收集缺 乏鉴定序列的种子。自动化技术可以比依赖人类技术员更快速、更廉价 和更精确。已描述了可以以这种方式使用的此种种子分选机。例如，美 国专利号4,946,046描述了用于根据颜色分选种子的装置。在这种机器 中，通过将种子置于旋转鼓中一致的凹槽行中且使种子在数字成像相机 和光源下经过根据颜色分选种子。通过相机阅读图像且输入计算机，所 述计算机还接受来自鼓速度传感器的信息。计算机产生引起气流吹过包 含有色种子的凹槽底部的开口的信号，以收集此种种子。将收集的种子 注入收集漏斗内，并且将无色种子注入分开的漏斗内。
通过改变用于检测有色种子的光源的波长，以及置于有色种子和检 测相机之间的屏障滤光片，可以用这种技术检测可能地任何鉴定标记。 例如，为了检测表达GFP的种子，激发波长在蓝光UV谱中， 一般在约 395 nm处。用于UV发射的合适的光源是本领域技术人员众所周知的并 且包括氱和汞灯。合适的滤光片组也是本领域技术人员众所周知的，并 且包括例如BP450-4卯激发器滤光片、FT510彩色分束器和BP515-565 屏障滤光片(Carl Zeiss, Inc., Thornwood， NY)。此种滤光片组和发 射波长在Heim和Tsien, 1996中更详细讨论，其^^开内容特别整体引 入本文作为参考。
通过使用包括一种或多种鉴定序列的构建体，选择能力可以扩展至 多种选择和/或筛选基因和目的基因。因此，可以有效筛选表示多种不同 的转化事件的大量转基因种子，并且可以选择仅具有(或缺乏)所需鉴 定序列组的那些种子。
重组DNA载体可以例如是线性DNA区段或闭合环状质粒。载体系 统可以是单个载体或质粒或者一起包含待引入植物基因组内的总DNA 的2个或更多载体或质粒。如本文所述的核酸分子可以例如适当地插入
19载体内在合适的启动子的控制下，所述启动子在植物细胞中起作用，以
驱动连接的编码序列或其他DNA序列的表达。许多载体可用于这个目 的，并且合适的载体的选择将主要依赖于待插入载体内的核酸的大小和
待用载体转化的具体宿主细胞。依赖于其功能和与之一起使用或相容的 具体载体和植物细胞，每个载体包含各种组分。
适合于稳定转化植物细胞或确立转基因植物的许多载体是众所周 知的，例如Gelvin等人(1990)。 一般地，植物表达载体包括但不限于， 一个或多个目的基因转录单位，其中每个包括5'非翻译区，其包括控 制可操作地连接的蛋白质编码序列("可读框"，ORF)的转录(例如， 顺式作用启动子序列例如增强子、转录起始开始位点等)和翻译(例如， 核糖体结合位点)的序列；3'非翻译区，其包括来自植物基因的3'末端 的另外调节区(Thomburg等人，1987) ; An等人，1989 ),例如3'终 止子区以增加mRNA稳定性。可替代地，植物表达载体可以设计用于表 达mRNA分子，其例如可以通过RNAi介导的方法改变植物基因表达。 此外，此种构建体通常包括选择和/或筛选标记转录单位和任选地复制起 点或载体在细菌宿主细胞中复制所需的其他序列。
构建体还可以包含在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择的质 粒主链DNA区段，例如，大肠杆菌(E^c/2enc/n'a co/z')复制起点例如 on322、广宿主范围复制起点例如on'V或oriRi、和关于选择标记的编码 区，例如编码赋予对于壮观霉素或链霉素的抗性的Tn7氨基糖普腺芬酸 转移酶(aat^)的Spec/Strp，或庆大霉素(Gm, Gent)选择标记基因。 对于植物转化，宿主细菌菌林通常是携带具有用于表达单位的转移功能 的质粒的才艮癌土 i裒杆菌(」gra6a"en力m fwwe/ac/em ) ABI 、 C58 、 LBA4404、 EHA101或EHA105。植物转化领域技术人员已知的其他菌 林可以在本发明中起作用。
植物表达载体任选包括RNA加工信号，例如可以在转基因中置于 多肽编码序列的上游或下游的内含子。此外，表达载体还可以包括来自 植物基因的3'非翻译区的另外的调节序列。这些3'非翻译区包含mRNA 转录终止信号。包含在植物表达载体中的其他可移动元件可以包括5'前 导序列、转运信号序列和编码序列。
表达和克隆载体可以包含选择基因，也称为植物选择标记。这种基 因编码在选择性培养方案中生长的转化植物细胞的存活或生长所需的蛋白质。 一般的选择基因编码赋予对于选择剂的抗性的蛋白质，所述选 择剂例如抗生素，包括除草剂或其他毒素，例如新霉素、氨曱蝶呤、麦 草畏、草铵膦或草甘膦。用异源蛋白质或其片段成功转化的那些细胞产 生赋予例如抗药性的蛋白质，且从而经受得住选择方案。各种选择/筛选
/可评分标记的例子和编码其的基因公开于Miki和McHugh, 2004中。
用于生产mRNA的表达载体还可以包含诱导型或组织特异性启动 子，其在宿主植物细胞中被识别且与编码目的核酸分子或其片段的核酸 可操作地连接。植物启动子在下文得到讨论。
在一个实施方案中，使用的植物转化载体包括分离和纯化的DNA 分子，包括与本发明的 一种或多种核酸序列可操作地连接的异源种子特 异性启动子。在另一个实施方案中，启动子是种子表达的，但不是种子 特异性的。植物转化载体可以包含来自一种或多种基因的序列，从而允 许在植物细胞中生产超过一种mRNA。本领域技术人员将容易理解可以 将DNA的区段组合到单个复合DNA区段内用于在转基因植物中表达。 认为用于与本发明 一 起使用的用于转化宿主细胞的合适方法包括 通过其可以将DNA引入细胞内的事实上任何方法(参见，例如Miki等 人，1993 ),例如通过原生质体的转化(美国专利号5,508,184; Omirulleh 等人，1993 )、通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等人，1985 )、 通过电穿孔(美国专利号5,384,253 )、通过用碳化硅纤维搅动(Kaeppler 等人，1990;美国专利号5,302,523;和美国专利号5,464,765 )、通过 土壤杆菌属介导的转化(美国专利号5,563,055; 5,591，616; 5,693,512; 5,824,877; 5,981,840; 6,384,301 )和通过DNA包被粒子的加速(美国 专利号5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6,160,208; 6,399,861; 6,403,865; Padgette等人1995 )等。通过诸如这些的技术的应用，可以稳定转化事 实上任何物种的细胞。在多细胞物种的情况下，转基因细胞可以再生成 转基因生物。
用于将表达载体引入植物内的最广泛使用的方法基于土壤杆菌属 的天然转化系统(例如，Horsch等人，1985 )。根癌土壤杆菌和发根土 壤杆菌(A r/nzoge"e^ )各自的Ti和Ri质粒携带负责植物的遗传转化的 基因。土壤杆菌属载体系统和用于土壤杆菌属介导的基因转移的方法的 描述由众多参考文献提供，包括Gruber等人，1993; Miki等人，1993, Moloney等人，1989,以及美国专利号4,940,838和5,464,763。其他细
21菌例如与植物天然相互作用的中华根瘤菌属、根瘤菌属和中生根瘤菌属
可以进行修饰以介导至众多不同植物的基因转移(Broothaerts等人， 2005 )。这些植物相关的共生细菌可以通过获得使得无效的Ti质粒和 合适的二元载体制备成感受态的用于基因转移。待经由土壤杆菌属介导 的转化法转移的DNA序列包括通常限定转移DNA (T-DNA)范围的一 个或多个"边界"序列，例如右边界(RB)和左边界(LB)序列，所述 转移DNA包含在植物细胞中待表达的一种或多种基因，且可以进一步 包括增强子序列，例如如美国临时专利申请号60/831,814中公开的超驱 动序列(Toro等人，1989 )或多个超驱动序列，所述美国临时专利申请 引入本文作为参考。
在棉花转化的背景中可以特别有用的技术公开于美国专利号 5,846.797、 5,159,135 、 5,004，863和6,624,344中。用于转化芸苔属 (v5ra^,c")植物的技术特别公开于例如美国专利5,750,871中；且用于 转化大豆的技术公开于例如Zhang等人，1999，美国专利6,384,301和 US 7,002,058中。用于转化玉米的技术公开于WO9506722中。可以在 本发明中找到用途的植物的一些非限制性例子包括苜蓿、大麦、豆类、 甜菜、嫩茎花椰菜、甘蓝、胡萝卜、低芥酸菜子、花椰菜、芽菜、大白 菜、玉米、棉花、黄瓜、干菜豆、茄子、茴香、四季豆、银果、韭、莴 苣、瓜、燕麦、秋葵、洋葱、豌豆、胡椒、南瓜、花生、马铃薯、南瓜、 萝卜、稻、高粱、大豆、菠菜、西葫芦、甜玉米、甜菜、向日葵、番茄、 西瓜和小麦。
载体或构建体还可以包括各种调节元件。5'非翻译前导序列可以衍 生自选择用于表达本发明的DNA分子的异源基因序列的启动子，并且 若需要则可以特别修饰以便增加mRNA的翻译。5'非翻译区还可以得自 植物病毒RNAs (例如烟草花叶病毒、烟草蚀斑病毒、玉米矮花叶病毒、 苜蓿花叶病毒)，来自合适的真核基因、植物基因(小麦和玉蜀黍叶绿 素a/b结合蛋白质基因前导区)或来自合成基因序列。前导序列还可以 衍生自无关启动子或编码序列。在本发明的背景中有用的前导序列包括 玉蜀黍Hsp70前导区(整体引入本文作为参考的美国专利号5,362,865 和美国专利号5,859,347 )和TMVw元件(Gallie等人，1989 )。翻译前 导序列的例子尤其包括玉蜀黍和矮牵牛花热激蛋白前导区(美国专利号 5,362,865 )、植物病毒外壳蛋白质前导区、植物核酮糖二磷酸羧化酶-
22加氧酶前导区、GmHsp (美国专利5,659,122 ) 、 PhDnaK ("美国专利5,362,865 ) 、 AtAntl、 TEV ( Carrington和Freed, 1990) 、 AGRtunos(GenBank登记V00087; Bevan等人，1983 ) 、 OsActl (美国专利5641876 ) 、 OsTPI (美国专利号7,132,528 )和OsActl5 (美国
发明者D·沃特斯, L·吉尔伯森, M·W·彼得森, P·S·肖梅特, S·约翰森, S·黄, X·叶 申请人:孟山都技术有限公司