专利名称：利用蛋白酶和蛋白酶抑制剂血浆分析检测舒张期心力衰竭的制作方法
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2006年5月9日提交的美国临时申请No.60/798,953和2007年3月8日提交的美国临时申请No.60/893,781的权益，上述申请均通过引用的方式全文纳入本申请。
联邦资助研究相关声明
本申请是在退役军人事务部(Depar tment of Veterans Affairs)的价值评议综述(Spinale 0001)研究服务(Merit Review(Spinale 0001)Research Service)第VA号合同以及国家心脏、肺、血液研究所授予的第PO1-HL48788、RO1-HL-59165和MO1-RR-01070-251号合同的政府资助下完成的。
背景技术：
尽管在高血压(血压过高)药物以及在认为高血压是发生心力衰竭的重大危险因素这一认识方面已取得长足进步，在美国，该疾病仍然是主要的心血管疾病。识别具有发生高血压心力衰竭风险的患者的一个具体问题是，缺乏一种快速筛选测试来识别出现高血压继发心肌自身改变的患者。长期高血压使得心肌质量以及大小增加，但该现象直到该疾病过程的晚期才会出现。高血压性心脏病和心力衰竭疾病进程中的一个独特的关键事件是，心肌自身纤维化加剧。这种改变的分子基础至今未知。
发明内容
根据本发明的目的，如本文所具体体现并广泛描述的，本发明涉及发生高血压性心力衰竭的患者体内出现的独特的MMP/TIMP模式，该模式事实上能预测异常心脏功能的存在，而在此之前只可能通过昂贵且难于实施的测试法来识别这种存在。这种独特的MMP/TIMP模式被用于识别具有发生高血压继发性心力衰竭风险和即将发生高血压继发性心力衰竭的患者的方法中。
本申请公开的方法和组合物的其他优点将部分通过下述说明书加以阐释，部分通过说明书理解得到，或者可通过实施本申请公开的方法和组合物获悉。本申请公开的方法和组合物的优点可通过随附的权利要求中特别指出的要素和组合实现和获得。应理解，前文的总体描述和下文的具体描述均仅为示例性和解释性的，对所要求保护的发明并无限制作用。
附图被纳入本说明书并构成本说明书的一部分，附图示出了所公开的方法和组合物的几个实施方案，并与说明书相结合以阐明所公开的方法和组合物的原理。
图1示出了存在和不存在高血压的参比对照中的MMP-13的检测限以及存在和不存在慢性心力衰竭的LVH中的检测限。LVH患者中的MMP-13检测限显著降低。*＝与无高血压的参比对照相比p<0.05，#＝与有高血压的参比对照相比p<0.05，Δ＝与无CHF的LVH相比p<0.05。
图2A示出了基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)和左心室容积/质量之比之间的关系。较高的TIMP-1水平与较低的LV容积/质量之比相关，这表明同心性重构(concentric remodeling)更为明显，r＝-0.56，p<0.05。图2B示出了基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)与组织多普勒显像(TDI)快速充盈波(E’)之间的关系。较高的TIMP-1水平与较低的E′值相关，这表明LV舒张期的舒张速率减慢，r＝-0.41，p<0.05。
图3示出了正常心脏与舒张期心力衰竭的心脏的结构和功能比较。
图4示出了存在和不存在高血压(HTN)的对照以及存在和不存在充血性心力衰竭(CGF)的心室肥大受试者的超声心动图显象结果，以及血浆MMP-9、MMP-2和TIMP-1测量结果。
图5示出了相对于TIMP-1水平的组织多普勒显像(TDI)快速充盈波(E’)。
图6示出了对照和左心室肥大受试者的血浆MMP-13水平。
图7示出了存在或不存在充血性心力衰竭且血浆TIMP-1水平高于或低于1200ng/ml的左心室肥大患者的百分比。
图8示出了多元分析法测定的MMP-9、MMP-13、TNF-α和IL-6的校准曲线。
图9示出了通过MMP和TIMP水平来确定对高血压患者的治疗的算法。图9A示出了被证实患有高血压且定期进行非急诊的门诊访问的患者的治疗示意图。图9B示出了患有新高血压发病且进行非急诊的门诊访问的患者的治疗示意图。图9C示出了表现出可能由HF所致的征候或症状的患者的治疗示意图。
具体实施例方式 参照以下对纳入本文中的具体实施方案和实施例的详细描述，并参照附图和其相关的前后文描述，可更容易的理解所公开的方法和组合物。
公开了可用于所公开方法和组合物的、可与所公开方法和组合物一起使用的、可用于制备所公开组合物的和作为所公开方法和组合物的产品的物质、组合物和组分。在本文中公开了这些物质和其他物质，应当理解的是，在公开这些物质的组合、子集、相互作用和群组等时，尽管关于这些化合物的每种具体的不同的个体和集体的组合和排列可能并未明确地公开，但每种都在此被特别地考虑和描述。例如，如果公开和讨论了一种肽，并且讨论了可以对包括该肽在内的许多分子进行的许多修饰，则除非特别指明相反，肽的每种和各种组合和排列以及可能的修饰均得到特别地考虑。因此，如果公开了一类分子A、B和C，并且还公开了一类分子D、E和F以及一个组合分子的实例A-D，则即使没有每个逐一列举，每个组合分子也单独和共同得到考虑。因此，在这个实例中，组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E以及C-F中的每种也被特别地予以考虑，并且认为上述每一个组合也因为A、B和C；D、E和F；以及实例组合A-D的公开而被公开。同样，这些分子的任何子集或组合也被特别地予以考虑和公开。因此，例如，A-E、B-F和C-E的子群也被特别地考虑，并被认为因为A、B和C；D、E和F；以及实例组合A-D的公开而被公开。将这一概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和应用所公开组合物的方法中的步骤。因此，如果有可以实施的多个其他步骤，则应当理解的是，所述其他步骤的每一步都可以用于所公开方法的任何具体实施方案或实施方案的组合，并且每种这样的组合都被特别地予以考虑和被认为公开了。
本领域技术人员仅仅通过常规实验就可意识到或者能确定本文所述方法和组合物的具体实施方案的许多等同方案。下文的权利要求意在涵盖这类等同方案。
应理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的具体方法、方案和试剂，它们可以有变化。还应理解，本文所用术语旨在仅描述特定的实施方案，而非意在限制本发明的范围，本发明的范围只由随附的权利要求限定。
除非另外清楚说明，本文所述的任何方法都不应被解释为，需要按特定的顺序实施其步骤。因此，当一个方法权利要求未述及其步骤所遵循的顺序，或者未在权利要求或说明书中特别说明该步骤限于特定顺序，则在任何方面都不应认为存在某种顺序。这一点适用于任何可能的用于解释的未说明的基础，包括步骤或操作流程设置相关的逻辑关系、源于语法结构或标点的明显语义，以及说明书中记载的实施方案的数目和类型。更具体而言，已被测量含量的MMP和TIMP可以具有任何数量级的所述测量值。
A.定义 除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有与所公开的方法和组合物所属领域技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然在实施或测试本发明的方法和组合物时可以使用与本申请所述方法材料类似或等同的任何方法和材料，但特别有用的方法、装置和材料如所描述的那样。本文所引用的出版物以及它们所引用的材料通过引用的方式具体地纳入本说明书。本文的任何内容均不应被解释为承认，本发明未被赋予优先于现有技术中的这类公开内容的权利。未承认任何参考文献构成现有技术。参考文献中的讨论陈述了其作者所声称的内容，申请人保留质疑所引用的文献的准确性和相关性的权利。
应注意，除非上下文中另外明确指出，本文以及后附权利要求书中使用的单数形式的“一”、“一种”和“该”包括复数指代对象。因此，例如，“一种肽”的指代对象包括多种这类肽，“该肽”的指代对象指代一种或更多种肽及本领域技术人员已知的其等同物等等。
“任选的”或“任选地”意为后面描述的事件、情况或物质可能或也可能不出现或存在，这样的描述包括所述事件、情况或物质出现或存在的情况和所述事件、情况或物质不出现或不存在的情况。
本文中范围可以表示为从“大约”一个具体的数值，和/或至“大约”另一个具体的数值。当表示为这种范围时，另一个实施方案包括从所述的一个具体的数值和/或至所述的另一个具体的数值。类似地，当通过在前面使用“大约”将数值表示为近似值时，应当理解的是，该具体的数值构成另一个实施方案。应当进一步理解的是，每个范围的端点在与另一个端点相关和独立于另一个端点时都是有意义的。还应当理解的是此处公开了许多数值，且除了数值本身外每一个数值在此还被公开为“大约”该具体数值。例如，如果公开了数值“10”，那么也公开了“大约10”。还应当理解的是，当公开了一个数值时，也公开了“小于或等于”该数值，“大于或等于该数值”以及数值间可能的范围，这正如本领域技术人员所恰当理解的。例如，如果公开了数值“10”，也就公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在整个本申请中，以多种不同格式提供数据，该数据代表了端点和起点，以及这些数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了具体数据点“10”和具体数据点15，应该理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15，以及10和15之间的数值也认为已经被公开。还应理解的是两个特定单元之间的每个单元也都被公开了。例如，如果10和15被公开了，那么11、12、13和14也都被公开了。
在本申请的说明书部分和权利要求部分的通篇中，词语“包括”及其变形(例如“包含”和“含有”)的含义为“包括但不限于”，并不意在排除例如其它的添加物、组分、整数或步骤。
“受试者”包括但不限于动物、植物、细菌、病毒、寄生虫和任何其他具有核酸的生物或实体。所述受试者可以是脊椎动物，更具体而言可以是哺乳动物(例如，人类、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人类灵长类、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼、鸟或爬行动物或两栖动物。所述受试者可以是无脊椎动物，更具体而言可以是节肢动物(例如，昆虫和甲壳动物)。该术语并不指明特定的年龄和性别。因此，该术语意欲涵盖雄性或雌性的、成年的和新生的受试者以及胎儿。患者是指患有一种疾病或病症的受试者。术语“患者”包括人类或兽医学的受试者。
本文定义的“样本”是指由一种生物体获得的任何样本。生物样本的实例包括体液和组织标本。所述样本的来源可以是生理介质，例如血液、血清、血浆、母乳、脓、组织刮屑、洗液、尿、组织，例如淋巴结等等。
本申请通篇引用了各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用的方式全文纳入本申请，以便更充分地描述与本发明所属的现有技术状况。所公开的参考文献中倚赖所述参考文献的句子中所论述的素材也通过引用的方式单独地并特别地纳入本说明书。
B.方法 1.心力衰竭 充血性心力衰竭(CHF)也被称之为充血性心衰(CCF)或仅仅称为心力衰竭，它是一种由损害心脏充盈或者泵出充足的全身血量的能力的任何结构性或功能性心脏病症所致的疾病。因此，所公开的方法可用于治疗任何形式的心力衰竭。
由于并不是所有患者都在初始或后续评价时具有容量过度负荷，因此术语“心力衰竭”优于曾用语“充血性心力衰竭”。充血性心力衰竭的病因或促因包括以下所列(并具体指出左侧(L)还是右侧(R))CHF遗传家族史、缺血性心脏病/心肌梗死(冠状动脉疾病)、感染、饮酒、犬恶丝虫、贫血、甲状腺毒症(甲状腺功能亢进症)、心律失常、高血压(L)、主动脉狭窄(L)、主动脉[瓣]狭窄/反流(L)、二尖瓣反流(L)、导致肺源性心脏病(R)的肺动脉瓣狭窄/肺动脉高压/肺栓塞，以及二尖瓣病(L)。
心力衰竭有多种不同的分类方式，包括涉及心脏哪侧(左心衰竭和右心衰竭)，异常是否由心脏的收缩或舒张引起(收缩期心力衰竭和舒张期心力衰竭)，异常是否由低心输出量或低体循环血管阻力(低排血量心力衰竭和高排血量心力衰竭)。
充血性心力衰竭(CHF)是心脏效能——特别是左心室(LV)功能的潜在疾病所致的征候和症状群(即呼吸急促、积液)。CHF的病因有多种，可以主要分为以下三类心脏病发作(心肌梗死)后的CHF、伴随高血压心脏病的CHF，和伴随内部肌肉疾病(通常称为心肌病)的CHF。鉴定例如由高血压心脏病导致的CHF的潜在病因还很困难，这成为本发明的方法的关注焦点。具体而言，高血压心脏病导致LV肌肉生长，这被称之为肥大。LV肥大(LVH)通过其自身或者LV肥大自身可导致心肌功能缺陷，但在此之前都还没有快速准确识别LVH的血液测试。本申请发现了一种识别LVH患者的有效新方法。如果LVH过程继续或者未得到充分治疗，则患者将会出现主要是由于舒张期心力衰竭(DHF)导致的CHF征候和症状。然而，到迄今为止都还很难识别患有CHF(主要是DHF)的患者，也无法用简单快速的血液测试来识别这些患者。本申请发现了一种识别存在LVH的患者、存在发生DHF风险的患者的有效新方法，以及识别DHF患者的方法。因此，本发明提供了一种检测LVH的存在、预测可能存在发生DHF高风险的患者以及识别DHF患者的手段。通过使用小量的体液样本，例如下述的血样，可以进行本方法的四种(但不必排他地)独立应用筛选、预测/预后、诊断和治疗监测。
因此，本文公开了一种诊断患有左心室肥大(LVH、HCM或HOCM)的受试者的方法。例如，提供可一种检测受试者体内LVH的方法，包括识别所述受试者体液的基质金属蛋白酶(MMP)和基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的谱，本文中所述受试者伴随有舒张期心力衰竭(DHF)。还提供了一种预测受试者舒张期心力衰竭的方法，包括识别所述受试者体液的基质金属蛋白酶(MMP)和基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的谱，本文中所述受试者可能伴随发生舒张期心力衰竭(DHF)。
2.MMP 基质金属蛋白酶(MMP)是锌依赖性内肽酶；其他的家族成员有蛇毒蛋白酶、沙雷菌蛋白酶(serralysin)、虾红素。MMP属于一个被称为metzincin超家族的较大的蛋白酶家族。
MMP之间共享一种共有的结构域结构。三种共有结构域为前肽、催化结构域和通过柔性铰链区与催化结构域相连的血红素结合蛋白样C末端结构域。
MMP最初是作为具有前肽结构域的无活性酶原合成的，所述前肽结构域须在酶激活前除去。所述前肽结构域是“半胱氨酸开关”的一部分，所述“半胱氨酸开关”包含可与活性位点中的锌相互作用并阻止底物结合和切割切割以保持酶处于无活性形式的保守性半胱氨酸残基。多数MMP中，所述半胱氨酸残基位于保守序列PRCGxPD中。某些MMP具有激素原转化酶切割切割位点(弗林蛋白酶样)作为该结构域的一部分，它在切割被切割时会激活该酶。MMP-23A和MMP-23B在该结构域(PMID10945999)中包括跨膜区段。
多种MMP的催化结构域的X射线晶体结构已证明该结构域是测量值为35×30×30
(3.5×3×3nm)的扁圆球体。活性位点是一个穿过催化结构域的20
(2nm)的沟。在所述催化结构域的形成该活性位点的部分中存在催化上非常重要的Zn2+离子，该离子与存在于保守序列HexxHxxGxxH中的三个组氨酸氨基结合。因此，该序列为锌结合基序。
该明胶酶(例如MMP-2)含有插入到该催化结构域(PMID 12486137)中锌结合基序正前位的II型纤连蛋白结构功能域(module)。
所述催化结构域通过柔性铰链区或接头区与C末端结构域连接。它最多达75个氨基酸长并且具有不确定的结构。
所述C末端结构域具有与血清蛋白质血红素结合蛋白类似的结构。它有四个叶片状β螺旋浆结构。β螺旋浆结构提供了一个大的平坦表面，该表面被认为参与蛋白-蛋白的相互作用。这也决定了底物特异性，并且成为与TIMP相互作用的位点。MMP-7、MMP-23和MMP-26以及植物和线虫中不存在血红素结合蛋白(Haemopexin)样结构域。MT-MMP通过该结构域锚定在质膜上，某些MT-MMP具有胞质结构域。
MMP可以被以多种不同方式细分。通过将生物信息学方法用于比较MMP的一级序列，可提出以下MMP的演化分组MMP-19；MMP11、14、15、16和17；MMP-2和MMP-9；所有其他MMP。
对各催化结构域的单独分析表明，当主要类别分化时，催化结构域也会进一步演化，这也称之为酶的底物特异性。(MMP生物学研究人员)最常用的分类，部分地基于对MMP底物特异性的组织学评价，部分地基于对MMP的细胞定位。这些类别有胶原酶、明胶酶、基质降解酶和膜型MMP(MT-MMP)。逐渐地发现这些分类有一定的人为因素，因为还存在许多不适于分到任何常规类别的MMP。
胶原酶能够将三螺旋纤维胶原降解为有区别的3/4和1/4片段。这些胶原是骨和软骨的主要成分，并且MMP是唯一已知的能降解所述胶原的哺乳动物酶。一般地，所述胶原酶为MMP-1(小肠胶原酶)、MMP-8(中性粒细胞胶原酶)、MMP-13(3型胶原酶)、MMP-18(4型胶原酶，xco14，非洲蟾蜍胶原酶。未知的人类正向同源物)、MMP-14(MT1-MMP)也已经被表明可切割纤维胶原，更有争议的是，有证据表明MMP-2能够溶解胶原。
基质降解酶显示出广泛地切割胞外基质蛋白的能力，但它不能切割三螺旋纤维胶原。这类酶的三个标准成员为MMP-3(基质降解酶1)、MMP-10(基质降解酶2)和MMP-11(基质降解酶3)。MMP-11显示出与MT-MMP更相似，它可被转化酶激活，因此其分泌通常与转化酶可激活的MMP相关。
基质溶解素类包括MMP-7(基质溶解素，PUMP)和MMP-26(基质溶解素-2，endometase)。
明胶酶的主要底物为IV型胶原和明胶，这些酶的特点在于在催化结构域中插有附加的结构域。明胶结合区位于锌结合基序正前方，并形成独立的折叠单元，该单元不会破坏该催化结构域的结构。这一亚类的两个成员是MMP-2(72kDa明胶酶，明胶酶-A)和MMP-9(92kDa明胶酶，明胶酶-B)。
分泌的MMP包括MMP-11(基质降解酶3)、MMP-21(X-MMP)和MMP-28(上皮水解素(Epilysin))。
膜结合MMP包括II型跨膜半胱氨酸阵列MMP-23、糖基磷脂酰肌醇结合的MMP 17和25(分别为MT4-MMP和MT6-MMP)以及I型跨膜MMP14、15、16、24(分别为MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP和MT5-MMP)。
6种MT-MMP在前肽中均有弗林蛋白酶切割位点，MMP-11也具有这一特征。
其他的MMP包括MMP-12(巨噬细胞金属弹性蛋白酶)、MMP-19(RASI-I，有时也称为基质降解酶-4)、釉质溶解素(Enamelysin)(MMP-20)和MMP-27(MMP-22，C-MMP)，MMP-23A(CA-MMP)和MMP-23B。
3.TIMP MMP可被特定的内源金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)抑制，TIMP包括一个四种蛋白酶抑制剂的家族TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4。总地来说，所有的MMP一旦被激活，都可被TIMP抑制，但明胶酶(MMP-2和MMP-9)处于其潜在形式时可与TIMP形成复合体。潜在形式的MMP-2(MMP-2酶原)与TIMP-2的复合体可促进一种膜锚定MMP即MT1-MMP(MMP-14)激活细胞表面的MMP-2酶原。
4.MMP/TIMP之比 高血压性心脏病的MMP-TIMP分析的一个独特特征是，利用了心脏特异性TIMP即TIMP-4，并将其置于含有在心肌梗阻和高血压性患者中发生更显著变化的MMP的环境中。还公开了MMP(例如MMP-9或MMP-13)与TIMP(例如TIMP-1、TIMP-2或TIMP-4)的比值。所述比值在本文中首次被用作诊断鉴别特征并用于识别具有明显不同的疾病状况的患者。
5.血浆筛选 本发明教导的主要优点是，本文公开的方法提供了一种从组织或体液识别具有发生不良LVH风险的受试者以及识别正加速发生该过程的患者的更快速简单的方法。因此，本文公开的方法可包括检测受试者体液中的MMP和TIMP，所述体液例如有血、尿、血浆、血清、眼泪、淋巴、胆汁、脑脊液、间质液、房水或玻璃体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛门和阴道分泌物、汗、精液、漏出液、渗出物和滑液。
血浆是血液的液体成分，其中悬浮有血细胞。血浆是血液最主要的单一成分，它占总血液体积的约55％。血清是指已去除凝血因子(例如纤维蛋白)的血浆。血浆含有许多重要的蛋白质，包括血纤蛋白原、球蛋白和人血清白蛋白。有时，血浆可能含有必须通过病毒处理提取出来的病毒杂质。
6.免疫测定 本领域中存在许多已知的或新发现的用于检测例如蛋白质(如MMP和TIMP)的分析物的方法，它们可用于本文公开的方法中。例如，可用标准免疫检测法检测MMP和TIMP。各种有用的免疫检测法的步骤已在科技文献中有描述，例如，Maggio et al.，Enzyme-Immunoassay，(1987)和Nakamura，et al.，Enzyme ImmunoassaysHeterogeneous andHomogeneous Systems，Handbook of Experimental Immunology，Vol.1Immunochemistry，27.1-27.20(1986)，通过引用的方式将它们的全文——特别是其关于免疫检测的方法的教导——纳入本文。从最简单直接的意义上来说，免疫测定是涉及抗体和抗原之间结合的结合测定法。许多类型和形式的免疫测定都是已知的，它们都适于检测所公开的生物标记。免疫测定的实例有酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、放射免疫沉淀测定(RIPA)、免疫珠捕获测定、蛋白质印迹、点印迹、凝胶移动检测、流式细胞术、蛋白质阵列、多珠粒阵列、磁捕获、体内成像、荧光共振能量转移(FRET)和光漂白后荧光恢复/定位(FRAP/FLAP)。
一般而言，免疫测定包括使被怀疑含有目的分子(例如本文公开的生物标记)的样本与该目的分子的抗体相接触，或者使目的分子的抗体(例如，本文公开的生物标记的抗体)与可被该抗体结合的分子相接触，所述接触过程可能是在有效使得能够形成免疫复合体的条件下进行。在有效形成免疫复合体(一级免疫复合体)的条件下且在足以使得免疫复合体形成的时间段内，样本与目的分子的抗体之间的接触或者与可被目的分子的抗体结合的分子之间的接触，通常只是简单地使所述分子或抗体与所述样本接触，并在足以使抗体与所存在的任何可与该抗体结合的分子(例如抗原)形成(即与其结合)免疫复合体的时间段内，孵育上述混合物。在许多形式的免疫测定中，随后可洗涤样本-抗体组合物(例如组织切片、ELISA板、点印记或蛋白质印迹)以除去任何非特异性结合的抗体种类，从而只允许与待检测的一级免疫复合体特异性结合的那些抗体存在。
免疫测定可包括用于检测样本中的目的分子(例如本文公开的生物标记或它们的抗体)或对其定量的方法，所述方法通常包括检测在结合过程中形成的任何免疫复合体或对其定量。通常，对免疫复合体形成的检测是本领域公知的，这可应用多种方法实现。这些方法一般是基于检测一种标记物或标记，例如任何放射性标签、荧光标签、生物标签或酶标签或者任何其他已知的标记物。参见例如，美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241，通过引用的方式将上述每篇文献全文——特别是与免疫检测方法或标记相关的教导——纳入本文。
本文所使用的标记可包括荧光染料、结合对的其中之一(例如生物素/链亲和素)、金属(例如金)或能与可被检测的分子特异地相互作用(例如通过产生有色底物或荧光)的表位标签。适用于可检测地标记蛋白的底物包括荧光染料(本文中也被称为荧光色素和荧光团)和可与显色底物(例如辣根过氧化物酶)反应的酶。实施本发明的过程中，一般优选使用荧光染料，因为它们能够在很少量时被检测到。此外，当多个抗原与单个阵列反应时，每个抗原可被不同的荧光化合物标记以便同时检出。可使用荧光计检测阵列上的标记点，当存在信号时就表明抗原与特异性抗体结合。
荧光团是能发光的化合物或分子。通常，荧光团在一个波长处吸收电磁能，在另一个波长处发射电磁能。代表性的荧光团包括但不限于1，5-IAEDANS、1，8-ANS、4-甲基伞形酮、5-羧-2，7-二氯荧光素、5-羧基荧光素(5-FAM)、5-羧基萘荧光素、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、5-羟色胺(5-HAT)、5-ROX(羧基-X-罗丹明)、6-羧罗丹明6G、6-CR6G、6-JOE、7-氨基-4-甲基香豆素、7-氨基放线菌素D(7-AAD)、7-羟基-4-I甲基香豆素、9-氨基-6-氯-2-甲氧吖啶(ACMA)、ABQ、酸性品红、吖啶橙、吖啶红、吖啶黄、锥虫黄(Acriflavin)、锥虫黄孚尔根SITSA(AcriflavinFeulgen SITSA)、水母发光蛋白(发光蛋白)、AFP-自主荧光蛋白-(量子生物技术)(参见sgGFP、sgBFP)、Alexa Fluor 350TM、Alexa Fluor 430TM、Alexa Fluor 488TM、Alexa Fluor 532TM、Alexa Fluor 546TM、Alexa Fluor568TM、Alexa Fluor 594TM、Alexa Fluor 633TM、Alexa Fluor 647TM、Alexa Fluor 660TM、Alexa Fluor 680TM、茜素络合酮、茜素红、别藻蓝蛋白(APC)、AMC、AMCA-S、氨甲基香豆素(AMCA)、AMCA-X、氨基放线菌素D、氨基香豆素、苯胺蓝、硬脂酸蒽(Anthrocyl stearate)、APC-Cy7、APTRA-BTC、APTS、阿司屈拉崇(Astrazon)亮红4G、阿司屈拉崇橙R、阿司屈拉崇红6B、阿司屈拉崇黄7GLL、米帕林(Atabrine)、ATTO-TAGTMCBQCA、ATTO-TAGTM FQ、金胺、Aurophosphine G、Aurophosphine、BAO 9(双氨基苯基噁二唑)、BCECF(高pH)、BCECF(低pH)、硫酸黄连素、β内酰胺酶、BFP蓝移GFP(Y66H)、蓝色荧光蛋白、BFP/GFP FRET、Bimane、双苯酰亚胺(Bisbenzemide)、双苯酰亚胺(赫斯特)、双BTC、布兰科福尔(Blancophor)FFG、Blancophor SV、BOBOTM-1、BOBOTM-3、氟硼荧492/515、氟硼荧493/503、氟硼荧500/510、氟硼荧505/515、氟硼荧530/550、氟硼荧542/563、氟硼荧558/568、氟硼荧564/570、氟硼荧576/589、氟硼荧581/591、氟硼荧630/650-X、氟硼荧650/665-X、氟硼荧665/676、氟硼荧F1、氟硼荧FL ATP、氟硼荧F1-神经酰胺、氟硼荧R6GSE、氟硼荧TMR、氟硼荧TMR-X缀合物、氟硼荧TMR-X SE、氟硼荧TR、氟硼荧Bodipy TR ATP、Bodipy TR-X SE、BO-PROTM-1、BO-PROTM-3、Brilliant Sulphoflavin FF、BTC、BTC-5N、钙黄绿素、钙黄绿素蓝、CalciumCrimson-、Calcium Green、Calcium Green-1 Ca2+染料、Calcium Green-2Ca2+、Calcium Green-5N Ca2+、Calcium Green-C 18 Ca2+、Calcium Orange、Calcofluor White、羧基-X-罗丹明(5-ROX)、Cascade BlueTM、CascadeYellow、儿茶酚胺(Catecholamine)、CCF2(GeneBlazer)、CFDA、CFP(氰基荧光蛋白)、CFP/YFP FRET、叶绿素、色霉A、色霉A、CL-NERF、CMFDA、腔肠素(Coelenterazine)、腔肠素cp、腔肠素f、腔肠素fcp、腔肠素h、腔肠素hcp、腔肠素ip、腔肠素n、腔肠素0、香豆素毒伞素(CouniarinPhalloidin)、C-藻蓝蛋白(C-phycocyanine)、CPM I甲基香豆素、CTC、CTC甲臜(Formazan)、Cy2TM、Cy3.18、Cy3.5TM、Cy3TM、Cy5.18、Cy5.5TM、Cy5TM、Cy7TM、氰基GFP、cAMP荧光传感器(Fluorosensor)(FiCRhR)、4-(4′-二甲对胺基偶氮苯)苯甲酸(Dabcyl)、丹酰(dansyl)、丹酰胺、丹酰尸胺、丹酰氯、丹酰DHPE、丹酰氟、DAPI、Dapoxyl、Dapoxyl2、Dapoxyl3′DCFDA、DCFH(二氯二氢荧光素二乙酯)、DDAO、DHR(二氢罗丹明123)、二-4-ANEPPS、二-8-ANEPPS(非定比(non-ratio))、DiA(4-Di16-ASP)、二氯二氢荧光素二乙酯(DCFH)、DiD-亲脂示踪物(Lipophilic Tracer)、DiD(DiI1C18(5))、DIDS、二氢罗丹明123(DHR)、Di1(Di1C18(3))、I二硝基苯酚、Di0(Di0C18(3))、DiR、DiR(Di1C18(7))、DM-NERF(高pH)、DNP、多巴胺、DsRed、DTAF、DY-630-NHS、DY-635-NHS、EBFP、ECFP、EGFP、ELF 97、伊红、藻红、藻红ITC、溴化乙锭、乙啡啶同型二聚体-1(Ethidium homodimer-1)(EthD-1)、吖啶橙、EukoLight、氯化铕(111)、EYFP、速蓝(Fast Blue)、FDA、孚尔根(副品红)、FIF(甲醛诱导的荧光)、FITC、Flazo Orange、Fluo-3、Fluo-4、荧光素(FITC)、荧光素二乙酯、荧光祖母绿(Fluoro-Emerald)、荧光金(Fluoro-Gold)(羟基二脒替)、Fluor-Ruby、FluorX、FM 1-43TM、FM4-46、Fura RedTM(高pH)、Fura红TM/Fluo-3、Fura-2、Fura-2/BCECF、Genacryl BrilliantRed B、Genacryl Brilliant Yellow 10GF、Genacryl Pink 3G、GenacrylYellow 5GF、GeneBlazer、(CCF2)、GFP(S65T)、红移GFP(rsGFP)、非UV激发的野生型GFP(wtGFP)、UV激发的野生型GFP(wtGFP)、GFPuv、Gloxalic Acid、粒状蓝(Granular blue)、血卟啉(Haematoporphyrin)、赫斯特33258、赫斯特33342、赫斯特34580、HPTS、羟基香豆素、羟基二脒替(荧光金)、羟色胺、Indo-1(高钙)、Indo-1(低钙)、吲哚二碳菁(Indodicarbocyanine)(DiD)、吲哚三碳菁(Indotricarbocyanine)(DiR)、Intrawhite Cf、JC-1、JO JO-1、JO-PRO-1、LaserPro、Laurodan、LDS 751(DNA)、LDS 751(RNA)、雷可福(Leucophor)PAF、LeucophorSF、Leucophor WS、丽丝胺(Lissamine)罗丹明、丽丝胺罗丹明B、钙黄绿素/乙啡啶同型二聚体、LOLO-1、LO-PRO-1、萤黄(Lucifer Yellow)、溶酶体蓝色荧光探针(Lyso Tracker Blue)、溶酶体蓝白色荧光探针(LysoTracker Blue-White)、溶酶体绿色荧光探针(Lyso Tracker Green)、溶酶体红色荧光探针(Lyso Tracker Red)、溶酶体黄色荧光探针(LysoTracker Yellow)、LysoSensor Blue、LysoSensor Green、LysoSensorYellow/Blue、Mag Green、麦塔喇红(Magdala Red)(Phloxin B)、Mag-FuraRed、Mag-Fura-2、Mag-Fura-5、Mag-lndo-1、镁绿(Magnesium Green)、镁橙(Magnesium Orange)、孔雀石绿、海蓝(Marina Blue)、I MaxilonBrilliant Flavin 10 GFF、Maxilon Brilliant Flavin 8 GFF、部花青(Merocyanin)、甲氧香豆素、线粒体绿色荧光探针(Mitotracker Green)FM、线粒体橙色荧光探针(Mitotracker Orange)、线粒体红色荧光探针(Mitotracker Red)、光神霉素、Monobromobimane、Monobromobimane(mBBr-GSH)、Monochlorobimane、MPS(甲基氯焦宁芪(Methyl GreenPyronine Stilbene))、NBD、NBD胺、尼罗红、硝基苯并噁二唑(Nitrobenzoxedidole)、去甲肾上腺素(Noradrenaline)、核速红(Nuclear Fast Red)、i核黄(i Nuclear Yellow)、Nylosan Brilliantlavin E8G、俄勒冈绿(Oregon Green)TM、俄勒冈绿TM488、俄勒冈绿TM500、俄勒冈绿TM514、太平蓝(Pacific Blue)、，副品红(孚尔根)、PBFI、PE-Cy5、PE-Cy7、PerCP、PerCP-Cy5.5、PE-德克萨斯红(613红)、根皮红(Phloxin)B(麦塔喇红)、Phorwite AR、Phorwite BKL、PhorwiteRev、Phorwite RPA、膦3R、光致抗蚀剂(PhotoResist)、藻红蛋白B[PE]、藻红蛋白R[PE]、PKH26(Sigma)、PKH67、PMIA、Pontochrome Blue Black、POPO-1、POPO-3、PO-PRO-1、PO-I PRO-3、樱草灵(Primuline)、普施安黄(Procion Yellow)、碘化丙啶(P1)、PyMPO、芘(Pyrene)、派洛宁(Pyronine)、派洛宁B、Pyrozal Brilliant Flavin 7GF、QSY 7、芥奎吖因(Quinacrine Mustard)、试卤灵(Resorufin)、RH414、Rhod-2、罗丹明、罗丹明110、罗丹明123、罗丹明5GLD、罗丹明6G、罗丹明B、罗丹明B200、碱性玫瑰精(Rhodamine B extra)、罗丹明BB、罗丹明BG、罗丹明绿、罗丹明毒伞素(Rhodamine Phallicidine)、罗丹明、鬼笔环肽(Phalloidine)、罗丹明红、罗丹明WT、玫瑰红、R-藻蓝蛋白(R-phycocyanine)、R-藻红蛋白(PE)、rsGFP、S65A、S65C、S65L、S65T、深蓝色GFP、SBFI、5-羟色胺、塞夫隆亮红(Sevron Brilliant Red)2B、塞夫隆亮红4G、塞夫隆亮红B、塞夫隆橙、塞夫隆黄L、sgBFPTM(超发光(super glow)BFP)、sgGFPTM(超发光GFP)、SITS(樱草灵，1，2-二苯乙烯异硫代硫酸)、SNAFL钙黄绿素、SNAFL-1、SNAFL-2、SNAR钙黄绿素、SNARF1、钠绿(Sodium Green)、SpectrumAqua、SpectrumGreen、SpectrumOrange、Spectrum Red、SPQ(6-甲氧-N-(3磺丙基)喹啉铵)、1，2-二苯乙烯、磺罗丹明B和C、SulphoRhodamien Extra、SYTO 11、SYTO 12、SYTO 13、SYTO 14、SYTO 15、SYTO 16、SYTO 17、SYTO 18、SYTO 20、SYTO 21、SYTO 22、SYTO 23、SYTO 24、SYTO 25、SYTO 40、SYTO 41、SYTO 42、SYTO 43、SYTO 44、SYTO 45、SYTO 59、SYTO 60、SYTO 61、SYTO 62、SYTO 63、SYTO 64、SYTO 80、SYTO 81、SYTO 82、SYTO 83、SYTO 84、SYTO 85、SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、四环素(Tetracycline)、四甲基罗丹明(TRITC)、德克萨斯红TM、德克萨斯红-XTM缀合物、硫代二羰花青(Thiadicarbocyanine)(DiSC3)、噻嗪红R(Thiazine Red R)、噻唑橙、硫磺素5(Thioflavin)、硫磺素S、硫磺素TON、Thiolyte、ThiozoleOrange、Tinopol CBS(Calcofluor White)、TIER、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、TOTO-1、TOTO-3、Tricolor(PE-Cy5)、TRITC四甲基罗丹明异硫氰酸酯、正蓝(True Blue)、正红(Tru Red)、Ultralite、荧光素钠(Uranine)B、Uvitex SFC、wtGFP、WW781、X-罗丹明、XRITC、二甲苯橙(Xylene Organge)、Y66F、Y66H、Y66W、黄色GFP、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO 3、YOYO-1、YOY0-3、Sybr Green、噻唑橙(内螯合染料(interchelating dye))、例如量子点的半导体纳米粒或(可被光或其他电磁能源激活的)封闭荧光团(caged flurophore)，或者它们的组合。
标记可以直接或间接进行。在直接标记中，检测的抗体(目的分子的抗体)或检测的分子(可被目的分子的抗体结合的分子)包括标记物。检测到标记物就表明存在所述检测的抗体或所述检测的分子，这又分别表明存在目的分子或存在目的分子的抗体。在间接标记中，使其他分子或部分与免疫复合体接触，或者在免疫复合体处生成其他分子或部分。例如，可使产生信号的分子或部分(例如酶)附着到或者结合到所述检测抗体或所述检测分子上。之后，产生信号的分子可在免疫复合体处产生可检测信号。例如，在向一种酶提供合适的底物时，该酶可在免疫复合体处产生可见的或可检测的产物。ELISA应用了这种间接标记。
间接标记的另一个实例是，使可结合目的分子或结合目的分子的抗体(一抗)的其他分子(可称之为结合剂)——例如与一抗结合的二抗——与免疫复合体相接触。所述其他分子可带有标记物或产生信号的分子或部分。所述其他分子可以是抗体，由此它可被称为二抗。二抗与一抗的结合可与所述第一抗体(或一抗)和目的分子形成所谓的三明治。该免疫复合体可与经标记的二抗在有效使得二级免疫复合体形成的条件下相接触，且接触时间足以使得二级免疫复合体形成。然后，通常可洗涤该二级免疫复合体以除去任何非特异结合的经标记的二抗，随后可检测该二级免疫复合体中余下的标记物。所述其他分子也可以是或包括一对彼此结合的分子或部分(例如生物素/链亲和素对)的其中之一。在这种模式中，所述检测抗体或检测分子应包括该配对中的另一成员。
其他的间接标记模式包括通过两步骤法检测一级免疫复合体。例如，如上所述，一种对目的分子或相应抗体具有结合亲和性的分子(它可被称为第一结合剂)例如一种抗体可用于形成二级免疫复合体。洗涤后，也是在有效使得免疫复合体形成(由此形成三级免疫复合体)的条件下，在足以使得免疫复合体形成的时间内，可使所述二级免疫复合体与另一种对所述第一结合剂具有结合亲和性的分子(它可被称为第二结合剂)相接触。所述第二结合剂可与有可检测标记物或产生信号的分子或部分连接，以便能检测所述的由此形成的三级免疫复合体。该体系可使信号放大。
涉及检测底物(例如一种蛋白或一种特定蛋白的抗体)的免疫测定包括无标记测定、蛋白分离法(即电泳)、固体载体捕获测定或体内检测。无标记测定是确定样本中是否存在特定蛋白或特定蛋白的抗体的常用诊断手段。蛋白分离法也用于评价蛋白的物理特性，例如分子大小或净电荷。捕获测定通常在定量评价样本中特定蛋白或特定蛋白的抗体的浓度时更为有用。最后，体内检测可用于评价物质的空间表达模式，即该物质可存在于患者体内的何处，组织还是细胞中。
如果浓度足够，抗体-抗原相互作用产生的分子复合体([Ab-Ag]n)为肉眼可见的，但量更少时也有可能因其能散射光束而被检测或测量到。复合体的形成表明两种反应物均存在，在免疫沉淀测定中，恒定浓度的试剂抗体被用于测量特定抗原([Ab-Ag]n)，试剂抗原被用于检测特定抗体([Ab-Ag]n)。如果试剂种类被预先包被于细胞(如在血细胞凝集测定中)或微小颗粒(如在乳胶凝集测定中)上，包被颗粒的“凝集”在极低浓度时都可见。基于上述基本原理的各种测定法都是常用方法，包括Ouchterlony免疫扩散测定、火箭免疫电泳和免疫浊度分析和浊度测定。这类测定的主要局限是与使用标记物的测定法相比，其灵敏度有限(较低的检测限)，并且某些情况下，极高浓度的分析物实际上可抑制复合体的形成这一事实使得这些方法更为复杂。这些一线测定法中的某些可追溯到发现抗体时，它们都没有真正的“标记物”(例如Ag-enz)。其他类型的无标记免疫测定依赖于免疫传感器，目前已有许多可直接检测抗体-抗原相互作用的市售仪器。大多数都需要在具有固定化配体的传感器表面上产生隐失波，从而可以连续监测与配体的结合。免疫传感器使得可以很容易进行动力学相互作用研究，并且随着低成本专业仪器的出现使其在未来可广泛应用于免疫分析中。
使用免疫测定法检测特定蛋白可包括通过电泳分离蛋白质。电泳是指溶液中的荷电分子响应于电场发生迁移。它们的迁移率取决于电场强度、分子的净电荷、大小和形状，还取决于其中泳动分子的介质的离子强度、粘度和温度。电泳是一种简单、快速且高灵敏的分析工具。它被用于分析研究单一的荷电分子的性质，并且也可作为一种分离技术。
通常，在载体基质上泳动样本，例如在纸、醋酸纤维素、淀粉凝胶、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上。所述基质可抑制发热所致的对流混合，并且提供电泳记录即在电泳结束时，可将基质染色并用于扫描、放射自显影或保存。此外，最常用的载体基质——琼脂糖和聚丙烯酰胺——提供了通过分子大小分离分子的工具，因为它们是多孔凝胶。多孔凝胶可通过延迟或者某些情况下完全阻止大分子移动同时使小分子自由移动来起到分子筛的作用。由于稀的琼脂糖凝胶通常比相同浓度的聚丙烯酰胺更硬并且更容易处理，因此琼脂糖被用于分离较大的大分子例如核酸、大的蛋白质和蛋白复合体。聚丙烯酰胺在较高浓度时容易处理和制备，因此被用于分离需要较小的延迟凝胶孔径的多数蛋白和较小寡核苷酸。
蛋白质是两性化合物，因此可通过其悬浮介质的pH来测定它们的净电荷。当溶液pH高于蛋白质等电点时，该蛋白带净负电，并在电场中向阳极移动。低于其等电点时，蛋白带正电，向阴极移动。此外，蛋白质所带的净电荷与其分子大小无关，即不同的蛋白质，每单位分子质量(或长度，蛋白质和核酸是线性大分子时)所带电荷不同。因此，在给定的pH下，并且在非变性条件下，同时通过分子的大小和电荷来确定蛋白质的电泳分离。
十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子变性剂，它可通过“包围”多肽骨架而使蛋白质变性，SDS与蛋白质极特定地以1.4:1的质量比结合。由此，SDS将赋予多肽与其长度成比例的阴电荷。此外，通常还需要将蛋白的二硫键还原(变性)，如此之后，蛋白质就可采取通过分子大小进行分离所需的随机卷曲构型；还原可用2-巯基乙醇或二硫苏糖醇实现。因此，在变性SDS-PAGE分离中，迁移并不由多肽的内部电荷决定，而是由分子量决定。
分子量的测定可通过将已知分子量的蛋白与待表征的蛋白一起进行SDS-PAGE电泳来进行。SDS变性的多肽或天然核酸的分子量的对数与其Rf之间存在线性关系。分子迁移距离与标准物染料前沿迁移距离之比即为Rf。一种通过电泳(Mr)测定相对分子量的简单方法是，绘制已知样本迁移距离相对log 10MW的标准曲线，并在测量样本在同一凝胶上的迁移距离后读取样本的logMr。
在二维电泳中，首先基于物理特性将蛋白质分级分离，然后基于另一种特性通过另一步骤分级分离。例如，等电聚焦法可用于第一维度，这可方便地通过管式凝胶进行，而平板凝胶上的SDS电泳可用于第二维度。该方法的一个实例是O′Farrell，P.H.，High Resolution Two-dimensionalElectrophoresis of Proteins，J.Biol.Chem.2504007-4021(1975)中的方法，该文献就其二维电泳方法的教导通过引用的方式全文纳入本文。其他的实例包括但不限于Anderson，L and Anderson，NG，Highresolution two-dimensional electrophoresis of human plasmaproteins，Proc.Natl.Acad.Sci.745421-5425(1977)和Ornstein，L.，Disc electrophoresis，L.Ann.N.Y.Acad.Sci.121321349(1964)中的方法，它们关于电泳方法的教导均通过引用的方式全文纳入本文。
Laemmli，U.K.，Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4，Nature 227680(1970)中公开了一种用于分辨SDS变性蛋白的不连续系统，该文献就其电泳方法的教导通过引用的方式全文纳入本文。Laemmli缓冲系统中的先导离子是氯，尾随离子是甘氨酸。因此，该分辨凝胶和积层凝胶是用(不同浓度和pH的)Tris-HCl缓冲液制备的，而电泳槽缓冲液为Tris-甘氨酸。所有缓冲液均含有0.1％ SDS。
本发明方法中考虑到的使用电泳的免疫测定的一个实例为蛋白质印迹分析。蛋白质印迹或免疫印迹使得可以测定蛋白的分子质量，以及测量不同样本中存在的蛋白的相对量。检测方法包括化学发光和显色检测。蛋白质印迹分析的标准方法可参见例如D.M.Boltag et al.，ProteinMethods(2d edition 1996)和E.Harlow & D.Lane，Antibodies，aLaboratory Manual(1988)以及美国专利4,452,901，它们每一篇关于蛋白质印迹方法的教导均通过引用的方式全文纳入本文。一般用凝胶电泳(常用SDS-PAGE)分离蛋白质。将蛋白质转移到一种例如硝酸纤维素的特殊印迹薄纸上，但也可使用其他类型的纸或膜。该蛋白保持其在凝胶上的分离模式。使该印迹与一种例如乳蛋白的总蛋白一起孵育，以结合硝酸纤维素膜上任何剩余的粘性区域。然后将能够结合其特异性蛋白的抗体加入到该溶液中。
通过间接酶免疫测定技术可容易地显示特异性抗体与特异性固定化抗原的结合，通常使用生色底物(例如，碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)或发光底物。其他可能的探测方法包括使用荧光或放射性同位素标记物(例如，荧光素、125I)。检测抗体结合的探针可以是缀合的抗免疫球蛋白、缀合的葡萄球菌蛋白A(结合IgG)或生物素化一抗的探针(例如，缀合的亲和素/链亲和素)。
该技术的有效性在于它能通过特定蛋白的抗原性同时检测出该特定蛋白和它的分子量。首先，用SDS-PAGE根据质量分离蛋白质，然后通过免疫测定步骤进行特异地检测。因此，可同时电泳蛋白质标准物(分子量标准(ladder))，以估计异源样本中目的蛋白的分子量。
凝胶迁移测定或电泳迁移率测定(EMSA)可用于定性和定量地检测DNA结合蛋白和其同源DNA识别序列之间的相互作用。示例性的技术如Ornstein L.，Disc electrophoresis-IBackground and theory，Ann.NY Acad.Sci.121321-349(1964)和Matsudiara，PT and DR Burgess，SDS microslab linear gradient polyacrylamide gel electrophoresis，Anal.Biochem.87386-396(1987)中所述，上述文献就其凝胶迁移测定的相关教导均通过引用的方式全文纳入本文。
在常规的凝胶测定中，可将纯化的蛋白或细胞粗提物与一种标记(例如32P放射标记)的DNA或RNA探针一起孵育，然后通过非变性聚丙烯酰胺凝胶使该复合体与游离的探针分离。该复合体穿过凝胶的迁移速度比不结合的探针更慢。根据所述结合蛋白的活性，标记的探针可以是双链或单链的。对于例如转录因子的DNA结合蛋白的检测，可以使用纯化的或部分纯化的蛋白或者核细胞提取物。对于RNA结合蛋白的检测，可以使用纯化的或部分纯化的蛋白或者核或胞质细胞提取物。DNA或RNA结合蛋白对于推定结合位点的特异性可通过竞争性实验来确定，其中使用含有目的蛋白结合位点的DNA或RNA片段或寡核苷酸，或者其他无关序列。在特异和非特异竞争物的存在下形成的复合体的性质和强度差异使得可以识别特异的相互作用。参见Promega的凝胶迁移测定FAQ，它可从http://www.promega.com/faq/gelshfaq.html(上一次访问于2005年3月25日)获得，该内容就其凝胶迁移法相关教导通过引用的方式全文纳入本文。
凝胶迁移法可包括，例如使用胶体形式的考马斯(Imperial ChemicalsIndustries，Ltd)蓝色染料检测凝胶(例如聚丙烯酰胺电泳凝胶)上的蛋白质。这类方法在例如Neuhoff et al.，Electrophoresis 6427-448(1985)和Neuhoff et al，Electrophoresis 9255-262(1988)中有描述，所述文献就其凝胶迁移方法相关教导均通过引用的方式全文纳入本文。除了上述的常规蛋白质测定方法，美国专利5,424,000中还描述了一种联合清洗和蛋白质染色的组合物，该文献就其凝胶迁移方法相关教导通过引用的方式全文纳入本文。该溶液可包括磷酸、硫酸和硝酸以及酸性紫染料。
放射免疫沉淀测定(RTPA)是一种使用放射性标记的抗原来检测血清中特异抗体的灵敏测定法。使抗原与血清反应，然后用特殊的试剂例如蛋白A琼脂糖(sepharose)珠粒进行沉淀。之后，通常用凝胶电泳分析所述结合的经放射性标记的免疫沉淀。放射性免疫沉淀测定(RIPA)常被用作一种用于诊断是否存在HIV抗体的确诊测试。RIPA在本领域中也被称作Farr测定、沉淀测定、放射免疫沉淀测定；放射免疫沉淀分析；放射免疫沉淀分析和免疫沉淀分析。
虽然上述利用电泳分离和检测所述特定目的蛋白的免疫测定可以评价蛋白质的大小，但它们在评价蛋白质浓度方面不太灵敏。然而，还考虑了这样一种免疫测定其中所述蛋白或蛋白的特异性抗体与固体载体(例如管、孔、珠粒或细胞)结合以分别从样本中捕获所述抗体或目的蛋白，并且将这种测定与一种检测载体上的所述蛋白或蛋白的特异性抗体的方法相结合。这类免疫测定的实例包括放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、蛋白质阵列、多珠粒阵列和磁捕获。
放射性免疫测定(RIA)是一种检测抗原-抗体反应的经典定量测定，它使用了放射性标记的物质(放射性配体)，以直接地或间接地测量未标记物质与特异抗体或其他受体系统的结合。可使用放射性免疫测定法例如检测血液的激素水平，而不需要用生物测定法。非免疫源性物质(例如半抗原)如与能诱导抗体形成的更大的载体蛋白(例如，牛γ球蛋白或人血清白蛋白)偶联，则也可对其进行测定。RIA包括将放射性抗原(因为将碘原子引入蛋白质的酪氨酸残基中较容易，所以通常使用放射性同位素125I或131I)与该抗原的抗体混合。一般，使该抗体与例如管或微珠的固体载体结合。然后，加入已知量的未标记抗原或“冷”抗原，并测量被置换的标记抗原的量。最初，所述放射性抗原与抗体结合。当加入冷抗原时，两者会竞争抗体结合位点，更高浓度的冷抗原会更多地与该抗体结合，从而置换出该放射性变体。使结合的抗原与溶液中未结合的抗原相分离，通过各抗原的放射性来绘制结合曲线。这种技术极其灵敏并且特异性很高。
酶联免疫吸附测定(ELISA)——或者通常称之为EIA(酶免疫测定)——是一种可检测蛋白的特异抗体的免疫测定。在该测定中，与抗体结合试剂或抗原结合试剂相结合的可检测标记是一种酶。当酶与其底物接触时，该酶以特定方式发生反应以产生例如可通过分光光度测定、荧光测定或可见方式检测的化学部分。可用于可检测地标记检测试剂的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、天冬酰胺酶、酵母乙醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。关于ELISA方法的描述参见Voller，A.et al.，J.Clin.Pathol.31507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73482-523(1981)；Maggio，E.(ed.)，EnzymeImmunoassay，CRC Press，Boca Raton，1980；Butler，J.E.，InStructure of Antigens，Vol.1(Van Regenmortel，M.，CRC Press，BocaRaton，1992，pp.209-259；Butler，J.E.，Invan Oss，C.J.et al.，(eds)，Immunochemistry，Marcel Dekker，Inc.，New York，1994，pp.759-803；Butler，J.E.(ed.)，Immunochemistry of Solid-PhaseImmunoassay，CRC Press，Boca Raton，1991)；Crowther，＂ELISATheoryand Practice，＂InMethods in Molecule Biology，Vol.42，HumanaPress；New Jersey，1995；美国专利4,376,110，上述每篇文献——特别是关于ELISA方法的教导——均通过引用的方式全文纳入本文。
ELISA技术的变化方案是本领域技术人员已知的。在一个变化方案中，可将能与蛋白结合的抗体固定在显示出蛋白亲和性的选定表面上，例如在聚苯乙烯微量滴定板的孔中。然后，向所述孔中加入怀疑含有标记抗原的测试组合物。结合并洗去非特异性结合的免疫复合体后，可检测结合的抗原。可通过加入特异性针对靶蛋白的二抗来进行检测，所述二抗与可检测标记相连。这类ELISA是一种简单的“夹心ELISA”。也可通过先加入二抗再加入对所述二抗有结合亲和性的三抗来进行检测，所述三抗与可检测标记相连。
另一个变化方案是竞争ELISA。在竞争ELISA中，测试样本竞争性地结合已知量的标记抗原或抗体。可通过在与包被孔一起孵育前或在孵育过程中，使样本与所述已知的标记物混合来测定样本中反应物的量。样本中存在反应物时会减少可结合孔的标记物的量，由此而减弱最终的信号。
无论采用何种形式，ELISA都具有某些共同的特征，例如包被、孵育或结合、洗去非特异性结合的物质以及检测结合的免疫复合体。可使抗原或抗体与固体载体相连，并将待分析的样本加到固定的抗原或抗体上，所述固体载体例如为板、珠粒、杆、膜或柱基质的形式。用抗原或抗体包被板时，通常用抗原或抗体溶液孵育板孔，并孵育过夜或者一段具体的时间段。然后，清洗板孔以除去不完全吸附的物质。然后，用对于测试抗血清呈抗原中性的非特异性蛋白“包被”任何剩余的可吸附的孔表面。它们包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和乳粉溶液。所述包被使得可以封闭固定化表面上的非特异性吸附位点，并因此降低抗血清与表面非特异结合所致的本底。
在ELISA中，还可使用二次或三次检测手段，而不用直接方法。因此，在使蛋白或抗体与孔结合，用无反应活性物质进行包被以降低本底并洗去未结合物质后，使固定化表面与待测对照临床或生物样本在可有效使得免疫复合体(抗原/抗体)形成的条件下相接触。这样，该免疫复合体的检测就需要一种标记的二级结合试剂或者与一种二级结合试剂和一种标记的三级结合试剂的组合。
“在可有效使得免疫复合体(抗原/抗体)形成的条件下”意为该条件包括用例如BSA、牛γ球蛋白(BGG)和磷酸盐缓冲溶液(PBS)/吐温的溶液稀释抗原和抗体，以减少非特异性结合并提高合理的信噪比。
合适的条件也可意为在使得有效结合的温度下和足够时间内进行孵育。孵育步骤通常可在约20℃至30℃下进行约1分钟至12小时，或者可在约0℃至约10℃下孵育过夜。
在ELISA中，进行所有孵育步骤后，洗涤接触表面以除去未复合的物质。洗涤步骤可包括用例如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液的溶液洗涤。在测试样本与最初结合的物质之间形成特异免疫复合体并进行随后洗涤后，可以测定甚至以很小量存在的免疫复合体。
为了提供一种检测手段，如上所述，所述二抗或三抗可带有结合的标记物以便检测。它可以是一种在与合适的生色底物孵育后可产生颜色的酶。因此，例如，可在利于进一步形成免疫复合体的条件下以及时间段内使第一或第二免疫复合体与标记抗体相接触并一起孵育(例如在室温下，在含PBS的溶液(例如PBS-吐温)中孵育2小时)。
与标记抗体一起孵育并且随后洗去未结合的物质后，可对标记物定量，例如在以过氧化物酶作为酶标记时，可通过与生色底物例如脲和溴甲酚紫或2，2′-叠氮-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸[ABTS]和H2O2一起孵育来定量。定量可通过测量生色程度来实现，例如使用可见光谱分光光度计。
蛋白测定为利用了表面固定化蛋白的固相配体结合测定系统，所述表面包括玻璃、膜、微量滴定孔、质谱仪平板和珠粒或其他颗粒。这些测定高度平行(多重)并且常常是小型化的(微阵列、蛋白质芯片)。它们的优点包括快速且自动化、高灵敏度、试剂经济并且单次实验可给出的大量数据。生物信息学支持非常重要；数据的处理需要复杂的软件和数据比较分析。然而，可对用于DNA阵列的软件加以修改得到上述软件，如同许多硬件和检测系统一样。
一种主要的形式是捕获阵列，在该阵列中，配体结合剂被用于检测例如血浆或组织提取物的混合物中的目的分子，所述配体结合剂通常为抗体，但也可以是蛋白支架、肽或核酸适体。在诊断中，捕获阵列可用于平行进行多个免疫测定，既可测定例如单个血清中的多种分析物，也可同时测定多个血清样本。在蛋白质组学中，捕获测定被用于对不同的健康和患病样本的蛋白质水平定量并加以比较，即蛋白质表达作谱。除特异配体结合物之外的蛋白被用在所述用于体外功能相互作用(例如蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-药物、受体-配体、酶-底物等等)筛选的阵列形式中。可针对多种蛋白对捕获试剂自身进行选择和筛选，这也可通过针对多重蛋白靶标的多阵列形式实现。
对于构建阵列而言，蛋白质的来源包括，用于重组蛋白的基于细胞的表达系统、从天然来源纯化、通过无细胞翻译系统体外生产和肽合成方法。这些方法中的许多种都可用于自动高通量生产。对于捕获阵列和蛋白功能分析而言，重要的是，蛋白应正确折叠并具有功能；但事实并非总是如此，例如当在变性条件下从细菌提取重组蛋白时。然而，变性蛋白的阵列可用于筛选抗体的交叉反应性、识别自身抗体以及筛选配体结合蛋白。
蛋白阵列已被设计成，通常使用荧光读数并且用机器推进的微型化形式的常用免疫测定方法(例如ELISA和点印迹)，以及能够平行进行多个测定的高通量检测系统。常用的物理载体包括载玻片、硅、微孔、硝酸纤维素或PVDF膜、以及磁微珠或其他微珠。尽管最常见的形式是加到平面表面的蛋白微滴，其他的结构包括基于微流体(microfluidics)发展(Gyros，Monmouth Junction，NJ)和特殊芯片设计的CD离心装置，例如板上设计的微通道(例如The Living ChipTM，Biotrove，Woburn，MA)和硅表面的微型3D杆(Zyomyx，Hayward CA)。悬浮颗粒也可作为阵列基础，条件是需对它们进行识别编码；系统包括用于微珠(Luminex，Austin，TX；Bio-Rad Laboratories)和半导体纳米晶体(例如，QDotsTM，QuantumDot，Hayward，CA)的彩色编码和用于珠粒(UltraPlexTM，SmartBeadTechnologies Ltd，Babraham，Cambridge，UK)和多金属微杆(例如NanobarcodesTM颗粒，Nanoplex Technologies，Mountain View，CA)的条形编码。珠粒也可被组装到半导体芯片上的平面阵列中(LEAPStechnology，BioArray Solutions，Warren，NJ)。
蛋白的固定化涉及偶联试剂和待偶联表面的性质。优良的蛋白阵列载体表面在偶联过程前后都是化学稳定的、使得产生良好的点形态、表现出非特异性结合最少、不会增加检测系统的本底并且与不同的检测系统兼容。使用的固定化方法有重现性、适用于具有不同性质的蛋白质(大小、亲水、疏水)、适于高通量和自动化并且与完全功能蛋白活性的保留相容。表面结合蛋白的定向被认为是将该蛋白以活性状态提供给配体或底物过程中的重要因素；对于捕获阵列而言，可通过定向的捕获试剂获得最有效的结合结果，所述捕获试剂通常需要对蛋白进行位点特异性标记。
共价的和非共价的蛋白固定化方法都可使用，它们都有各种优缺点。表面被动吸附在方法上很简单，但几乎不能进行定量或定向控制；它可能改变或者可能不改变蛋白的功能特异性，并且可重复性和效率是可变的。共价偶联法提供了一种稳定的连接，可应用于很多种蛋白质并且具有良好的重复性；然而，取向可能是可变的，化学衍生可能会改变蛋白质功能并且需要稳定的相互作用表面。利用蛋白上的标签的生物捕获方法可提供稳定的连接，并且可特异地且以可重复的取向结合蛋白质，但首先须将所述生物试剂充分固定，并且，该阵列可能需要特殊处理，其稳定性也可能变化。
用于蛋白质阵列构造的多种固定化学法和标签已有描述。用于共价结合的底物包括用含氨基或醛的硅烷试剂包被的载玻片。在VersalinxTM系统(Prolinx，Bothell，WA)中，可逆的共价偶联可通过用苯二硼酸衍生的蛋白与载体表面上固定的水杨基氧肟酸之间的相互作用来实现。该法的本底结合低，内部荧光弱，并且可使固定的蛋白保留功能。基于三维聚丙烯酰胺凝胶，未修饰的蛋白的非共价结合发生在例如HydroGelTM(PerkinElmer，Wellesley，MA)的多孔结构的内部；据报道，该底物在玻璃微阵列上的本底特别低，其蛋白容量高并且可保留蛋白功能。广泛使用的生物偶联方法是借助于生物素/链亲和素或者六组氨酸/Ni相互作用，并且已经对蛋白作过适当修饰。可将生物素缀合到例如二氧化钛(Zyomyx)或五氧化二钽(Zeptosens，Witterswil，Switzerland)的表面上固定的聚赖氨酸骨架上。
阵列制造方法包括机器连接印刷(robotic contact printing)、喷墨、压电点印和照相平板印刷。许多商业化阵列(例如PackardBiosciences)以及手动设备(V&P Scientific)都是可获得的。可通过机器将细菌集落网载到PVDF膜上以诱导原位蛋白表达。
纳米阵列是点的大小和密度的极限，点为纳米空间级时，能使成千上万的反应可在小于1平方毫米的单一芯片上进行。BioForce Laboratories已开发了具有1521个蛋白质点的85μm2的纳米阵列，这相当于每平方厘米有二千五百万个点，达到了光学检测的极限；其读出方法为荧光法和原子力显微术(AFM)。
荧光标记和检测方法被广泛使用。用于DNA微阵列读数的仪器同样可适用于蛋白质阵列。为进行差异显示，可用来自两种不同细胞状态的荧光标记蛋白探测捕获(例如抗体)阵列，其中将细胞裂解物与不同的荧光团(例如Cy-3、Cy-5)直接缀合并将所述细胞裂解物混合，从而以颜色作为靶标丰度改变的读数。可通过酪胺信号放大(TSA)(PerkinElmerLifesciences)将荧光读数灵敏度放大10-100倍。平面导波技术(Zeptosens)能进行超灵敏荧光检测，另外还具有不干扰洗涤过程的优点。也可以以藻红蛋白作为标记物(Luminex)或利用半导体纳米晶体(Quantum Dot)的性质，通过悬浮珠粒或颗粒实现高灵敏度。特别是在生物技术商业领域中，许多新的替代读数法已被开发出来。它们包括下述方法的变换方法表面等离子共振(HTS Biosystems，Intrinsic Bioprobes，Tempe，AZ)、滚环DNA扩增(Molecular Staging，New Haven CT)、质谱(Intrinsic Bioprobes；Ciphergen，Fremont，CA)、共振光散射(Genicon Sciences，San Diego，CA)和原子力显微术(BioForceLaboratories)。
捕获阵列构成了可进行表达作谱的诊断芯片和阵列的基础。它们通过高亲和性捕获试剂以高通量方式结合并检测特异的靶标配体，所述高亲和性捕获试剂例如为常规抗体、单一结构域、构建的支架、肽或核酸适体。
抗体阵列具备所需的特异性性质和可接受的本底，有些抗体阵列可商购(BD Biosciences，San Jose，CA；Clontech，Mountain View，CA；BioRad；Sigma，St.Louis，MO)。用于捕获阵列的抗体可通过常规免疫法(多克隆血清和杂交瘤)制备，或者作为从噬菌体或核糖体展示文库筛选后通常用大肠杆菌表达的重组片段而制得(Cambridge Antibody Technology，Cambridge，UK；Biolnvent，Lund，Sweden；Affitech，Walnut Creek，CA；Biosite，San Diego，CA)。除了常规抗体，也可在阵列中使用Fab和scFv片段、骆驼科抗体(camelid)的单一V结构域或改造的人类等同物(Domantis，Waltham，MA)。
术语“支架”是指蛋白的配体结合结构域，它被改造成能结合多种靶标分子的具有抗体样特异性和亲和性的多种变体。所述变体可通过遗传文库的形式产生，并且可通过噬菌体、细菌或核糖体展示针对个体靶标进行筛选。这类配体结合支架或骨架包括基于葡萄球菌蛋白A的“Affibody”(Affibody，Bromma，Sweden)、基于纤连蛋白的“Trinectin”(Phylos，Lexington，MA)和基于脂质运载蛋白结构的“Anticalin”(PierisProteolab，Freising-Weihenstephan，Germany)。它们在捕获阵列中的使用方式类似抗体，并且具有耐用性好且容易生产的优点。
阵列中也可使用非蛋白捕获分子，特别是以高特异性和亲和性与蛋白配体结合的单链核酸适体(SomaLogic，Boulder，C0)。适体是通过SelexTM方法选自寡核苷酸文库的，它们与蛋白质的相互作用可通过掺入溴化脱氧尿苷和UV活化的交联作用(光适体)，以共价连接方式得到增强。由于有特定的空间要求，与配体的光交联可降低适体的交叉反应性。适体具有容易通过自动寡核苷酸合成生产、DNA的稳定性且耐用性好的优点；对于光适体阵列，可使用通用的荧光蛋白染色剂检测结合。
与抗体阵列结合的蛋白分析物的检测可直接进行或者通过夹心测定中的二抗进行。直接标记用于比较具有不同颜色的不同样本。如果可获得针对同一蛋白配体的抗体对，夹心免疫测定则可提供较高的特异性和灵敏度，并因此成为选择用于低丰度蛋白例如细胞因子的方法；该测定还能检测蛋白修饰物。包括质谱、表面等离子共振和原子力显微术在内的无标记检测方法可避免配体的改变。对于任何方法都要求有最佳的灵敏度和特异性，以及较低背景以获得较高的信噪比。由于分析物浓度范围很宽，因此需对灵敏度作适当调节；针对这一问题的解决方案是对样本连续稀释或者使用不同亲和性的抗体。目的蛋白常常是体液或提取物中浓度很低的蛋白例如细胞因子或细胞中低表达的产物，因此就需要在pg范围或更低水平上的检测。
捕获分子的阵列的一个替代方案是通过“分子印迹”技术实现，其中(例如来自蛋白C末端区域的)肽被用作模板以在可聚合基质中产生结构上互补的序列特异的洞穴；该洞穴则可特异地捕获具有合适一级氨基酸序列的(变性)蛋白质(ProteinPrintTM，Aspira Biosystems，Burlingame，CA)。
另一种可用于诊断和表达作谱的方法是ProteinChip
阵列(Ciphergen，Fremont，CA)，其中固相色谱表面结合例如血浆或肿瘤提取物的混合物中具有类似电荷或疏水性特征的蛋白质，并且SELDI-TOF质谱被用于检测保留的蛋白质。
大型的功能芯片是通过固定大量的纯化蛋白来构建的，并用于测定多种生物化学功能，例如与其他蛋白之间的蛋白相互作用、药物-靶标相互作用、酶-底物相互作用等。通常它们需要一种表达文库，被克隆到大肠杆菌、酵母等中，然后例如通过His标签从中纯化表达的蛋白并固定化。对于不能在细菌或其他体内系统中良好表达的蛋白的合成而言，独立于细胞的蛋白转录/翻译是可行的替代方法。
对于蛋白-蛋白相互作用的检测，蛋白质阵列可成为所述基于细胞的酵母双杂交系统的体外替代方案，并且当该双杂交系统有缺陷时，例如相互作用涉及分泌的蛋白或具有二硫桥的蛋白时，该阵列是有用的。用阵列对酵母蛋白激酶和酵母蛋白质组的各种功能(蛋白-蛋白和蛋白脂质相互作用)进行的生物活性的高通量分析已有描述，其中酵母的所有可译框架中的大部分都被表达并固定在微阵列上。大型“蛋白质组芯片”在识别功能相互作用、药物筛选等方面具有很好的应用前景(Proteometrix，Branford，CT)。
作为个体元素的二维展示，蛋白阵列可用于筛选噬菌体或核糖体展示文库，从而筛选出特异结合的配偶体，包括抗体、合成的支架、肽和适体。可通过这种方式进行“文库对文库”的筛选。本方法的另一个应用是，从针对一种阵列的组合化学文库中筛选药物候选物，所述阵列是基因组项目中识别出的蛋白靶标的阵列。
例如BDTM细胞计量珠粒阵列的多珠粒测定是一系列可用于捕获可溶性分析物并对其定量的光谱不连续颗粒。所述分析物再通过荧光发射检测和流式细胞分析来测定。多珠粒测定产生与基于ELISA的测定相当的数据，但是是以一种“多重”或同时的方式。以与任何夹心形式的测定法相同的方式计算细胞计量珠粒阵列的未知物浓度，即通过使用已知的标准样并且将未知物绘制到标准曲线上。此外，多珠粒测定使得能够对样本中先前由于样本体积限制而从未考虑的可溶性分析物进行定量。除了定量的数据，还可产生显示独特谱或特征的有效可视图像，所述独特谱或特征提供了用户只需扫视一眼即可获得附加的信息。
本文公开的MMP/TIMP谱是基于对单独的MMP或TIMP的测量。可通过任何已知可提供一种示出在所述分析样本中存在多少MMP或TIMP的可用标识的方法测量它们的量。测量方法的实例在实施例部分给出。分析物(例如MPP或TIMP)的定量方法包括对不存在的或者以不可检测量存在的分析物的测量。
构成本发明的基础的用于测量MMP和TIMP的技术和方法是基于高灵敏的免疫测定。这类免疫测定中有多种都是由本实验室开发的(即TIMP-4测定的测量法)。通过酶联免疫测定(ELISA)进行免疫测定，该免疫测定被标准化以提供表4所示的测量值。然而，本实验室施行了其他更灵敏快速的用于测量MMP和TIMP血液水平的方法，它们包括使用多重测定系统。在该实例中，可使用基于珠粒的多重夹心免疫测定来测量有限体积的样本(例如血浆或其他生物样本)中的多种分析物。这种用于多重分析的新技术是基于将ELISA的灵敏度和流式细胞检测相结合的技术之上的，从而使得可以特异地测量不到50μl的单个样本中最多达100种的不同分析物。该方法使得可以测量小量血样中的多种MMP和TIMP。这类方法非常适合本文所描述的诊断、预后、预测和治疗的监测应用。具体而言，为同时测量分析物浓度，将微珠与样本(即血样)一起孵育，并使所述微珠与所述特定目的分析物(即MMP)形成复合体。然后，向混合物中加入特异性针对各分析物上第二表位的检测抗体(生物素化的)，并且使所述检测抗体结合到所述已与分析物结合的微珠上。然后将该混合物与荧光报告分子(链亲和素-藻红蛋白)一起孵育，并使整个样本通过双激光流式细胞检测仪。一个激光检测用于确定待检测的特定分析物的微珠的确切荧光，另一个激光检测报告分子的荧光量，该量与所结合的分析物的量成正比。该方法已被用于多种MMP以及CHF过程可能涉及的其他分析物，如图8和表1所示。这只是如何用极少量血样测量单一或多种分析物的一个实例。已施行的与MMP/TIMP分析物相关的测量的其他实例包括放射免疫测定和免疫印迹测定。这些方法也是基于抗体。
表1用于对计算的标准曲线进行校正和线性回归统计的分析物浓度范围
7.抗体 特异性针对MMP和TIMP的抗体是已知的，并且可商购。表2给出了抗体的实例。
表2MMP/TIMP抗体
本文中术语“抗体”作广义使用，它包括多克隆抗体和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白外，术语“抗体”还包括所述免疫球蛋白分子的片段或多聚物以及人类或人源化形式的免疫球蛋白分子或其片段，只要根据它们与MMP或TIMP相互作用的能力来对其选择即可。可使用本文所述的体外测定或类似方法来测试抗体的所需活性，之后根据已知的临床试验方法测定它们的体内治疗和/或预防活性。
本文使用的“术语”是指从基本上均一的抗体群体中获得的抗体，即，该群体中的个体抗体相同，除了可存在于少量抗体分子中的可能存在的天然突变。本文的单克隆抗体特别地包括“嵌合抗体”及其片段，只要它们显示出所需的拮抗活性，其中所述“嵌合抗体”中重链和/或轻链的一部分与来自一种特定物种的抗体或属于一种特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而该链的其他部分与来自另一物种的抗体或属于另一抗体类别或亚类的抗体的相应序列相同或同源(参见美国专利4,816,567和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。
所公开的单克隆抗体可用任何生产单克隆抗体的方法制备。例如，可用杂交瘤方法制备公开的单克隆抗体，例如Kohler and Milstein，Nature，256495(1975)中所述。在杂交瘤法中，通常用免疫剂免疫小鼠或其他合适的宿主动物，以引发能产生或产生可与该免疫剂特异地结合的抗体的淋巴细胞。
也可用重组DNA法制备单克隆抗体，例如美国专利4,816,567(Cabilly等人)中所述。编码所公开的单克隆抗体的DNA可用常规方法(例如，使用能特异地结合编码鼠类抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。也可采用噬菌体展示技术产生和筛选抗体或活性抗体片段的文库，例如，如Burton等人的美国专利5,804,440和Barbas等人的美国专利6,096,441所述。
体外方法也适于制备单价抗体。可使用本领域已知的常规方法消化抗体以产生抗体片段，特别是Fab片段。例如，可使用木瓜蛋白酶进行消化。木瓜蛋白酶消化的实例在1994年12月22日公开的WO 94/29348和美国专利4,342,566中有描述。抗体的木瓜蛋白酶消化通常产生两个相同的抗原结合片段以及余下的Fc片段，上述抗原结合片段称为Fab片段，每个片段具有单一的抗原结合位点。胃蛋白酶处理可得到具有两个抗原结合位点且仍能交联抗原的片段。
不论是否与其他序列相连接，所述片段也可包含特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其他选定的修饰，条件是，与未修饰的抗体或抗体片段相比，不显著改变或损害该抗体或抗体片段的活性。这类修饰可提供某些其他特性，例如，去除/添加能进行二硫键合的氨基酸、提高其生物寿命、改变其分泌特征等。任何情况下，所述抗体或抗体片段都须具有生物活性，例如与其相关抗原特异地结合。所述抗体或抗体片段的功能性或活性区域可通过对蛋白质特定区域诱变以及随后进行表达并且测试表达的多肽来识别。这类方法对于本领域技术人员而言是显而易见的，可包括对编码所述抗体或抗体片段的核酸进行位点特异性诱变(Zoller，MJ.Curr.Opin.Biotechnol.3348-354，1992)。
本文所使用的术语“抗体”也可指人类抗体和/或人源化抗体。很多非人类抗体(例如来源于小鼠、大鼠或兔的抗体)天然地对人类具有抗原性，因此，当将其给予人类时会产生不良的免疫反应。因此，在所述方法中使用人类或人源化抗体可降低给予人类的抗体引起不良免疫反应的可能性。
8.参照值 提供了可指示受试者中DHF的存在或预测受试者中DHF的发生的MMP和/或TIMP谱。所述指示受试者中DHF的存在或预测受试者中DHF的发生的MMP和/或TIMP谱可以是相对于正常值的数值。给定分析物(MMP或TIMP)的正常值可以是被证实无明显心血管疾病迹象的年龄匹配受试者的参照值。因此，所述正常值可以是来自大量健康个体的群体值。这些参照正常值可通过群体研究获得。已有大型群体研究例如测定出参比组的TIMP-1的相对水平(Framingham Heart Study，Circulation 2004；1092850-2856)大约为800ng/mL，该值与本文公开的参比对照值一致。
或者，所述正常值可以是被认为对于既定受试者而言是正常的数值。例如，可以对健康个体的相关分析物进行基线测量，并将其用于和后来从该个体获得的测量值相比较，以识别当前的疾病或向高血压性心脏病发展的进程。
不连续观察(例如MMP-13的)是将连续变量(例如给定分析物的血浆浓度)转变为二分变量。在该具体实例中，若大于10ng/mL的值被认为是可检测的或者阳性数值，小于10ng/mL的值被认为是阴性数值时，则可将一个+/-值赋予MMP-13。
例如，提供了一种诊断受试者体内不存在与高血压性心脏病相关的LVH的方法，包括测量所述受试者组织或体液中的MMP和/或TIMP水平，并将所述水平与参照值进行比较。因此，MMP-2、MMP-9、MMP-7、MMP-13、MMP-8、TIMP-1、TIMP-2和/或TIMP-4的正常值即为表示不存在与高血压性心脏病相关的左心室肥大的标识。
在某些方面，正常范围内的MMP-2血浆水平表示不存在与高血压性心脏病相关的LVH。在某些方面，正常范围内的MMP-9血浆水平表示不存在与高血压性心脏病相关的LVH。在某些方面，正常范围内的MMP-13血浆水平表示不存在与高血压性心脏病相关的LVH。在某些方面，正常范围内的TIMP-1血浆水平表示不存在与高血压性心脏病相关的LVH。在某些方面，正常范围内的TIMP-2血浆水平表示不存在与高血压性心脏病相关的LVH。在某些方面，正常范围内的TIMP-4血浆水平表示不存在与高血压性心脏病相关的LVH。
在某些方面，MMP-2血浆水平高于约1000ng/ml，包括高于约1000、1100、1200、1300、1400和1500ng/ml时，即表示不存在与高血压性心脏病相关的LVH。
在某些方面，MMP-9血浆水平低于约20ng/ml，包括低于约20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1ng/ml时，即表示不存在与高血压性心脏病相关的LVH。
在某些方面，可检测的MMP-13血浆水平高于约5ng/ml，包括低于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20ng/ml时，即表示不存在与高血压性心脏病相关的LVH。
在某些方面，TIMP-1血浆水平低于约1000ng/ml，包括高于约1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、40、30、20或10ng/ml时，即表示不存在与高血压性心脏病相关的LVH。
在某些方面，TIMP-2血浆水平低于约50ng/ml，包括高于约50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、35、30、25、20、15或10ng/ml时，即表示不存在与高血压性心脏病相关的LVH。
在某些方面，TIMP-4血浆水平低于约2ng/ml，包括高于约2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.5或0.1ng/ml时，即表示不存在与高血压性心脏病相关的LVH。
所述方法可进一步包括测量两种或多种MMP和/或TIMP的血浆水平。例如，所述方法可包括测量MMP-2、MMP-9、MMP-7、MMP-13、MMP-8、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4中的两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种。因此，所述方法可包括测量MMP-2和MMP-9或者MMP-2和MMP-7、MMP-2和MMP-13、MMP-2和MMP-8、MMP-2和TIMP-1、MMP-2和TIMP-2、MMP-2和TIMP-4、MMP-9和MMP-7、MMP-9和MMP-13、MMP-9和MMP-8、MMP-9和TIMP-1、MMP-9和TIMP-2、MMP-9和TIMP-4、MMP-7和MMP-13、MMP-7和MMP-8、MMP-7和TIMP-1、MMP-7和TIMP-2、MMP-7和TIMP-4、MMP-13和MMP-8、MMP-13和TIMP-1、MMP-13和TIMP-13、MMP-13和TIMP-4、MMP-8和TIMP-1、MMP-8和TIMP-2、MMP-8和TIMP-4、TIMP-1和TIMP-2、TIMP-1和TIMP-4、TIMP-2和TIMP-4。因此，所述方法可包括测量MMP-2、MMP-13和TIMP-1；MMP-2、MMP-13和TIMP-2；MMP-2、MMP-13和TIMP-4；MMP-13、TIMP-1和TIMP-2；MMP-13、TIMP-1和TIMP-4；MMP-13、TIMP-2和TIMP-4。因此，所述方法可包括测量MMP-2、MMP-13、TIMP-1和TIMP-2；MMP-2、MMP-13、TIMP-1和TIMP-4；MMP-2、MMP-13、TIMP-2和TIMP-4；MMP-13、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4；MMP-2、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4。因此，所述方法可包括测量MMP-2、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4。本文也考虑和公开了这些分析物的其他组合。
所述方法可进一步包括计算一种或多种MMP或TIMP与其他的MMP或TIMP的比值，例如所述方法可包括计算MMP-9与TIMP-1、TIMP-2或TIMP-4的比值。
例如，在某些方面，MMP-9/TIMP-1血浆水平之比大于约7×103，包括大于约7×103、8×103、9×103、10×103、11×103、12×103、13×103或14×103时，即表示不存在与高血压性心脏病相关的LVH。
在某些方面，MMP-9/TIMP-2血浆水平之比大于约10×104，包括大于约10×104，20×104，30×104或40×104时，即表示不存在与高血压性心脏病相关的LVH。
在某些方面，MMP-9/TIMP-4血浆水平之比大于约1，包括大于约1、2、3、4、5、6、7、8或9时，即表示不存在与高血压性心脏病相关的LVH。
所述参照正常值和在对高血样患者筛选时测得的数值示于表3中。在该实例中，患有LVH的高血压患者的MMP-2值会降低，但MMP-7值不变。然而，将对MMP-13进行不连续观察，因为它在患有LVH的高血压患者中检测不到。因此，低于10ng/mL的分界点被认为是高血压和心力衰竭的诊断标准。与参比对照值相比，患有LVH的高血压患者的TIMP-1和TIMP-4水平可高50％。与参照正常值相比，患有LVH的高血压患者的MMP-9/TIMP-4之比降低50％以上。
表3MMP和TIMP数据；参照正常值和高血压性心脏病；诊断百分比分界点
NC＝相对于正常无变化 *与正常相比，p<0.05 9.LVH快速筛选 提供了一种可通过测定一种具体的MMP即MMP-13的水平获得的“是/否”型快速结果。可将一个调定点——可根据年龄的改变和群体统计学而加以调整——用作为所述有效的读数。例如，低于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ng/mL的阈值设置的MMP-13水平将使得需要更深入的血浆筛选和其他心血管成像研究。换言之，这种快速筛选测试可应用于任何大型群体，然后可识别出那些可保证更严格的试验和随访的受试者。目前还没有可用于识别LVH患者的快速筛选测试。
提供了一种预测受试者舒张期心力衰竭的方法，包括测量受试者体液中MMP-13的量，量小于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ng/mL或者检测不到即表示存在LVH并预示DHF。当结合本文公开的其他相关分析物的异常测量值时，上述测量能检测DHF。
可以在初步试验或医学筛选时进行血浆作谱。可针对一种或多种MMP和/或TIMP进行上述筛选测量。如果所述一个或多个测量值落在参照值之外，则可进行其他的测量。例如，可用MMP-13进行初步筛选，这样，如果检测不到MMP-13，则可对该血浆样本进行另一测定。类似地，也可用MMP-9和TIMP-1、TIMP-2和/或TIMP-4进行初步筛选，这样，如果MMP-9与TIMP-1、TIMP-2或TIMP-4的比值低于具有确定阈值的正常限度时，则可对血浆样本进行另一测定。所述另一测定可用于获得表3所示的全部谱或其一部分。如果该谱达到高血压心脏病的标准，则可通过更强效的测试评价所述患者，所述测试可包括合适的超声心动图显象、导管插入术、核成像。也可对患者进行更强效的医学处理评价。
10.诊断 还提供了一种可用于例如以下一种受试者的诊断方法，所述受试者表现出CHF征候和症状，但该表现的根本原因难以确定。这种情况极其频繁地发生；当患者患有CHF时，很难确定是否存在LVH和DHF，以及它们是否会促进CHF过程的加剧。本申请所述的一种简单快速地“确定”或“排除”LVH和DHF存在的血液测试的应用，可提供这种所需的诊断方法。具体而言，可测量血样的MMP-13、MMP-9、MMP-2、TIMP-1和/或TIMP-4。可将获得的数值与本文公开的正常参照值进行比较。如果该值偏离由本文确定的阈值表示的正常限度，则可确定患者具有DHF。
例如，提供了一种诊断受试者的LVH的方法，包括测量所述受试者组织或体液中的MMP和/或TIMP水平，并将所述水平与参照值进行比较。
在某些方面，MMP-2血浆水平低于正常值时即表示有高血压性心脏病。例如，MMP-2的量比正常平均值至少低约20％时可表示有高血压性心脏病。在某些方面，MMP-2血浆水平低于约1000ng/ml，包括低于约1000、990、980、970、960、950、940、930、920、920、900、890、880、870、860、850、840、830、820、810、800、790、780、770、760、750、740、730、720、710、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、250或100ng/ml时即表示有高血压性心脏病。
在某些方面，MMP-9血浆水平高于正常值时即表示有高血压性心脏病。例如，MMP-9的量比正常平均值至少高约50％时，可表示有高血压性心脏病。在某些方面，MMP-9血浆水平高于约20ng/ml，包括高于约20、21、22、23、24、15、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/ml时即表示有高血压性心脏病。
在某些方面，MMP-13血浆水平检测不到时即表示有LVH。在某些方面，MMP-13血浆水平低于约10ng/ml，包括低于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1ng/ml时即表示有LVH。
在某些方面，TIMP-1血浆水平高于正常值时即表示有高血压性心脏病。例如，TIMP-1的量比正常平均值至少高约50％时，可表示有LVH。在某些方面，TIMP-1血浆水平高于约1000ng/ml，包括高于约1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400或1500ng/ml时即表示有LVH。
在某些方面，TIMP-2血浆水平高于正常值时即表示有LVH。例如，TIMP-2的量比正常平均值至少高约50％时，可表示有LVH。在某些方面，TIMP-2血浆水平高于约50ng/ml，包括高于约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/ml时即表示有LVH。
在某些方面，TIMP-4血浆水平高于正常值时即表示有LVH。例如，TIMP-4的量比正常平均值至少高约50％时，可表示有LVH。在某些方面，TIMP-4血浆水平高于约2ng/ml，包括高于约2、3、4、5、6、7、8、9或10ng/ml时即表示有LVH。
在某些方面，MMP-7血浆水平在正常范围内时可表示有LVH。在某些方面，MMP-8血浆水平在正常范围内时可表示有LVH。
所述方法可进一步包括测量两种或多种MMP和/或TIMP的血浆水平。例如，所述方法可包括测量MMP-2、MMP-9、MMP-7、MMP-13、MMP-8、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4中的两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种。因此，所述方法可包括测量MMP-2和MMP-9；MMP-2和MMP-13；MMP-13和TIMP-1；MMP-13和TIMP-2；MMP-13和TIMP-4；MMP-2，MMP-13和TIMP-1；MMP-2，MMP-13和TIMP-2；MMP-2，MMP-13和TIMP-4；或者MMP-2、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4。本文考虑并公开了上述分析物的其他组合。
例如，当TIMP-1增加(TIMP-1>1200ng/mL)且MMP-13水平降低时，即可检出DHF。又例如，当TIMP-4的量高于3ng/mL，且MMP-13水平降低、TIMP-1水平增加时，就表明有LVH并可预测DHF。因此，一种检测受试者LVH并预测受试者舒张期心力衰竭的方法，包括测量受试者体液中的MMP-13、TIMP-1和TIMP-4的谱。MMP-13的量检测不到、TIMP-1的量比正常值高约50％(或高于1200ng/mL)且TIMP-4的量比正常值至少高约50％(或高于3ng/mL)时的谱预示DHF。
所述方法可进一步包括计算一种或多种MMP或TIMP与其他MMP或TIMP的比值。例如，所述方法可包括计算MMP-9与TIMP-1、TIMP-2或TIMP-4的比值。
在某些方面，MMP-9/TIMP-1血浆水平之比小于正常值时即表示有LVH。例如，MMP-9/TIMP-1之比比正常平均值至少小约50％时，可表示有LVH。例如，在某些方面，MMP-9/TIMP-1血浆水平之比小于约7×103，包括小于约7×103、6×103、5×103、4×103、5×103、6×103、1×103时，即表示有LVH。
在某些方面，MMP-9/TIMP-2血浆水平之比小于正常值时即表示有LVH。例如，MMP-9/TIMP-2之比比正常平均值至少小约50％时，可表示有LVH。在某些方面，MMP-9/TIMP-2血浆水平之比小于约100×103，包括小于约100×103、90×103、80×103、70×103、60×103、50×103、40×103、30×103、20×103或10×103时，即表示有LVH。
在某些方面，MMP-9/TIMP-4血浆水平之比小于正常值时即表示有LVH。例如，MMP-9/TIMP-4之比比正常平均值至少小约50％时，可表示有LVH。在某些方面，MMP-9/TIMP-4血浆水平之比小于约3，包括小于约3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01时，即表示有LVH。
在某些方面，MMP-9/TIMP-1血浆水平之比小于约5×103，MMP-9/TIMP-2血浆水平之比小于约100×103，以及MMP-9/TIMP-4血浆水平之比小于约1时，即表示有LVH。
在某些方面，MMP-2血浆水平小于约1000ng/ml，MMP-13血浆水平小于约5ng/ml，MMP-9/TIMP-1血浆水平之比小于约5×103，MMP-9/TIMP-2血浆水平之比小于约100×103，以及MMP-9/TIMP-4血浆水平之比小于约1时，即表示有LVH。
11.预后 还提供了一种可用于例如以下一种受试者的舒张期心力衰竭的预后方法，所述选用于进行筛选以及之后进一步的血浆作谱的受试者被证实患有严重的LVH并且具有发生DHF的风险。在该情况中，对MMP-13水平以及TIMP水平定量。MMP-13水平较低/检测不到(0-5ng/mL)，且TIMP水平与对照正常受试者TIMP水平相比较高(例如TIMP-1>1200ng/mL、TIMP-2>700ng/mL和/或TIMP-4>3ng/mL)时，可能会得出反映心肌纤维化和舒张期功能障碍程度的重要观察结果。这就提供了关于症状发展和住院治疗进程的预后值。具体而言，可用高血压药物对这些患者进行进一步加强治疗，并可对其进行更常规的心血管成像研究。
例如，提供了一种识别发生舒张期心力衰竭(DHF)的风险增加的患者的方法，包括测量所述受试者组织或体液中的MMP和/或TIMP水平，并将所述水平与参照值进行比较。
在某些方面，MMP-2血浆水平低于正常值时即表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。例如，MMP-2的量比正常平均值至少低约20％时，可表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。在某些方面，MMP-2血浆水平低于约500ng/ml，包括低于约500、450、400、350、300、250、200、250或100ng/ml时，即表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。
在某些方面，MMP-13血浆水平检测不到时即表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。在某些方面，MMP-13血浆水平低于约10ng/ml，包括低于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1ng/ml时，即表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。
在某些方面，TIMP-1血浆水平高于正常值时即表示发生舒张期心理衰竭的风险增加。例如，TIMP-1的量比正常平均值高至少约50％时，可表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。在某些方面，TIMP-1血浆水平高于约1000ng/ml，包括高于约1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000ng/ml时，即表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。
在某些方面，TIMP-2血浆水平高于正常值时即表示发生舒张期心理衰竭的风险增加。例如，TIMP-2的量比正常平均值高至少约50％时，可表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。在某些方面，TIMP-2血浆水平高于约50ng/ml，包括高于约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200ng/ml时，即表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。
在某些方面，TIMP-4血浆水平高于正常值时即表示发生舒张期心理衰竭的风险增加。例如，TIMP-4的量比正常平均值高至少约50％时，可表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。在某些方面，TIMP-4血浆水平高于约2ng/ml，包括高于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50ng/ml时，即表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。
在某些方面，MMP-9血浆水平在正常范围内时可表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。在某些方面，MMP-7血浆水平在正常范围内时可表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。在某些方面，MMP-8血浆水平在正常范围内时可表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。
所述方法可进一步包括测量两种或多种MMP和/或TIMP的血浆水平。例如，所述方法可包括测量MMP-2，MMP-9，MMP-7，MMP-13，MMP-8，TIMP-1，TIMP-2和TIMP-4中的两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种。因此，所述方法可包括测量MMP-2和MMP-9、MMP-2和MMP-7、MMP-2和MMP-13、MMP-2和MMP-8、MMP-2和TIMP-1、MMP-2和TIMP-2、MMP-2和TIMP-4、MMP-9和MMP-7、MMP-9和MMP-13、MMP-9和MMP-8、MMP-9和TIMP-1、MMP-9和TIMP-2、MMP-9和TIMP-4、MMP-7和MMP-13、MMP-7和MMP-8、MMP-7和TIMP-1、MMP-7和TIMP-2、MMP-7和TIMP-4、MMP-13和MMP-8、MMP-13和TIMP-1、MMP-13和TIMP-13、MMP-13和TIMP-4、MMP-8和TIMP-1、MMP-8和TIMP-2、MMP-8和TIMP-4、TIMP-1和TIMP-2、TIMP-1和TIMP-4、TIMP-2和TIMP-4。因此，所述方法可包括测量MMP-2、MMP-13和TIMP-1；MMP-2、MMP-13和TIMP-2；MMP-2、MMP-13和TIMP-4；MMP-13、TIMP-1和TIMP-2；MMP-13、TIMP-1和TIMP-4；MMP-13、TIMP-2和TIMP-4。因此，所述方法可包括测量MMP-2、MMP-13、TIMP-1和TIMP-2；MMP-2、MMP-13、TIMP-1和TIMP-4；MMP-2、MMP-13、TIMP-2和TIMP-4；MMP-13、TIMP-1、TIMP-2，和TIMP-4；MMP-2、TIMP-1、TIMP-2，和TIMP-4。因此，所述方法可包括测量MMP-2、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4。本文还考虑和公开了这些分析物的其他组合。
例如，提供了一种检测受试者的舒张期心力衰竭的方法，包括测量所述受试者体液中的MMP-13、TIMP-1、TIMP-4和MMP-9的量。还提供了一种预测受试者的舒张期心力衰竭的方法，包括测量所述受试者体液中的MMP-13、TIMP-1、TIMP-4和MMP-9的量。在这些方法中，可显示出MMP-13的量检测不到(或低于10ng/mL)、TIMP-1的量比正常值高约50％或高于1200ng/mL、TIMP-4的量比正常值至少高约50％或高于3ng/mL，以及MMP-9的量比正常值至少高约50％的谱可检出LVH和DHF。
还提供了一种检测受试者的舒张期心力衰竭的方法，包括测量所述受试者体液中的MMP-13、TIMP-1，TIMP-4和MMP-2的量。还提供了一种预测受试者的舒张期心力衰竭的方法，包括测量所述受试者体液中MMP-13、TIMP-1，TIMP-4和MMP-2的量。在这些方法中，谱图可显示出MMP-13的量检测不到(或低于10ng/mL)、TIMP-1的量比正常值高约50％(或高于1200ng/mL)、TIMP-4的量比正常值至少高约50％(或高于3ng/mL)、以及MMP-2的量比正常值至少高约20％。
所述方法可进一步包括计算一种或多种MMP或TIMP与其他MMP或TIMP的比值。例如所述方法可包括计算MMP-9与TIMP-1、TIMP-2或TIMP-4的比值。
在某些方面，MMP-9/TIMP-1血浆水平之比小于正常值时即表示有LVH。例如，MMP-9/TIMP-1之比比正常平均值至少小约50％时，可表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。例如，在某些方面，MMP-9/TIMP-1血浆水平之比小于约7×103，包括小于约7×103、6×103、5×103、4×103、5×103、6×103、1×103、9×102、8×102、7×102、6×102、5×102、4×102、3×102、2×102或1×102时，即表示发生舒张期心力衰竭的风险增加。
在某些方面，MMP-9/TIMP-2血浆水平之比小于正常值时即表示有LVH。例如，MMP-9/TIMP-2之比比正常平均值至少小约50％时，可表示有LVH。在某些方面，MMP-9/TIMP-2血浆水平之比小于约100×103，包括小于约100×103、90×103、80×103、70×103、60×103、50×103、40×103、30×103、20×103、10×103、9×103、8×103、7×103、6×103、5×103、4×103、3×103、2×103或1×103时，即表示有LVH。
在某些方面，MMP-9/TIMP-4血浆水平之比小于正常值时即表示有LVH。例如，MMP-9/TIMP-4之比比正常平均值至少小约100％时，可表示有LVH。在某些方面，MMP-9/TIMP-4血浆水平之比小于约1，包括约1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.25、0.2、0.15、0.10、0.05或0.01时，即表示有LVH。
因此，所述方法提供了一种检测或预测受试者舒张期心力衰竭的方法，包括检测到所述受试者体液的MMP-9与TIMP-4之比比提供的正常比值低。所述方法包括测量到该比值比正常比值低至少约50％。
在某些方面，MMP-9/TIMP-1血浆水平之比小于约5×103，MMP-9/TIMP-2血浆水平之比小于约100×103，以及MMP-9/TIMP-4血浆水平之比小于约1时，即表示有LVH。
在某些方面，MMP-2血浆水平小于约1000ng/ml，MMP-13血浆水平小于约5ng/ml，MMP-9/TIMP-1血浆水平之比小于约5×103，MMP-9/TIMP-2血浆水平之比小于约100×103，以及MMP-9/TIMP-4血浆水平之比小于约1时，即表示有LVH。
12.指导治疗性干预 在治疗中，MMP-13低水平和TIMP-1高水平可作为药物疗效的监测指标。有多种高度适用上述指标的相关临床状况。例如，当高血压患者的血压在“正常限度”内时，MMP-13水平降低，TIMP水平升高。于是可使用增加某些高血压药物以使这些心肌纤维化和舒张期心力衰竭的生物标记正常。该方法的目标是连续测量如表3所示的血液MMP和TIMP值，以及增加用药以使这些谱在正常参照范围内。
对于被确定因高血压致使心脏质量(大小)增加的高血压患者，MMP/TIMP谱可用于跟踪治疗的适当性。可对本文公开的这些已识别出的特定谱进行监测，所述MMP/TIMP谱向正常范围移动时可确定治疗有效。
MMP/TIMP谱是基于对单个MMP或TIMP的测量。它们的量可通过任何已知的方法测量，以提供一种可接受的指标以指示它们在所分析的样本中的含量。实施例部分给出了测量方法的一个实例。测量分析物(例如，MMP或TIMP)量的方法包括分析物不存在或分析物不可检测时对分析物量的测量。用于构成该方法基础的MMP和TIMP的测量技术和方法基于高灵敏免疫测定。这些免疫测定中有多种均由本实验室开发(即，TIMP-4测定测量法)。
可将免疫测定方法标准化以提供表1所示的测量值，用酶联免疫测定(ELISA)实施该免疫测定方法。然而，本实验室已经施行了其他更灵敏快速的MMP和TIMP血液水平测量方法，它们包括使用一种多重测定系统。在该实例中，可使用基于珠粒的多重夹心免疫测定来测量有限体积的样本(例如血浆或其他生物样本)中的多种分析物。这种用于多重分析的新技术是基于将ELISA的灵敏度和流式细胞检测相结合的技术之上的，从而使得可以特异地测量不到50μl的单个样本中最多达100种的不同分析物。该方法使得可以测量小量血样中的多种MMP和TIMP。这类方法可用于本文所描述的诊断、预后、预测和治疗监测应用。具体而言，为同时测量分析物浓度，将微珠与样本(即血样)一起孵育，并使得所述微珠与所述特定目的分析物(即MMP)形成复合体。然后，向混合物中加入特异性针对各分析物上第二表位的检测抗体(生物素化的)，并使其与复合了分析物的珠粒结合。然后，将该混合物与荧光报告分子(链亲和素-藻红蛋白)一起孵育，并使整个样本通过双激光流式细胞检测仪。一个激光检测用于确定待检测的特定分析物的微珠的确切荧光，另一个激光检测报告分子的荧光量，该量与所结合的分析物的量成正比。该方法已被用于多种MMP以及CHF过程可能涉及的其他分析物，如图16和表1所示。这只是如何用极少量血样测量单一或多种分析物的一个实例。本实验室已施行的与MMP/TIMP分析物相关的测量的其他实例包括放射免疫测定和免疫印迹测定。这些方法也是基于抗体。
13.组合 本文公开的方法可进一步包括检测心力衰竭的其他标记。例如，本文公开的方法可进一步包括测量所述受试者组织或体液中的NT-proBNP水平，并将所述水平与参照值进行比较。本文公开的方法可进一步包括测量所述受试者组织或体液中的肌钙蛋白-I的水平，并将所述水平与参照值进行比较。
14.测量时机 如下文所述以及其他用于筛选和治疗监测的实施例所说明的，测量时机应结合特定的背景。对于筛选，可以在受试者进行医学检查的任何时候进行。其实例可包括每年的体格检查、保健展会以及借助家用装置的筛选。因此，所公开的诊断方法可用于诊断表现出CHF征候和症状但该表现的根本原因难以确定的受试者。
存在至少三个用于本文所公开方法的MMP/TIMP作谱的初始时间点。初始测量可在具有确定的高血压病史且经常访问门诊的患者中进行。初始测量可在可能导致门诊访问的保健展会时进行。初始测量可在表现出高血压性心脏病所致的症状的患者中进行。图9A-C示出了每种情况中针对各个情况的采样和诊断方案。
因此，公开的预后方法可用于鉴定表现有高血压(血压过高)的受试者是否有LVH或者具有发生DHF的风险。公开的预后方法也可用于鉴定表现出CHF征候和症状的受试者是否有LVH并且具有发生舒张期心力衰竭(DHF)的风险。例如，所述方法可用于向医生诉说不适且该不适与CHF相符的患者。这样，医生可应用血液测试以确定是否存在与LVH和DHF相符的MMP/TIMP谱。由此可指导医生制定进一步的诊断测试和治疗计划。
另一个采集血样的时机的实例是在患者被识别患有确定的LVH时，可将MMP/TIMP连续监测谱用作预测DHF进程的工具。这些测试作为筛选工具可在任何给定的受试者中只应用一次，或者连续应用多次。
C.试剂盒 本文公开的试剂盒涉及可用于实施本文公开的方法的试剂。所述试剂盒可包括本文所述的任何试剂或试剂的组合，或者被认为是实施本文公开的方法所需的或对其有益的试剂或试剂的组合。例如，公开了一种用于评估受试者发生DHF风险的试剂盒，其中的组分包括前文所述的组分。例如，MMP/TIMP试剂盒的组分可包括相关目的MMP和/或TIMP(参见表3中相关MMP和TIMP的列表)与一种检测试剂复合所必需的试剂。在免疫测定方法的实例中，可将血样与针对特定的MMP或TIMP的荧光标记的抗体一起孵育，并在洗涤和非特异性结合清除步骤之后，通过测量荧光相对强度计算与所述目的MMP或TIMP结合的抗体量。它可以是一种非常简单的可用于筛选的试剂盒，或者是一种更为复杂的测量单个样本中的多种MMP/TIMP的系统。从测量一种目的MMP或TIMP到同时测量多种MMP/TIMP的多层次方法的基本原理已在前文中描述。对于筛选测定(即MMP-13)，可将小量血样处理成血浆(离心)，并将该血浆与抗MMP-13抗体混合。可将混合物再次离心，通过荧光分析系统读取特异性结合MMP-13的抗体。该设备和测量系统可容易地制成小型手提箱或桌面系统。上述系统的读数可指示MMP-13是否低于或高于(如前文中所定义的)特定的测量阈值。
D.实施例 1.实施例1基质金属蛋白酶/金属蛋白酶的组织抑制剂基质组分的蛋白水解因子的改变与高血压心脏病的结构、功能和临床表现间的关系 方法和结果简述将103名受试者分为如下4组a)未显示出心血管疾病的参照受试者(CTL)；b)高血压(HTN)，血压已控制且无LV肥大；c)高血压，血压已控制且有LV肥大(HTN&LVH)，但无CHF；d)高血压，血压已控制，LVH且CHF(HTN&LVH&CHF)，从上述受试者中获得了血浆MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1和TIMP-2，以及多普勒回声心动描记图。与CTL相比，HTN患者的所有MMP或TIMP均无明显改变。HTN&LVH患者的MMP-9和MMP-13降低，MMP-9升高。只有HTN&LVH&CHF患者的TIMP-1升高。TIMP-1>1200ng/mL时预示了CHF。
结论LV结构和功能正常的高血压患者具有正常的MMP/TIMP谱。倾向于减少ECM降解的MMP谱的改变与LV肥大和舒张期功能障碍有关。TIMP-1升高预示了存在CHF。这些数据表明，MMP/TIMP平衡的变化在高血压心脏病的结构、功能和临床表现中具有重要作用， 方法 受试者本研究中招募了两组受试者参比对照和LVH患者。通过当地资助的保健展会和来自南卡罗莱纳医科大学员工的志愿者确定参比对照。所筛选的参比对照中，35％入选，50％符合下文所列的排除标准中的一条，15％未准予参加。通过超声心动图研究识别LVH患者。所筛选的患者超声心动图中，10％入选，75％符合下文所列的排除标准中的一条，15％未准予参加。两组具有一些共有的排除标准 1)心肌梗塞病史，2)区域性室壁运动异常，3)冠状动脉重建手术，4)淀粉样变、结节病、HIV、肥大性栓塞性心肌病、瓣膜性心脏病，5)射血分数<50％，6)恶性肿瘤，7)严重的肾或肝功能障碍，8)风湿性疾病，9)血压>140/90mmHg。
有103名受试者入选本研究53名参比对照受试者和50名显示出LVH的受试者[LV室壁厚度>1.2cm和/或LV质量指数≥125gm/m2(表4)]。基于是否存在高血压将参比对照受试者细分为两组；39名对照受试者(称为“无高血压的参比对照”)无高血压病史、未显示出心血管(CV)疾病、无心血管疾病的症状或体征、无心血管给药且所有超声心动图测量均在正常范围内(表5)；14名患者(称为“有高血压的参比对照”)有高动脉压病史、血压已控制(经药物治疗以达到JNC7标准，即<140/90mmHg)、无左心室肥大(Chobanian AV，et al.2003)且所有超声心动图测量均在正常范围内(表5)。
表4左心室结构/功能和MMP/TIMP的人口统计学数据
缩写数据以平均值+SEM表示，LV＝左心室，LVH＝高血压性左心室肥大的患者，参比对照＝未显示出心血管疾病的受试者，IVRT＝等容舒张时间，PCWP＝肺毛细血管楔压，MMP＝基质金属蛋白酶，TIMP＝MMP组织抑制剂，*＝与参比对照相比p<0.05。
表5有高血压和无高血压的参比对照，有CHF和无CHF的LVH
缩写数据以平均值+SEM表示，LV＝左心室，PCWP＝肺毛细血管楔压，EDV＝舒张期末容积，Ea＝有效动脉回弹率，MMP＝基质金属蛋白酶，TIMP＝MMP组织抑制剂，LVH＝高血压性左心室肥大的患者，CHF＝慢性心脏病。用ANOVA和Tukey多重比较检验分析所有4组间的显著性差异，*＝与无高血压的参比对照相比p<0.05，#＝与有高血压的参比对照相比p<0.05，Δ＝与无CHF的LVH相比p<0.05。
基于是否存在CHF将LVH患者细分为两组。23名血压受控制且有LVF但无CHF的高血压患者被称为“无CHF的LVH”(表5)。第二亚组由26名血压受控制且有LVH和CHF的高血压患者组成，被称为“有CHF的LVH”。所有这些患者显示出符合Framingham标准(Levy D，et al.1996)定义的CHF，显示出舒张异常(E’减小)，硬度增加(PCWP增加以及PCWP/EDV比值增加)，6分钟的通行距离显著减小(与无CHF的LVH组的1839±60英尺相比，有CHF的LVH组为979±86英尺，p<0.05)，EF>50％，因此，存在舒张期心力衰竭。
由患者的主治医生而非研究者来选择和检测用于治疗高血压的药物。它们包括利尿药、肾素血管紧张素醛固酮拮抗剂(血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂和醛固酮阻断剂)、直接的血管扩张药(硝酸盐、肼屈嗪)、α肾上腺素能阻断剂、中枢神经系统阻断剂、阿司匹林、β肾上腺素能阻断剂和钙通道阻断剂。抗高血压治疗的平均持续时间为6.4±1.5年。
超声心动描记法 用装有S-4MHz换能器的Sonos 5500系统获得超声心动图。使用美国超声心动描记术学会标准进行测量(Sahn DJ，et al.1978；Schiller NB，et al.1989)。用圆盘法(Schiller NB，et al.19)计算LV和左房容积。用Reichek和Devereux的公式(Devereux RB，et al.1986)计算LV质量。对二尖瓣流入E和A波速、E/A比值、E波减速时间和等容舒张时间(IVRT)进行多普勒测量。对二尖瓣E’和A’波速进行组织多普勒(侧二尖瓣环)测量。用公式2+1/3E/E′(Nagueh SF，et al.1998)计算肺毛细血管楔压(PCWP)。用公式收缩期末压/每搏量来计算有效动脉回弹率(Ea)。
MMP/TIMP血浆测量用双位点酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，UK)检测明胶酶(MMP-2和MMP-9)、胶原酶(MMP-13)和MMP组织抑制剂(TIMP-1和TIMP-2)。将血浆和各MMP标准物加入含有目的MMP或TIMP的抗体的预包被孔中，并洗涤。在450nm波长处对所得反应读数(Labsystems Multiskan MCC/340，Helsinki，Finland)。由于MMP-13在血浆中的存在水平极其低，将MMP-13分为可检测的和检测不到的。
统计学分析在6小时时间段内每2小时测量MMP和TIMP，以利用单因素随机效果ANOVA(random effects ANOVA)计算一个参比对照受试者亚组(n＝20)的个体受试者之间以及个体受试者内的MMP/TIMP测量值的变异系数。通过个体均方误差的平方根乘以100计算所述系数。MMP-2的患者内变异系数＝11.2±1.1％，TIMP-1＝8.5±2.2％，TIMP-2＝14.3±1.7％。确定所述测定技术本身变异量而测定的内变异系数对于所有MMP和TIMP均小于6％。
最初，用双侧Studentt检验比较参比对照和LVH受试者。然后用ANOVA和Tukery多重比较检验在所有四组间(有高血压的参比对照、无高血压的参比对照、有CHF的LVH与无CHF的LVH)进行分析比较。p值<0.05就被认为是显著的。使用简单线性回归考察MMP和TIMP水平与LV结构和功能之间的关系。用Mantel Hanzel χ2检验和受试者工作曲线评价MMP-13和TIMP-1水平与LVH和CHF的存在间的关系。首先用单变量、然后用多变量回归分析，来考察药物对结构、功能或血浆数据的潜在影响。结构、功能、MMP或TIMP测量值是因变量，同时以输入的药物作为虚拟变量。先考察单个药物，再考察药物组合。
本研究使用的研究方案由南卡罗莱纳医科大学的机构审核委员会审核批准。获得了所有参加者的书面知情同意。作者已完整获得这些数据并对其完整性负责。所有作者已阅读并同意原始书写稿。
结果 参比对照与LVH 结构/功能数据参比对照受试者的年龄和性别分布与LVH受试者相似(表3和4)。与参比对照相比，LVH的收缩压更高，具有表现为LV质量指数高60％的明显同心性重构，舒张期末容积无差异，以及LV舒张期末容积与质量之比低40％。与参比对照相比，LVH的LV舒张期舒张指数和LV舒张期硬度指数均明显异常IVRT增加、E波减速时间增加、E’减少、肺毛细血管楔压增加，以及与参比对照(0.09±0.01mmHg/mL)相比，PCWP与LV舒张期末容积的比值增大(LVH中0.16±0.01mmHg/mL，p<0.05)，表明了LV瞬时舒张期末动作性僵硬(instantaneous end diastolicoperating stiffness)增加。
MMP和TIMP血浆谱与参比对照相比，LVH中MMP-2降低，MMP-9升高。MMP-13的可检测性存在显著差异(图1)。47％的参比对照具有可检测水平的MMP-13，而只有在15％的LVH受试者中可检测到MMP-13(χ2＝17.89，p<0.001，优势比＝0.24)。与参比对照相比，LVH中的血浆TIMP-1显著升高。参比对照和LVH的TIMP-2以及MMP-9/TIMP-1和MMP-2/TIMP-2比值并无差异。
无高血压的参比对照与有高血压的参比对照 结构/功能数据将无高血压的参比对照受试者作为年龄和性别匹配的参比对照组用于与有高血压的参比对照、无CHF的LVH和有CHF的LVH组进行比较。无高血压的参比对照与有高血压的参比对照之间，LV结构或功能的任何人口统计学参数或任何超声心动图测量值均没有显著差异(表3和4)。无高血压的参比对照的左房最大容积(LAMV)和排空分数(LAEF)(LAMV＝40±2ml，LAEF＝42±3％)与有高血压的参比对照(LAMV＝42±4ml，LAEF＝43±2％)相似。
MMP和TIMP血浆谱无高血压的参比对照受试者与有高血压的参比对照之间的任何MMP或TIMP血浆水平均无显著性差异。
无CHF的LVH与有CHF的LVH 结构/功能数据无CHF的LVH与有CHF的LVH受试者之间的收缩压、LV容积或质量均无显著差异(表5)。但与无CHF的LVH相比，有CHF的LVH的舒张期功能被损害的程度明显更严重。与无CHF的LVH相比，有CHF的LVH的舒张期舒张指数更慢、舒张期硬度指数更高并且充盈压指数更高。具体而言，与无高血压的参比对照(10±0.4cm/s，95％CI＝9.3，11)以及有高血压的参比对照(9.8±0.5cm/s，95％CI＝8.1，11)相比，无CHF的LVH患者的组织多普勒E’降低(8.4±0.4cm/s，95％置信区间(CI)为7.4，9.3)。有CHF的LVH中的E’进一步降低(7.2±0.5cm/s，95％CI＝6.2，8.3)。与无高血压的参比对照(10±1mmHg，95％CI＝9.3，10.6)以及有高血压的参比对照(11±1mmHg，95％CI＝9.1，12.2)相比，无CHF的LVH患者的PCWP未改变(13±2mmHg，95％CI＝10.5，15.2)，但是在有CHF的LVH中增加(17±2mmHg，95％CI＝15.2，17.7)。在无CHF的LVH患者中，PCWP与LV舒张期末容积之比不变，但在有CHF的LVH患者中该比值显著升高。有效动脉回弹率在无CHF的LVH中升高，在有CHF的LVH中降低。LAMV在无CHF的LVH中升高(LAMV＝53±4ml，与参比对照相比p<0.05)，在有CHF的LVH中进一步升高(LAMV＝70±5ml，与无CHF的LVH相比p<0.05)。LAEF在有CHF的LVH中不变(LAEF＝42±3％，与参比对照相比p<0.05)，但在有CHF的LVH中增加(LAEF＝48±2％，与无CHF的LVH相比)。
MMP和TIMP血浆谱与有CHF的LVH相比，无CHF的LVH的MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-2或MMP/TIMP比值无显著差异(图1)。然而，与无CHF的LVH相比(1092±77ng/ml，95％CI＝933，1252)，有CHF的LVH的TIMP-1显著增加(1364±86ng/ml，95％CI＝1185，1543)。事实上，TIMP-1只在有CHF的受试者中增加。与无高血压的参比对照(1000±42ng/ml，95％CI＝915，1085)以及有高血压的参比对照(988±76ng/ml，95％CI＝824，1152)相比，无CHF的LVH患者的TIMP-1未改变。
MMP和TIMP血浆谱与LV结构和功能之间的关系TIMP-1和LV重构程度之间存在明显关联。当TIMP-1增加时，LV质量增加(r＝0.30，p＝0.005)，容积/质量比值下降(r＝-0.56，p＝0.001，图2A)。TIMP-1与舒张期功能障碍程度之间存在明显关联。当TIMP-1增加时，二尖瓣E/A比值下降(r＝-0.22，p<O.027)、E’下降(r＝-0.62，p＝0.001，图2B)并且PCWP增大(r＝0.28，p＝0.013)。最后，CHF程度与TIMP-1水平之间存在明显关联。NYHA III类有CHF的LVH受试者的TIMP-1平均值比NYHA II类有CHF的LVH受试者更高。TIMP-1水平>1200ng/ml时，预示为有CHF的LVH(χ2＝4.6，p＝0.03，特异性＝88％以及阳性预测值＝94％，优势比＝3.54，95％置信区间＝1.08，11.50)。受试者工作特征曲线(ROC)下面积为0.71。
特定药物的使用与各组间LV结构、功能或血浆MMP/TIMP谱的差异之间并无关联。具体而言，以任何药物或药物组合分组的患者之间的任何MMP或TIMP水平无差异。然而，应认识到，本研究并不足以彻底弄清药物对LV结构、功能或血浆MMP/TIMP谱的影响。因此，应适当谨慎地解释这些数据和分析。
讨论 本研究有三个独特的发现1)LV结构和功能正常的高血压患者具有正常的MMP/TIMP谱，2)倾向于减少ECM降解(MMP-2、MMP-13减少，TIMP-1增加)的MMP和TIMP谱的改变与LV肥大和舒张期功能障碍相关，和3)TIMP-1增加预示了存在CHF。
虽然MMP和TIMP的底物和作用具有多效性，但心肌MMP和TIMP的改变对ECM有可预测的影响(Spinale，FG.2002；Chapman RE，et al.2004)。例如，MMP-2(一种明胶酶)可降解基底膜蛋白、纤维胶原肽和新合成的胶原纤维。在本研究中，高血压性LVH患者中的MMP-2显著降低。MMP-9(一种明胶酶)与MMP-2具有结构相同的蛋白底物，但MMP-9活性水平低得多。然而，MMP-9可显著影响重要的生物活性蛋白/肽(例如TGF-)以及其他“促纤维变性”蛋白和途径。可预期，通过增加的MMP-9来激活促纤维通路会增加ECM累积。因此，本研究中LVH患者的MMP2水平降低和MMP-9水平升高可能是一个促进在高血压性心脏病中所观察到的结构和功能改变的因素。
MMP-13是一种在血浆中水平极低的胶原酶，即使是用高灵敏测定法也难以对其精确定量。因此，本研究中并不以定量值报告MMP-13，而是将结果分为两类。LVH患者血浆中的可检测的MMP-13水平显著下降，在患有CHF和LVH的患者中，该水平进一步下降。该胶原酶的减少被预计会导致纤维胶原周转减少、降解减少并且ECM累积增加。
可在多个水平上调节MMP活性，不仅包括转录调节，还包括翻译后修饰，例如TIMP结合。TIMP与活性MMP以1:1的关系结合，抑制MMP酶活性并由此构成净ECM蛋白水解活性的一个重要控制点(Spinale，FG.2002；Chapman RE，et al.2004；Brew K，et al.2000)。本研究表明，具有LVH和CHF的患者的TIMP-1血浆水平升高。所以，向有助于ECM蛋白水解活性降低的方向改变MMP和TIMP间的平衡，由此促进了ECM累积。有四种已知的TIMP，这些分子的转录调节并不一致(Brew K，et al.2000)。在动物心力衰竭模型和心肌疾病患者中已观察到各TIMP的水平不一致(Wilson EM，et al.2002；Stroud RE.2005)。在本研究中，观察到有CHF的LVH患者的TIMP-1稳定升高。相比之下，在有CHF或无CHF的LVH患者中均仅观察到TIMP-2的少量增加。这些观测结果可能突出了LV重构过程中各TIMP的不同功能和调节途径。本研究的一个独特发现是，一种特定类型的TIMP即TIMP-1与CHF的发生密切相关。对于患有CHF和LVH的患者，还不清楚TIMP-1增加是否促进CHF的发生或者是否是发生CHF的结果。然而，已清楚，TMMP-1唯独在有LVH和CHF的患者中升高，血浆TIMP-1数值>1200ng/ml预示了存在CHF。因此，应在开发射血分数正常的心力衰竭(舒张期心力衰竭)的诊断标准中，以及在设计用于舒张期心力衰竭的新治疗处理方案中，考虑该血浆分析物。然而，应认识到，TIMP-1＝1200ng/ml这一分界值是以经验方式(post-poc)选定，而不是以前瞻方式选定。因此，对该预测值的有效性应适当谨慎地予以解释，并用其他使用大型前瞻性系列研究设计的研究来证实。
高血压性心脏病患者中发生的MMP/TIMP的改变可影响细胞外和心肌细胞区室的生长调节，从而一起导致同心性LV肥大和胶原含量增加。胶原稳态是由合成、翻译后修饰和降解间的平衡确定。对于高血压性心脏病，Diez等人和其他人已证明，胶原含量升高与胶原合成的血浆标记物增加、胶原降解减少以及胶原周转减少有关(Diez J，et al.2002；Lopez B，etal.2001a；Lopez B，et al.2001b)。本研究中发现的MMP/TIMP谱的改变公开了可能改变合成、降解和周转的潜在机制。
虽然LV结构重构有许多决定因素，血压是其中最为重要的一种因素。然而，本研究的数据表明，即使血压已被充分控制，MMP和TIMP的持续性改变预示了、可能决定了长期的同心性重构、LVH和舒张期心力衰竭并且确定与长期的同心性重构、LVH和舒张期心力衰竭相关。LVH的消退需要适当的ECM重构，包括ECM成分(特别是基底膜蛋白)的降解和周转以及心肌细胞-基质间相互作用的改变。本研究表明，高血压性LVH患者的特定MMP(MMP-2减少)和TIMP(TIMP-1增加)谱持续异常(MMP-2减少，TIMP-1增加)，预计这会利于心肌细胞-基底膜-基质的持续连接，而不利于为使LV质量恢复所需的ECM周转。因此，看起来在本研究观察到的MMP和TIMP的持续性改变可能促进了存在于高血压性心脏病中的表型和结构改变。
本研究以MMP和TIMP的血浆水平作为反映上述酶和肽的心肌水平变化的代表性标志。MMP激活和TIMP结合是发生在心肌间质中的区室化过程(Spinale，FG.2002；Chapman RE，et al.2004)。因此，血浆水平并不必然反映出现在心肌中的净ECM蛋白水解活性。本研究中观察到的参比对照和高血压性心脏病患者间的MMP和TIMP血浆水平间的差异可能反映心肌水平的差异(Joffs C，et al.2001；Yarbrough WM，et al.2003；Lindsey ML，et al.2003)。LVH患者中心肌可能不是MMP和TIMP的唯一来源。因此，血浆MMP和TIMP水平的测量值代表了从心脏以及非心脏来源释放的MMP和TIMP的总和。然而，本研究中使用的特定排除标准有助于消除MMP和TIMP的主要非心肌来源的明显变化。然而，需认识到，存在或不存在慢性心力衰竭的LVH高血压患者的其他非心脏组织(例如肾和脉管系统)中的变化可能有助于MMP和TIMP向血浆释放。本研究的发现证明了参比对照和LVH患者之间血浆MMP和TIMP水平的差异。
结论ECM蛋白水解系统的特定改变模式与高血压性心脏病的每种结构、功能和/或临床表现相关。血压被充分控制且左心室无结构或功能改变的受试者的MMP/TIMP指标无任何变化。但LVH患者即使血压被充分控制也表现出MMP-2和MMP-13降低。TIMP-1增加出现在患有LVH和CHF的患者中。具体而言，高血压性LVH和CHF的发生之间的转变可由MMP和TIMP的变化——例如TIMP-1>1200ng/ml或者不存在MMP-13——预测。但本研究中样本大小有限，采用的是横向设计，并且未进行长期系列研究。这些局限性使得需要利用大型的前瞻性系列研究涉及对我们的观察结果进一步检验和确证。然而，本研究的数据证明，观察到的MMP/TIMP随机改变在高血压性心脏病表现中具有重要作用。对于该ECM依赖性病理生理学的理解有助于改善对高血压性心脏病患者的诊断和治疗。
临床论点慢性高动脉压是导致LV同心性肥大、弛豫率降低和硬度增加的常见原因。高血压所致的结构和功能的改变是由于心肌的主要成分——心肌细胞的改变以及特别是由于细胞外基质(ECM)的改变而导致。这些LV结构和功能改变产生了发生舒张期心力衰竭(DHF)所必需的底物。然而，还不清楚ECM的这些变化受何种因素控制、单纯的控制血压可否防止或逆转这些变化，也不清楚对ECM控制机制的认识是否有助于高血压心脏病的诊断或治疗。本研究证明，特定的ECM蛋白水解蛋白/肽(MMP和TIMP)模式的改变与高血压性心脏病的每种结构、功能和临床表现有关。血压被充分控制且无LV结构或功能改变的受试者的MMP/TIMP指标无任何改变。因此，对高血压的治疗可防止ECM和ECM蛋白水解系统的改变。然而，具有残余LVH或抗性LVH的患者的血压尽管被充分控制，他们的MMP仍异常。TIMP-1>1200ng/ml的增加预示了DHF的发生。这些数据表明，LVH的消退以及DHF的预防不仅仅单纯取决于血压的改变，可能需要找准MMP/TIMP变化并将该变化正常化。对于该ECM依赖性病理生理学的理解有助于改善对高血压患者的诊断和治疗。
2.实施例2基质金属蛋白酶/金属蛋白酶组织抑制剂基质组分的蛋白水解因子的改变与高血压心脏病的结构、功能和临床表现间的关系 方法 研究准入表6示出了本研究准入情况。排除标准为心肌梗塞病史、心肌病、瓣膜或室壁运动异常、心律失常、浸润性心脏病、EF<50％、未控制的高血压(SBP>140或DBP>90)或者影响MMP/TIMP血浆谱的全身性疾病。对照和HTN对照的准入标准为未显示出结构性心血管疾病的年龄在18-90岁的男性和女性。LVH和有CHF的LVH的准入标准为有超声心动图确证的LV肥大(室壁厚度>1.2cm或者LV质量指数>125g/m2)、年龄在18-90岁的男性和女性。
表6研究准入
超声心动图测量使用维度超声心动图标准。
超声心动图计算用圆盘法计算LV容积。用Penn法计算LV质量。PCWP通过2+1.3×(E/Ea)计算。
MMP/TIMP血浆测量通过酶联免疫吸附测定(ELISA)(AmmershamPharmacia Biotech)获得明胶酶MMP-2和MMP-9、胶原酶MMP-13以及TIMP类的TIMP-1和TIMP-2的血浆测量值。
结果 图7-11示出了研究结果。
结论 LV结构和功能正常的HTN患者具有正常的MMP/TIMP谱。倾向于减少ECM降解的MMP/TIMP谱的改变与LV肥大和舒张期功能障碍相关。TIMP-1的增加预示了CHF的存在。可使用选定的MMP和TIMP的血浆测定法测量心肌细胞外基质蛋白水解系统的变化。高血压心脏病的每种表现都与ECM蛋白水解系统的特定改变模式相关。具有结构重构、舒张期功能障碍和/或临床CHF的高血压患者的特征是MMP减少和TIMP增加。
3.实施例4区分、预测和诊断高血压患者的心力衰竭的标准 表7中提供了在所述年龄范围内和跨性别的人类受试者的正常值的明确列表。如本发明所包含的MMP/TIMP正常参照值的编撰列表在以前并未提供过，并且由于包含无心血管疾病的年龄匹配的受试者，表7还提供了正常参比范围。而且，提供了MMP/TIMP谱的新的化学计量比值，可证明该谱涵盖了下表详述的重要诊断和预后信息。从100多名受试者中收集这些数据并加以分析。
表7正常人类*参比范围
*正常成人年龄25-70岁 表8给出了被诊断有高血压但血压被良好控制的患者的MMP和TIMP绝对值、MMP/TIMP比值绝对值以及相对于基于绝对值的正常参比值的变化百分比。按照原始申请中所述，收集这些数值。证实了一种独特的血浆谱，该谱无法从从前的动物研究报告或以前公开的有限临床研究中预测得出。该独特谱包括MMP-2下降、MMP-9无变化、MMP-13检测不到(低于任何目前使用的测定系统的灵敏度)，以及TIMP-1水平稳定上升。而且，可证明心血管特异性标记物TIMP-4增加。MMP和TIMP谱的这些变化是高血压患者特有的，并且证实了在这些患者的心脏组织内发生的早期改变。这种独特、特异的谱可用于指导治疗，以将相对于正常受试者的MMP和TIMP谱变化减至最小。而且，这些血浆谱可用于全面筛选处于危险中的患者群体，并识别出具有未来发生不良事件的风险的患者。
表8高血压性心脏病的诊断
*被诊断有高血压并经适当医疗处理的患者 表9示出了患有高血压性心脏病继发心力衰竭的患者中出现的MMP和TIMP的血浆谱。这些数据取自原始申请中提供的研究。该既往研究表明，可通过MMP-13信号的消失、TIMP-1的稳定增加来判断高血压患者是否存在心力衰竭。实际上，先前已经提供用于预测和诊断心力衰竭的受试者工作特征曲线(ROC)。与患有心肌梗塞(心脏病发作)继发心力衰竭的患者显著不同的是，MMP-9水平正常或者低于正常。可以对这两种疾病状态予以区分，下表中给出该区分结果。而且，通过使用心血管特异性标记物TIMP-4，证明了高血压性心脏病患者的TIMP-4增加，并且为所述以前从未被证明的血浆谱提供了心血管特异性。这些数据提供了首个用于通过血浆标记物识别具有高血压性心脏病所致的心力衰竭的患者的鉴别谱。这是一个重要的问题，因为根据心力衰竭的根本病因不同，治疗方式会有差异。原始申请中已提供了关于如何将这些数据用于指导治疗和临床决策的内容。
表9心力衰竭风险增加的高血压患者*
*被诊断有高血压并经适当医疗处理的患者 由本申请中开发出的并在支持材料中显示出的独特血浆特征，首次提供了区分心力衰竭患者的根本病因的能力。具体而言，如表10所示，具有发生心力衰竭风险的患者，或表现出心肌梗塞继发心力衰竭的患者，或者高血压继发心力衰竭的患者中出现了独特且非常不同的血浆谱。这些数据取自我们所完成的构成本申请基础的研究。因此，对这些谱进行鉴别诊断，更重要的是，可考虑到更具有针对性的临床决策和治疗策略。该谱的临床应用的实例，以及如何利用这些谱进行临床决策的内容在原始申请中已给出。
表10收缩期(MI后)或舒张期(高血压性心脏病)心力衰竭的鉴别诊断*
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权利要求
1.一种预测受试者舒张期心力衰竭的方法，包括测量所述受试者体液中MMP-13的量，量小于10ng/mL时就表明存在舒张期心力衰竭或者预示心力衰竭。
2.一种预测受试者舒张期心力衰竭的方法，包括检测到所述受试者体液中TIMP-1的量高于正常值。
3.权利要求2的方法，其中MMP-2的量比正常值至少高约20％。
4.一种预测受试者舒张期心力衰竭的方法，包括检测到所述受试者体液中TIMP-4的量高于正常值。
5.权利要求4的方法，其中所述TIMP-4的量比正常值至少高约50％。
6.一种预测受试者舒张期心力衰竭的方法，包括测量所述受试者体液中MMP-13、TIMP-1和TIMP-4的量。
7.权利要求6的方法，其中所述MMP-13的量检测不到，所述TIMP-1的量比正常值至少高约50％，并且TIMP-4的量比正常值至少高约50％。
8.一种预测受试者舒张期心力衰竭的方法，包括测量所述受试者体液中MMP-13、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4的量。
9.权利要求8的方法，其中所述MMP-13的量检测不到，所述TIMP-1的量比正常值至少高约50％，所述TIMP-2的量比正常值至少高约50％，并且TIMP-4的量比正常值至少高约50％。
10.一种预测受试者舒张期心力衰竭的方法，包括测量所述受试者体液中MMP-13、TIMP-1、TIMP-4和MMP-2的量。
11.权利要求10的方法，其中所述MMP-13的量检测不到，所述TIMP-1的量比正常值至少高约50％，所述TIMP-4的量比正常值至少高约50％，并且MMP-2的量比正常值至少高约20％。
12.一种预测受试者舒张期心力衰竭的方法，包括检测到所述受试者体液中MMP-9与TIMP-1的比值比正常比值低。
13.权利要求12的方法，其中所述比值比正常比值至少低约50％。
14.一种预测受试者舒张期心力衰竭的方法，包括检测到所述受试者体液中MMP-9与TIMP-2的比值比正常比值低。
15.权利要求14的方法，其中所述比值比正常比值至少低约50％。
16.一种预测受试者舒张期心力衰竭的方法，包括检测到所述受试者体液中MMP-9与TIMP-4的比值比正常比值低。
17.权利要求16的方法，其中所述比值比正常比值至少低约50％。
18.权利要求1-17任一项的方法，其中所述体液为血液。
19.权利要求1-17任一项的方法，其中所述体液为血浆。
全文摘要
本文公开了检测和预测舒张期心力衰竭以及预测充血性心力衰竭的方法，该方法包括蛋白酶和蛋白酶抑制剂分析。
文档编号C12Q1/37GK101490273SQ200780025921
公开日2009年7月22日 申请日期2007年4月24日 优先权日2006年5月9日
发明者F·G·斯皮纳尔, R·E·斯特劳德, M·R·齐利 申请人:南卡罗来纳州医科大学研究发展基金会