脂肪酶活性的恢复方法

专利名称：脂肪酶活性的恢复方法
技术领域：
本发明涉及使特定的固定化脂肪酶或脂肪酶粉末组合物的 各种酯化能力和酯交换能力等脂肪酶活性恢复的方法和使用恢 复的固定化脂肪酶或脂肪酶粉末组合物的酯化反应、油脂的酯 交换方法等。
背景技术：
脂肪酶被广泛使用于脂肪酸等各种羧酸与一元醇或多元醇 等醇类的酯化反应、多个羧酸酯间的酯交换反应等中。其中， 酯交换反应以动植物油脂类的改质为首，作为各种脂肪酸的酯、 糖酯或类固醇的制造方法，是十分重要的技术。若使用作为油 脂水解酶的脂肪酶作为这些反应的催化剂，则可以在室温至约
70。C左右的温和条件下进行酯交换反应，与以往的化学反应相 比，不仅可抑制副反应并减少能量成本，而且由于作为催化剂 的脂肪酶是天然物质，因此安全性高。而且，根据其底物特异 性和位置特异性，可以有效生产目标产物。然而，一^:而言， 在酯交换反应中直接使用脂肪酶粉末，不仅无法充分表现活性， 而且要使原本水溶性的脂肪酶均匀地分散于油性原料中十分困 难，其回收也困难。因此，以往一般是通过将脂肪酶固定在某 些载体例如阴离子交换树脂(专利文献l )、酚醛型吸附树脂(专 利文献2)、疏水性载体(专利文献3)、阳离子交换树脂(专利 文献4)、螯合树脂(专利文献5)等上，再用于酯化或酯交换反 应等中。
但是，由于一旦将脂肪酶固定在载体上，脂肪酶活性就会 降低，因此正逐步开发采用脂肪酶粉末的各种技术。具体而言，提出了在惰性有机溶剂的存在下或非存在下， 为了使酯交换反应时分散脂肪酶粉末颗粒的90%以上保持在
1 ~ 100pm的粒径范围，将脂肪酶粉末分散于含有酯的原料中， 进行酯交换反应的方法(专利文献6)。另外，还提出了采用通 过干燥含有磷脂和脂溶性维生素的酶溶液而获得的酶粉末(专 利文献7 )。
另一方面，由于作为酶的脂肪酶价格昂贵，因此在反应结 束后进行回收，再重复使用，在脂肪酶活性降至很低后才废弃。 但是，如果可以使降低的脂肪酶活性得以恢复，脂肪酶的使用 效率显著提高，从工业的观点看来，期待开发出使脂肪酶活性 恢复的有效方法。
曰本净争开昭60 — 98984号/>才艮 曰本特开昭61 — 202688号/>才艮 日本特开平2 - 138986号公报 日本特开平3 - 61485号公报 日本特开平1 - 262795号公报 曰本特许第2668187号公净艮 曰本净争开2000 _ 106873号^^才艮
专利文献l: 专利文献2 专利文献3 专利文献4 专利文献5 专利文献6 专利文献
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以使已经降低的脂肪酶活性 恢复的方法。
本发明的目的还在于提供一种酯化方法和酯交换方法，其 采用具有已经恢复的脂肪酶活性的固定化脂肪酶或脂肪酶粉末 组合物。
本发明是基于以下认识而进行的对于特定的固定化脂肪 酶或同时使用该固定化脂肪酶的粉碎物与助滤剂的脂肪酶粉末
5组合物，将脂肪酶活性已经降低的酶用三酰甘油清洗，则可以 恢复初始的脂肪酶活性。
也就是说，本发明提供一种脂肪酶活性的恢复方法，其特 征在于，在酯化反应或酯交换反应中使用固定于载体上的嗜热 真菌属来源的脂肪酶、或含有固定于载体上的嗜热真菌属来源
的脂肪酶的平均粒径为lpm以上、不到300(im的4分碎品和助 滤剂的脂肪酶粉末组合物后，用三酰甘油清洗。
本发明还提供了一种酯化反应或酯交换反应方法，其特征 在于，在酯化反应或酯交换反应中使用固定于载体上的嗜热真 菌属来源的脂肪酶、或含有固定于载体上的嗜热真菌属来源的 脂肪酶的平均粒径为1 pm以上、不到300pm的粉碎品和助滤剂 的脂肪酶粉末组合物后，将其从反应系中分离，用三酰甘油清 洗使脂肪酶活性恢复后，使用该固定化脂肪酶或脂肪酶粉末组 合物进行酯化反应或酯交换反应。


图1表示使用脂肪酶粉末组合物进行酯交换反应时，酯交 换活性随着时间的降低(实施例1 (3))。
图2表示通过对酯交换活性已经降低的脂肪酶粉末组合物 进行本发明的清洗，酯交换活性恢复(实施例1 (4))。
图3表示通过对酯交换活性已经降低的固定化脂肪酶进行 本发明的清洗，酯交换活性恢复(实施例3 (3-2))。
具体实施例方式
本发明中使用的脂肪酶来源于嗜热真菌属(7Tzwwomj;cw W.),是固定在载体、优选固定在二氧化硅载体上的脂肪酶。 本发明中可以直接使用这种脂肪酶，或者使用将该脂肪酶粉碎
6成平均粒径在lpm以上、不到300fim的粉碎品。这其中，优选 固定在二氧化硅载体上的这种脂肪酶的平均粒径在300 ~ lOOO[im左右。这种固定化脂肪酶可以从例如Novozymes A/S公 司作为Lipozyme TL-IM购买。
在将这种固定化脂肪酶制成粉碎品时，可以采用通常的粉 碎机，将其粉碎成平均粒径在lpm以上、不到300pm,优选平 均粒径为l 200nm，更优选平均粒径为1 ~ lOOpm,尤为优选 平均粒径为20 ~ 100fim。这其中，粉碎机可以例举研钵、剪切 摩擦式粉碎机、刀式粉碎机、石磨(研磨微粒化机 MYCOLLOIDER、 MASCOLLOIDER )、咖啡研磨机(coffee mill)、动力磨(power mill )、钢针研磨机、冲击式粉碎机(锤 式粉碎机、球磨机)、辊式粉碎机和气流式粉碎机、均化器、超 声波破碎机等。
本发明中作为对象的脂肪酶为上述粉碎品时，优选与助滤 剂组合使用。作为助滤剂，可以例举硅藻土等无机助滤剂和纤 维素等纤维和其粉碎物等有机助滤剂。这其中优选有机助滤剂，
尤为优选有机高分子助滤剂，尤其优选纤维素等，作为优选例 子，可以例举由Nippon Paper Chemicals Co., Ltd以商品名KC Flock出售的产品等。助滤剂也优选为粉状，优选平均粒径在 10 ~ 90,。
上述脂肪酶粉碎品和助滤剂的质量比优选为1/10~ 10/1， 尤为优选为1/7~ 2/1。
本发明中使用的上述固定化脂肪酶、脂肪酶粉末组合物可 以直接在油脂的酯交换反应、酯化反应中使用，可以通过使之 与长链脂肪酸甘油三酯和中链脂肪酸甘油三酯相接触，然后提 取，从而进行纯化，与此同时可以使脂肪酶活性提高。
作为这里使用的长链脂肪酸甘油三酯和中链脂肪酸甘油三酶和脂肪酶粉末组合物的清洗 项目中所记载的物质。
长链脂肪酸甘油三酯和中链脂肪酸甘油三酯优选按95: 5~ 50: 50的质量比使用，优选相对于脂肪酶的总质量，接触2 倍~ 100倍质量的甘油三酯。
作为使用上述固定化脂肪酶、脂肪酶粉末组合物的酯化反 应，优选在该固定化脂肪酶、脂肪酶粉末组合物的存在下进行 油脂的酯化反应，然后回收固定化脂肪酶、脂肪酶粉末组合物， 进行再利用。
尤其是，上述脂肪酶粉末组合物由于其脂肪酶活性提高， 而且在酯化反应和酯交换反应中易用性(操作性)提高，通过 再循环可以在这些反应中使用，因此能够适当用于以工业规模 通过油脂的酯交换等进行的油脂的改质。
但是，将这种脂肪酶粉末组合物、固定化脂肪酶在酯化反 应或酯交换反应中再利用若干次的话，随着使用次数，酯化能 力和酯交换能力等脂肪酶活性将下降。
本发明以特定条件清洗这种脂肪酶活性已经降低的固定化 脂肪酶或脂肪酶粉末组合物，脂肪酶活性恢复，而且，就上述 脂肪酶粉末组合物而言，可以长期连续利用其提高的脂肪酶活 性和易用性(操作性)。
本发明中作为对象的固定化脂肪酶、脂肪酶活性已经降低 的脂肪酶粉末组合物，可以以相对于初始活性稍有降低者为对 象，但从工业的观点看来，优选以活性降低为初始活性(100 % )的70~ 50%者为对象。
其中，作为用于清洗固定化脂肪酶或脂肪酶粉末组合物的 三酰甘油，优选在室温下为液态。尤其优选使用用于纯化上述 脂肪酶粉末组合物的长链脂肪酸甘油三酯和中链脂肪酸甘油三
8酯的混合物。
作为这里使用的长链脂肪酸甘油三酯，优选构成脂肪酸的
碳原子数为14-24的甘油三酯，尤为优选选自于菜籽油、大豆 油、葵花油、红花油、玉米油所组成的组中的^L物油。
作为中链脂肪酸甘油三酯，优选构成脂肪酸的碳原子数为 6-12的甘油三酯。这种脂肪酸甘油三酯可以用公知的制法制 造，也可以使用市售品。作为市售品，例如由日清奥利友集团 抹式会社以商品名ODO出售。
长链脂肪酸甘油三酯和中链脂肪酸甘油三酯优选按95: 5 ~ 50: 50的质量比使用，优选相对于脂肪酶的总质量，接触2 倍 100倍、更优选5 ~ 50倍的质量的甘油三酯。
尤其是，作为清洗时使用的三酰甘油，优选为用于进行酯 交换的原料油。
优选使固定化脂肪酶或脂肪酶粉末组合物中的脂肪酶与上 述三酰甘油充分接触来进行清洗，具体而言，优选通过以下方 式来进行通过在三酰甘油中搅拌用于酯化反应或酯交换反应 后的固定化脂肪酶或脂肪酶粉末组合物，使之分散，然后从三 酰甘油中分离。
接触具体而言即搅拌，优选在10 45。C、尤为优选在室温 下，优选进行2小时以上、更优选10小时以上、尤为优选12 小时 48小时。另外，根据要求还可以进行48小时以上。
用于进行搅拌的搅拌机没有特别限定，但优选叶片式搅拌 机、磁力搅拌机、三一搅拌机(Threeone motor )等。
这样一来，使固定化脂肪酶或脂肪酶粉末组合物中的脂肪 酶与三酰甘油充分4妄触后，根据常^L方法进行过滤，从三酰甘 油中分离固定化脂肪酶或脂肪酶粉末组合物，再次在酯化或酯 交换反应中4吏用。
9发明的效果
根据本发明，对于由于在各种反应中使用而脂肪酶活性降 低的脂肪酶，迄今为止都是将其废弃，而通过本发明的方法可 以使脂肪酶活性恢复，因此可以延长脂肪酶的4吏用寿命，可以 使采用脂肪酶而制造的制品成本降低，因此本发明从工业的观 点来看有很大的优点。
接着，通过实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1
(1 ) 采用Hosokawa Micron Corporation生产的钢针研磨 才几(Fine impact mill 100 UPZ )将1Kg的Novozymes A/S 7〉司 生产的Lipozyme TL-IM (平均粒径800pm)以17600rpm进行 粉碎。用堀场制作所公司生产的粒度分布计LA-500测定粉碎 的脂肪酶粒径，其平均粒径为13.8pm。在该粉末中加入lkg作 为助滤剂的纤维素粉末(Nippon Paper Chemicals Co., Ltd:平 均粒径30pm),制成脂肪酶粉末组合物。
(2)对5g这样获得的脂肪酶组合物加入90g菜籽脱色油 和lOgODO(日清奥利友集团抹式会社公司生产中链脂肪酸甘 油三酯)，于室温下搅拌24小时后，过滤回收脂肪酶组合物。 用下述方法测定该脂肪酶组合物的酯交换活性，在以粉碎前的 Lipozyme TL-IM的活性为IOO时，其相对活性为714。 脂肪酶活性的测定方法
在油酸甘油酯和辛酸甘油酯按1: 1 (w)的比例混合而成 的油中添加脂肪酶组合物，然后于60。C下反应。随时间取样 lO[il，用1.5ml己烷稀释后，将过滤脂肪酶组合物的溶液作为 气相色谱(GC)用试样。通过GC(柱DB-lht)进行分析， 用下式求出反应率。GC条件为柱温初始150°C、升温15°C/ 分、最终370°C。
10反应率(％ ) = (C34area/ ( C24area+C34area ) }xlOO 式中，C24表示辛酸甘油酯，C34表示辛酸甘油酯的l个 脂肪酸:帔油酸:f又^后的物质，area为它们的面积。基于各时间 的反应率，用分析软件(origin ver.6.1)求出反应速度常数k值。
脂肪酶活性用以Lipozyme TL-IM的k值作为100时的相 对活性来表示。
(3 )在85g菜籽脱色油(日清奥利友集团林式会社公司生 产)和15gODO (日清奥利友集团林式会社公司生产)中添加 上述(2)获得的脂肪酶组合物1质量％ ,于6(TC搅拌19小时 进行酯交换反应。求出随时间的酯交换率，确认反应的进行。 此外，酯交换反应使用气相色傳分析甘油酯组成，通过计算求 出测定试样中的酯交换反应物的比率。
反应后过滤回收脂肪酶组合物，将该回收的脂肪酶组合物 重复用于酯交换反应中。重复进行数次反应，通过相对比例确 认反应率的变化，并示于图1中。
根据图1所示的结果，可知合计反应时间达到约82小时时， 脂肪酶组合物的脂肪酶活性降低到约60%。
(4)过滤回收上述(3)中相对活性已经降低到约60%的 脂肪酶组合物，在该回收的脂肪酶组合物中，添加18g菜籽脱色 油(日清奥利友集团抹式会社公司生产)和2gODO (日清奥利 友集团抹式会社公司生产)，于室温下用磁力搅拌机搅拌24小 时。通过过滤回收脂肪酶组合物后，再与上述(3)同样重复进 行酯交换反应。通过相对比例确认反应率的变化，结果示于图2 中。
根据图2所示的结果，可知通过对活性已经降低的脂肪酶 组合物进行搅拌清洗，脂肪酶活性恢复到当初的100%,脂肪酶组合物能够再利用若干次。 实施例2
(2-1 )对于5g实施例1的(1 )中获得的脂肪酶组合物添 加90g菜籽脱色油和10g ODO (日清奥利友集团抹式会社公司 生产)，于60。C搅拌2小时后，过滤回收脂肪酶组合物。用与 实施例1同样的方法测定该脂肪酶组合物的酯交换活性，其相 对活性为557。
(2-2)在100g大豆油和25g大豆极度硬化油(横关油脂 工业(抹)公司生产)中添加上述(2-1)中获得的脂肪酶组合 物1.2质量％,于7(TC下反应120小时后，通过过滤回收脂肪 酶组合物。与实施例1同样对回收的脂肪酶组合物中的一部分 测定其脂肪酶活性(2-2a)。使先前回收的脂肪酶組合物分散于 丙酮中，过滤后，再回收其滤渣，分散于50g菜籽脱色油ODO
(日清奥利友集团抹式会社公司生产)=9: 1 (w)的混合油 中后，于室温下通过过滤进行清洗、置换，回收脂肪酶组合物。 用与实施例1同样的方法测定该脂肪酶组合物的酯交换活性
(2-2b),得到的活性以相对值示于表1。
表l
单位质量脂肪酶制剂的
相对酯交换活性
粉碎前 (TL-IM)100
(2-1)557
(2-2a)11
(2-2b)200
实施例3
在85g菜籽脱色油(日清奥利友集团抹式会社公司生产) 和15gODO (日清奥利友集团抹式会社公司生产)中添加5质 量％的Lipozyme TL-IM (固定化脂肪酶Novozymes A/S ^>司 生产)，于60。C搅拌19小时，进行酯交换反应。求出随时间的酯交换率，确认反应的进行。另外，酯交换反应使用气相色谱 分析甘油酯组成，通过计算求出测定试样中的酯交换反应物的 比率。
过滤回收反应后的上述固定化脂肪酶，将该回收的固定化 脂肪酶重复用于酯交换反应中。重复进行数次反应，通过相对 比例确认反应率的变化，并示于图3(3-l)。
过滤回收相对活性已经降低到60 %左右的上述固定化脂 肪酶，在该回收的固定化脂肪酶中添加18g菜籽脱色油(日清 奥利友集团抹式会社公司生产)和2gODO (日清奥利友集团 林式会社公司生产)，于室温下搅拌24小时。通过过滤回收固 定化脂肪酶后，再重复进行上述操作(3-1 ),进行酯交换反应。 通过相对比例确认反应率随时间的变化，并示于图3 (3-2)。
权利要求
1. 一种脂肪酶活性的恢复方法，其特征在于，在酯化反应或酯交换反应中使用固定于载体上的嗜热真菌属来源的脂肪酶、或含有固定于载体上的嗜热真菌属来源的脂肪酶的平均粒径为1μm以上、不到300μm的粉碎品和助滤剂的脂肪酶粉末组合物后，用三酰甘油清洗。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，三酰甘油在室温下 为液态。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，三酰甘油含有中链 脂肪酸甘油三酯。
4. 根据权利要求1~3中任一项所述的方法，其中，三酰 甘油为用于酯交换的原料油。
5. 根据权利要求1 ~ 4中任一项所述的方法，其中，在三 酰甘油中搅拌用于酯化反应或酯交换反应后的固定化脂肪酶或 脂肪酶粉末组合物，使之分散，然后从三酰甘油中分离，由此 进行清洗。
6. 才艮据^l利要求1~5中任一项所述的方法， 为二氧化硅。
7. 根据权利要求1~6中任一项所述的方法， 品的平均粒径为1 ~ 200jim。
8. 才艮据^l利要求1~7中任一项所述的方法， 剂为纤维素。
9. 才艮据计又利要求1~8中任一项所述的方法， 剂为平均粒径10 ~ 90|^im的4分状。
10. —种酯化反应或酯交换反应方法，其特征在于，在酯 化反应或酯交换反应中使用固定于载体上的嗜热真菌属来源的 脂肪酶、或含有固定于载体上的嗜热真菌属来源的脂肪酶的平 均粒径为l(im以上、不到300pm的賴^争品和助滤剂的脂肪酶其中，载体 其中，粉碎 其中，助滤 其中，助滤粉末组合物后，将其从反应系中分离，用三酰甘油清洗而使脂 肪酶活性恢复后，使用该固定化脂肪酶或脂肪酶粉末组合物进 行酯4^反应或酯交纟灸反应。
全文摘要
一种脂肪酶活性的恢复方法，其包括在酯化反应或酯交换反应中使用固定于载体上的嗜热真菌属(Thermomyces)来源的脂肪酶、或含有固定于载体上的嗜热真菌属来源的脂肪酶的平均粒径为1μm以上、不到300μm的粉碎品和助滤剂的脂肪酶粉末组合物后，用三酰甘油清洗。通过该方法，能够有效地使已经降低的脂肪酶活性恢复。
文档编号C12N9/20GK101490254SQ20078002602
公开日2009年7月22日 申请日期2007年5月11日 优先权日2006年5月11日
发明者山内良枝, 根岸聪, 铃木顺子 申请人:日清奥利友集团株式会社