增加细菌内多肽表达的修饰的分泌系统的制作方法

专利名称：增加细菌内多肽表达的修饰的分泌系统的制作方法
技术领域：
本发明提供了改变宿主细胞中所需多肽产量的方法。特别的，本发明 提供了编码截短的SecG蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质能够有利于细菌 宿主细胞(例如芽胞杆菌属物种)对所需蛋白酶的分泌，以及含有所述多 核苷酸的表达载体和宿主细胞。
背景
革兰氏阳性;微生物，例如芽胞杆菌属的成员，部分由于其可以将它们 发酵产物分泌到培养基中的能力，而可用于大规模的工业发酵。分泌蛋白 质跨过细胞膜和细胞壁输出，然后释放到外部培养基中。多肽向周质空间 或培养基中的分泌是工业发酵中需要认真考虑的重要课题。
微生物对异源多肽的分泌是工业中普遍使用的技术。典型的，可以用 编码目标异源多肽的核酸转化细胞。然后，这些转化的细胞可以表达目标
异源多肽，从而大量的分泌多肽。该技术可用于生产比天然生成的多肽多 得多的大量多肽。上ii^达的多肽具有多种工业应用，包括治疗性和农业 用途，以及在食品、化妆品、清洁组合物、动物饲料等中的用途。本领域 需要提供能够分泌异源多肽的宿主。
发明概述
本发明提供了改变宿主细胞内所需多肽的产量的方法。特别地，本发明提供了编码截短的SecG蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质能够有利于细 菌宿主细胞(例如芽胞杆菌属物种)对所需蛋白酶的分泌，以及含有所述 多核苷酸的表达载体和宿主细胞。
本发明至少部分的基于这样的发现，所述发现是异源多肽在细菌多肽 分泌系统内的分泌涉及一些蛋白质，可以修饰这些蛋白质并且仍然保持其 功能，例如，可以截短、突变或缺失一些蛋白质，且仍然保持或者甚至增 加了它们有利于多肽分泌的能力。因此，本发明教导的内M供了能够有 利于细菌宿主系统分泌所需多肽的多肽，包括该多肽的编码多核苷酸。此 外，本发明教导的内容还提供了在细菌系统中利用这些多肽来产生异源多 肽的方法。
在一个实施方案中，发明提供了分离的异源多肽，其编码异源的截短 SecG，其能够有利于细菌宿主细胞分泌所需多肽。在一些实施方案中，用 异源多核苷酸替换了细菌宿主细胞的内源性SecG的编码基因，在其它实 施方案中，异源多核苷酸补充了(complement)细菌宿主细胞的内源性SecG 的编码基因。在其它实施方案中，编码截短SecG的异源多肽与SEQ ID NO:ll的截短SecG具有至少约50%同 一性。在一些实施方案中，截短SecG 包括全长异源SecG的区域，在一些实施方案中，所述区域包括全长SecG 多肽的N-端前39个氨基酸。在其它一些实施方案中，截短SecG包括所述 SecG的第一个跨膜结构域。在另一个实施方案中，发明提供了编码异源的 截短SecG的分离的异源多核苷酸，所述异源截短SecG包括SEQ ID NO:l-9的SecG中任一个的前39个氮基酸，并能够有利于细菌宿主细胞 分泌所需多肽。在其它实施方案中，发明的SecG是细菌SecG。发明涵盖 了来自芽孢杆菌属物种或土芽孢杆菌属(G^k"7/"力的SecG蛋白。
在另一个实施方案中，发明提供了表达载体，所述栽体包含编码异源 的截短SecG的分离的异源多核苷酸，其能够有利于细菌宿主细胞分泌所 需多肽。
在另一个实施方案中，发明提供了编码异源的截短SecG的多肽，其 由分离的异源多核苷酸编码，并能够有利于细菌宿主细胞分泌所需多肽。另一个实施方案中，发明提供了在细菌宿主细胞中生产所需多肽的方
法，包括U)在所述细菌宿主细胞中表达异源SecG多肽，和(b)生产 所述所需多肽。在一个实施方案中，异源SecG由截短的基因编码，所述 基因替换了宿主细胞内的内源性SecG基因。在另一个实施方案中，异源 SecG由全长基因编码，所述全长基因替换了宿主细胞内的内源性SecG基 因。在另一个实施方案中，异源SecG是截短的多肽，包括选自SEQ ID NO:l-9的全长M酸序列的前39个氮基酸。在一些实施方案中，截短的 SecG只包含一个跨膜区域。在另一个实施方案中，发明提供了在细菌宿主 细胞中，生产与SEQIDNO:26的碱性丝氨酸蛋白酶至少80%同一的细菌 碱性丝氨酸蛋白酶的方法，包括(a)在所述细菌宿主细胞中表达异源SecG 多肽，和(b)生产细菌碱性丝氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，细菌宿主 细胞不表达内源性SecG蛋白，而在其它实施方案中，宿主细胞表达内源 性SecG。在其它实施方案中，与不表达异源性SecG的相应宿主细胞生产 的所需多肽的量相比，异源性SecG能够增加宿主细胞生产的所需多肽的 量。在一些实施方案中，发明提供了在细菌宿主细胞中生产所需多肽的方 法，包括(a)在所述细菌宿主细胞中表达异源SecG多肽，和(b)生产 所述所需多肽，还包括回收所述所需多肽。在一些实施方案中，所需多肽 和异源性SecG源自第一菌林，其中第一菌林不同于宿主细胞。在一些实 施方案中，第一菌林是克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)，宿主细胞是枯草 芽孢杆菌(B. subtilis)。在其它实施方案中，删除了所述宿主细胞内的内源 性SecG基因。在另一个实施方案中，发明提供了包含编码异源性SecG的 多核苷酸的细菌宿主细胞，其中，与不表达异源性SecG的相应宿主细胞 的所需多肽的分泌相比，异源性SecG能够增加宿主细胞对所需多肽的分 泌。在一个实施方案中，细菌宿主细胞是芽孢杆菌属的宿主细胞。在另一 个实施方案中，细菌宿主细胞是一枯草芽孢杆菌宿主细胞。在另一个实施方 案中，细菌宿主细胞分泌的所需蛋白质是酶。在一些实施方案中，酶是丝 氨酸蛋白酶。在其它实施方案中，所需多肽选自SEQIDNO:25-29、 36和 28的蛋白酶，或其变体。在一些实施方案中，宿主细胞的内源性SecG基因被删除。在其它实施方案中，所述细胞的内源性SecG基因由编码异源 SecG的异源secG基因补充。在其它实施方案中，由编码所述异源SecG 的异源secG基因替换了所述细胞的内源secG基因。在一些实施方案中， 异源SecG是截短的，而在其它实施方案中，异源SecG是全长SecG。 下文叙述了本发明教导内容的上述和其他特征。
附图简述
本领域技术人员可以理解，附图仅用于示例的目的。附图并非意在以 任何方式限制本发明教导内容的范围。


图1显示了与不包含截短的克劳氏芽孢杆菌secG基因的对照宿主细胞 (JS1009)中的Properase产量相比，枯草芽孢杆菌宿主细胞(JS1015 ) 的Properase产量的增加，其中编码克劳氏芽孢杆菌的截短SecG的多核苷 酸(SEQ ID NO:12 )被整合到枯草芽孢杆菌的染色体中，以补充内源的枯 草芽孢杆菌secG。
图2显示了大肠杆菌SecG的拓朴学模型(Satoh等人，Biochemistry 42:7434-7441 (2003))。
图3显示，来自克劳氏芽孢杆菌的截短SecG (SEQ ID NO:ll)对枯 草芽孢杆菌宿主细胞的蛋白酶V049 (也称为Puramax; SEQ ID NO:26 ) 产量的影响，在所述宿主细胞中截短的克劳氏芽孢杆菌secG基因替换了 (CF375)内源性枯草芽孢杆菌基因，或补充了所述内源基因(CF371); 以及全长克劳氏芽孢杆菌SecG (SEQ ID NO:10)对枯草芽孢杆菌宿主细 胞的蛋白酶V049产量的影响，在所述宿主细胞中全长的克劳氏芽孢杆菌 secG基因替换了 (CF379)内源性枯草芽孢杆菌基因，上述结果是与表达 V049的枯草芽孢杆菌宿主细胞的V049产量比较的，其中该宿主细胞不含 有截短的或全长的克劳氏芽孢杆菌secG基因(CF363 )。使用0.01% (v/v) 接种物来起始细胞生长。
图4显示，表达来自克劳氏芽孢杆菌的截短SecG (SEQIDNO:12) 对枯草芽孢杆菌宿主细胞的蛋白酶Properase ( SEQ ID NO:29 )产量的影响，在所述宿主细胞中截短的克劳氏芽孢杆菌secG基因替换了 (CF378)内源性枯草芽孢杆菌基因，或补充了所述内源基因(CF374);以及全长克劳氏芽孢杆菌SecG (SEQ ID NO:IO)对枯草芽孢杆菌宿主细胞的蛋白酶Properase产量的影响，在所述宿主细胞中全长的克劳氏芽孢杆菌secG基因替换了 (CF380)内源性枯草芽孢杆菌secG基因，上述结果是与表达Properase的枯草芽孢杆菌宿主细胞的Properase产量比较的，其中该宿主细胞不含有截短的或全长的克劳氏芽孢杆菌secG基因(CF381)。利用0.01% (V/V)接种物起始细胞生长。
图5显示，当用5%接种物起始细胞生长时，图3中描述的影响。
图6显示，来自克劳氏芽孢杆菌的截短SecG (SEQ ID NO:ll)对枯草芽孢杆菌宿主细胞的突变蛋白酶V049-E33Q产量的影响，在所述宿主细胞中截短的克劳氏芽孢杆菌secG基因替换了 (CF376)内源性枯草芽孢杆菌基因，或补充了所述内源基因(CF372 );上述结果是与表达V049-E33Q(CF365)和V049 ( CF363 )的枯草芽孢杆菌宿主细胞的V049-E33Q产量比较的，其中该宿主细胞不含有截短的克劳氏芽孢杆菌secG基因。
图7显示，来自克劳氏芽孢杆菌的截短SecG (SEQIDNO:ll)对枯草芽孢杆菌宿主细胞的突变蛋白酶V049-E33R产量的影响，在所述宿主细胞中截短的克劳氏芽孢杆菌secG基因替换了 (CF377)内源性枯草芽孢杆菌基因，或补充了所述内源基因(CF373);上述结果是与表达V049-E33R(CF366)和V049 ( CF363 )的枯草芽孢杆菌宿主细胞的V049-E33R产量比较的，其中该宿主细胞不含有截短的克劳氏芽孢杆菌secG基因。
图8显示，转化到枯草芽孢杆菌中的构建体的图，所述构建体用来自克劳氏芽孢杆菌的secG基因替换内源性枯草芽孢杆菌secG基因。
图9显示，与在枯草芽孢杆菌宿主(CF363)中的V049产量相比，删除内源性枯草芽孢杆菌secG基因对V049 (CF396)产量的影响，前者中没有缺失内源性secG基因。
发明的详细描述本发明提供了改变宿主细胞中所需多肽产量的方法。特别的，本发明
提供了编码全长和截短的SecG蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质能够有利于细菌宿主细胞(例如芽胞杆菌属物种)对所需蛋白酶的分泌，以及含有所述多核苷酸的表达载体和宿主细胞。
本发明的教导内容将通过参考文献详细的描述，仅使用下列定义和实例。本文中除非另外定义，本文中使用的所有的科学和技术术语都具有本发明所属领域的普通技术人员普遍理解的相同含义。数字范围包括定义所述范围的数值。本文提供的标题不是对各方面或实施方案的限制，其可以参考作为整体的说明书。因此，通过整体参考说明书可以更全面的定义下文定义的术语。
除非另外指出，本发明的实践涉及在分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、蛋白质工程化、蛋白质和DNA测序，以及重组DNA领域的通常使用的常规技术，这在本领域的范围内。此类技术是本领域技术人员已知的，并描述在多本文件和参考书中(参见例如，Sambrook等人，"MolecularCloning: A Laboratory Manual"，第2版(冷泉港)，[1989];和Ausubel等人，"Current Protocols in Molecular Biology" [1987])。本文上下文中提及的所有专利、专利申请、文献和出版物，都通过引用明确的整合到本文中。
除非另外指出，本文中使用的所有科技术语都具有本发明所属领域的普通技术人员普遍理解的相同含义。例如，Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 第2版,John Wiley和Sons, NY (1994);和Hale和Markham， The Harper Collins Dictionary ofBiology, Harper Perennial, NY (1991),为本领域技术人员提供了本发明中使用的大部分术语的常规字典。虽然在本发明的实践中可以使用与本文描述的相似或等价的任何方法和材料，但是本文描述了优选的方法和材料。因此，通过整体参考说明书，可以更全面的描述下文定义的术语。此外，如本文中使用的，除非上下文清楚的指出，单数形式"一"、"一个，，和"某个，，包括了复数形式。数值范围包括了定义范围的数值。除非另外指出，核酸都按5，至3，方向由左至右书写；^J^酸序列都按氮基至氛基端方向由左至右书写。可以理解，本发明不限于所描述的特定方法学、规程和试剂，其可以根据本领域技术人员使用的背景而变化。
本说明书全文中给出的每个数值上限都意在包括每个更小的数值限定，就如同本文明确的书写了上述较小的数值限定。本说明书全文中给出
的每个数值下限都意在包括每个更大的数值限定，就如同本文明确的书写了上述较大的数值限定。本说明书全文中给出的每个数值范围都将包括落入上述较宽数值范围内的每个较窄的数值范围，就如同本文明确的书写了上述较窄的数值范围。
此外，本文提供的标题不是发明的各方面或实施方案的限制，其可以作为对说明书的整体参考。因此，通过整体参考说明书，可以更全面的定义下文定义的术语。但是，为了帮助理解发明， 一些术语定义如下。
定义
本文中使用的术语"多肽，，指由通过肽键连接的氨基酸残基单链组成的化合物。本文中使用的术语"蛋白质"可与术语"多肽"互换的使用。
术语"核酸"和"多核苷酸"可互换的使用，涵盖了 DNA、 RNA、 cDNA、单链或双链，及其化学修饰物。由于遗传密码是简并的，因此可以使用一种以上的密码子编码特定的氨基酸，本发明涵盖了编码特定M酸序列的所有多核苷酸。
当术语"重组，，用于表示细胞、核酸、蛋白质或载体时，表示已经通过引入异源核酸或蛋白质，或改变天然的核酸或蛋白质来修饰了所述细胞、核酸、蛋白质或栽体，或者所述细胞是源于上述修饰的细胞。因此，例如重组细胞表达在天然类型(非重组)的细胞中没有发现的核酸或多肽，或者表达天然基因，所述天然基因否则是异常表达的、低表达的、W达的或完全不表达。
如本文中使用的，术语"基因"意指在生产多肽链中涉及的DNA片段，可以或可以不包括在编码区之前和之后的区域，例如5，非翻译(5，UTR)或"前导"序列，和3， UTR或"尾随"序列，以及位于单个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
如本文中使用的，术语"天然基因"指天然发现的具有其自身调控序列的基因。"嵌合基因"指不是天然基因的任何基因，包括天然发现不在一起的调控和编码序列。因此，嵌合基因可以包括来自不同来源的调控序列和编码序列，或来自相同来源但以不同于天然发现的方式排列的调控序列和编码序列。在一些实施方案中，嵌合基因是与不是其天然启动子的启动子有效连接的内源基因。
如本文中使用的，术语"内源基因"指位于生物基因组的天然位置上的天然基因。"外源"或"异源"基因指通常在宿主生物体中未发现的基因，但其通过基因转移被引入宿主生物体中。外来基因可以包括插入到非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。"转基因"是已通过转化程序被引入到基因组中的基因。
如本文中使用的，"融合核酸"包括有效的连接在一起的两种或多种核酸。核酸可以是DNA (基因组的和cDNA都包括在内)，或者RNA，或RNA和DNA的杂合体。编码全部或部分多肽序列的核酸可用于构建融合核酸序列。在一些实施方案中，使用编码全长多肽的核酸。在一些实施方案中，可以使用编码部分多肽的核酸。
术语"嵌合多肽"和"融合多肽"在本文中可互换的使用，指包括至少两个分离的且不同区域的蛋白质，所述区域可以或可以不源自相同的蛋白质。例如，与目标蛋白质连接的信号肽可以定义为嵌合多肽或嵌合蛋白，其中信号肽不是通常与目标蛋白质连接的信号肽。
如本文中使用的，术语"启动子"指具有指导下游基因转录的功能的核酸序列。在待表达耙基因的宿主细胞中，启动子通常是合适的。对于表达给定的基因，启动子和其他转录和翻译调控核酸序列(也定义为"控制序列，，)是必需的。 一般而言，转录和翻译调控序列包括但不限于，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列，翻译起始和终止序列，以及增强子或激活子序列。如本文中使用的，术语"有效的连接"意指转录和翻译调控核酸相对于编码序列位于这样的位置，所述位置可以起始转录。通常，这意指启动
子和转录起始或开始序列位于编码区的5，。转录和翻译调控核酸通常对用于表达蛋白质的宿主细胞是合适的。本领域已知可用于多种宿主细胞的多种类型的合适表达载体，和合适的调控序列。
如本文中使用的，术语"表达"指基于基因的核酸序列生产多肽的过
程。该过程包括转录和翻译。
涉及目标蛋白质(例如，蛋白酶)的术语"生产，，和"分泌"，涵盖了全长蛋白酶的加工步骤，包括去除已知在蛋白质分泌过程中发生的信号肽；去除前原区(pro region),这产生活性成熟形态的酶且已知在成熟过程中发生(Wang等人，Biochemistry 37:3165-3171 (1998); Power等人，Proc Natl Acad Sci USA 83:3096-3100 (1986));和蛋白酶转移到宿主细胞外部。
涉及蛋白酶的术语"加工"或"处理"指全长蛋白质(例如，蛋白酶)经历成为活性成熟的酶的成熟过程。
如本文中使用的，术语"染色体整合"指进入的序列被引入到宿主细胞染色体中的过程。转化DNA的同源区与染色体的同源区进行排列。然后，在双交换中i^序列取代了位于同源框之间的序列(即，同源重组)。在本发明的一些实施方案中，D N A构建体的灭活染色体片段的同源部分与芽孢杆菌属染色体的内在染色体区的侧翼同源区进行排列。然后，内在的染色体区在双交换中被DNA构建体删除(即，同源重组)。删除的区域可以同时用不同的i^X染色体区替换。
"同源重组"意指两个D N A分子或成对染色体在相同或几乎相同的核苷^列的位置上交换D N A片段。
涉及内源基因或蛋白质(例如，secG基因)的术语"替换"或"被替换"，在本文中指这样的过程，通过所述过程宿主细胞的内源性secG基因不再表达，因其被异源性多核苷酸替换，其中，所述异源多核苷酸表达异源secG。如本文中4吏用的，"使补充"、"补充作用(complementation)"或"补 充(complenting)"可互换的使用，指两个等位基因对表型的贡献。术语在 本文中指编码内源性SecG的天然或内源多核苷酸，以及编码异源SecG的 异源多核苷酸(完整的或以其片段的形式)存在于相同的菌林中，天然的 或通过整合的方法位于染色体上，或者由多拷贝质粒携带。因此，在一些 实施方案中，细菌宿主细胞包括编码异源SecG的异源多核苷酸，其补充 了编码内源SecG的内源多核苷酸，导致细菌宿主细胞包含两种编码SecG 蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，内源和异源的Sec蛋白都是全长SecG 蛋白。在其它实施方案中，异源SecG是截短的SecG蛋白。
术语"％同源性"在本文中与术语"％同一性"可互换的使用，指当 用序列比对程序比对时，核酸或M酸序列之间核酸或氨基酸序列相同的 水平。例如，如本文中使用的，80%同源性意指与通过定义的算法确定的 80%序列同一性相同的对象，因此，给定序列的同源物在一定长度的给定 序列上，具有大于80%的序列同一性。序列同一性的示例性水平包括但不 限于与给定序列约50、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约卯、 约95、约98、约99%或更高的序列同一性。利用本领域已知的标准技术 确定同源性(参见例如，Smith和Waterman, Adv Appl Math, 2:482， 1981; Needleman和Wunsch， J Mol Biol, 48:443,1970; Pearson和Lipman， Proc Natl Acad Sci USA, 85:2444， 1988;程序例如威斯康辛遗传学软件包 (Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、 BESTFIT 、 FAST A和 TFASTA， Genetics Computer Group, Madison, Wl;和Devereux等人， Nucl Acid Res， 12:387-395， 1984)。
有效算法的一个实例是PILEUP。 PILEUP从一组相关序列中，利用 渐进的成对比对法创建多重序列比对。它还可以绘制树状图，显示用于创 建比对的成蔟关系。PILEUP利用了 Feng和Doolittle的渐进比对方法 (Feng和Doo腿e, J Mol Evol， 35:351 -360， 1987 )的简化版。该方法与 Higgins和Sharp (Higgins和Sharp, CABIOS 5:151 -153， 1989)描述的相 似。有效的PILEUP参数包括缺省的空位权重3.00，缺省的空位长度权重0.10，和加权的末端空位。
有效算法的另一个实例是Altschul等人描述的BLAST算法(Altschul 等人，J Mol Biol, 215:403-410， 1990;和Karlin等人，Proc Natl Acad Sci USA, 90:5873-5787， 1993)。特别有效的BLAST程序是WU-BLAST-2程 序(参见，Altschul等人，Meth Enzymol， 266:460-480， 1996)。 WU-BLAST-2 程序使用一些检索参数，大部分设定为缺省值。可调节的参数设定为下列 值重叠间隔=1，重叠分数=0.125,字符阈(T) =11。 HSP S和HSP S2 参数是动态值，根据特定序列的组成和检索目标序列所针对的特定数据库 的组成，由程序自身确定。然而，可以调整值来增加灵敏度。％#Ju^f 列同一性值是通过将匹配相同的残基数除以在比对区域中"较长"序列的 残基总数来确定的。"较长"序列是在比对区域(忽略了 WU-Blast-2为了 使比对分数最大化而引入的空位)具有最多实际残基的序列。
因此，"百分比(％)核酸或^J^酸序列同一性"定义为候选序列中 与起始序列(即，目标序列)的核苷酸或氨基酸残勤目同的核苷酸残基的 百分比；"百分比M酸序列相似性"定义为候选序列中与起始序列(即， 目标序列)的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。优选的方法利用 WU-BLAST-2的BLASTN模块，设定缺省参数，其中重叠间隔和重叠分 数分别i更定为1和0.125。
如本文中使用的，"芽孢杆菌属物种"包括本领域技术人员已知的， "芽孢杆菌"属中的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、 地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)、迟緩芽胞杆菌(B. lentus)、短芽孢杆菌(B. brevis)、嗜热脂肪芽胞杆菌(B. stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B. alkalophilus)、解淀粉芽胞杆菌(B. amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B. clausii)、极端耐碱芽孢杆菌(B. halodurans )、 巨大芽胞杆菌(B. megaterium)、凝固芽胞杆菌(B. coagulans)、环状芽胞杆菌(B. circulans)、 灿烂芽胞杆菌(B. lautus)和苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis)。 i人识到芽孢 杆菌属不断经历分类重组。因此，所述属意在包括已经经过重新分类的物 种，包括但不限于此类生物，例如嗜热脂肪芽胞杆菌，现名为"嗜热脂肪土芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)"。在存在氧气的务降下产 生耐受性的内生孢子，这被认为是芽孢杆菌属的决定性特征，但是该特征 也用于目前命名的脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus )、双芽孢杆菌鼠
(Amphibacillus )、硫胺素芽孢杆菌属(A國rinibacilhis )、厌氧芽孢杆 菌属(Anoxybacillus )、短芽胞杆菌属(Brevibacillus )、丝状芽胞杆菌 属(Filobacillus )、薄壁芽胞杆菌属(Graciliacillus )、喜盐芽孢杆菌属
(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacilhis )、需盐芽孢杆菌属
(Salibacillus )、热杆菌属(The腦bacillus )、解脲芽孢杆菌属
(Ureibadllus)和枝芽,胞杆菌属(Virgibaeil!us)。
"天然发生的"或"野生型"指蛋白酶或编码蛋白酶的多核苷酸，所 述蛋白酶具有未修饰的、与天然发现的相同的M酸序列。天然发生的酶 包括天然的酶，这些酶天然的表达或存在于特定微生物中。野生型或天然 发生的序列指变体来源的序列。野生型序列可以编码同源的或异源的蛋白 质。
如本文中使用的，术语"异源蛋白质"指不是天然存在于宿主细胞内 的蛋白质或多肽。相似的，"异源多核苷酸"指不天然存在于宿主细胞内 的多核苦酸。
如本文中使用的，"同源蛋白质"或"内源蛋白质"指细胞内内在的 或天然的存在的蛋白质或多肽。相似的，"同源多核苷酸"或"内源多核 苷酸"指细胞内内在的或天然的存在的多核苷酸。
如本文中使用的，术语"PCR产物"、"PCR片段，，和"扩增产物" 指在结束两轮或多轮的变性、退火和延伸的PCR步骤后，所获得的化合物 的混合物。这些术语涵盖了扩增一种或多种乾序列的一个或多个片段的情 况。
如本文中使用的，术语"引物"指这样的寡核苷酸，其不论是从纯化 的限制性酶切消化中天然发生的，还是人工合成的，当处于与引入的核酸 链互补的引物延伸产物的合成条件下时(即，在存在核苷酸和引发剂例如 DNA聚合酶的条件下，和合适的温度和pH)，能够作为合成起始位点。引物优选的是单链，具有最大的扩增效率，但可选的可以是双链。如果是 双链，在用于制备延伸产物前首先处理引物以分离它的链。优选的，引物 是寡聚脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长，在存在引发剂的条件下触发延 伸产物的合成。引物的准确长度取决于多种因子，包括温度、引物来源和 使用的方法。
相关的(和衍生的)蛋白质包括"变体蛋白质"。在一些优选的实施 方案中，变体蛋白质在少数M酸残基上不同于亲本蛋白或前体蛋白并且
彼此也不同。如本文中使用的，"变体"指通过向C-端和/或N-端添加一 水《实水翁寞ffi^在扇寞is&床万il始一水遂.容水；Ki^的仿占—卜丑3UJe.—水劣.容
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个氨基酸，在蛋白质的一端或两端或氨基酸序列的一个或多个位点缺失一 个或多个氣基酸，和/或在M酸序列的一个或多个位点插入一个或多个氨 基酸，而与其相应的野生型蛋白质不同的前体蛋白。在本发明的上下文中， 通过克劳氏芽孢杆菌蛋白酶V049 (SEQ ID NO:26)来示例变体蛋白质， 其是天然发生的蛋白质Maxacal ( SEQ ID NO:25 )的变体。在一些优选的 实施方案中，变体蛋白质在少数^J^酸残基上不同于亲本蛋白或前体蛋白 并且彼此也不同。不同的M酸残基的数量可以是一个或多个，优选的l、 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 30、 40、 50或更多个氨基酸残基。在一些优选 的实施方案中，变体之间不同氨基酸的数量是在1和10之间。在一些特别 优选的实施方案中，相关的蛋白质和特定的变体蛋白之间包括至少约 35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、 约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99% 的氨基,列同一性。此外，本文中使用的相关蛋白质或变体蛋白指在一 些显著的区域与另一种相关蛋白质或亲本蛋白不同的蛋白质。例如，在一 些实施方案中，变体蛋白质具有l、 2、 3、 4、 5或10个不同于亲本蛋白质 的相应显著区。
如本文中使用的，术语"载体"指设计用于向一种或多种细胞类型中 引入核酸的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、 质粒、盒等。
17如本文中使用的，术语"表达载体"指能够在外源细胞中掺入和表达
异源DNA片段的载体。多种原核和真核表达载体是可商购的。
如本文中使用的，术语"DNA构建体"、"转化DNA"和"表达栽 体"可互换的使用，指用于将序列引入宿主细胞或生物体中的DNA。 DNA 可以是通过PCR或任何本领域技术人员已知的其它合适的技术在体外产 生的，例如利用Sambrook等人描述的标准分子生物学方法。此外，表达 构建体的DNA可以是人工的，例如化学合成的。可以将DNA构建体、转 化DNA或重组表达盒掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病 毒或核酸片段中。通常，表达载体、DNA构建体或转化DNA的重组表达 盒部分包括待被转录的核酸序列和启动子等。在一些实施方案中，表达载 体具有在宿主细胞内掺入和表达异源DNA片段的能力。
在将核^列插入到细胞内的语境中，术语"引入"意指"转染"或 "转化"或"转导"，包括涉及核酸序列掺入到真核或原核细胞中，其中 核酸序列可以4皮掺入到细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线 粒体DNA)，转化为自发复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
术语"宿主细胞"意指已经引入了载体，或染色体整合的表达盒，或 整合的PCR片段的细胞，支持表达构建体的复制和/或转录，或转录和翻 译(表达)。
"相应的宿主细胞"是这样的宿主细胞，所述细胞中没有引入载体， 或染色体整合的表达盒，或整合的PCR片段，且不支持宿主细胞的表# 建体的复制和/或转录，或转录和翻译(表达)。"相应的宿主细胞"是宿 主细胞的参照细胞。
术语"信号序列"指位于蛋白质N-末端部分的Jl^酸序列，其有利于 成熟形态的蛋白质分泌到细胞外。成熟形态的胞外蛋白质缺乏在分泌过程 中被切除的信号序列。在一些实施方案中，信号序列是源自芽孢杆菌属的 sec-依赖性信号肽。
术语"回收"、"分离"和"分开的"在本文中可互换的使用，指蛋 白质、细胞、核酸、氨基酸等去除了至少一种与其天然相关联的组分。如本文中使用的，术语"杂合体，，指这样的序列(例如分泌因子)， 其含有源自两种或多种直系同源物的序列。因此，"杂合基因"或"杂合 蛋白质"分别是这样的基因或蛋白质，其中两种或多种片^列l)分别
源自两个或多个不同基因或蛋白质，2)源自来自两个或多个不同生物体的 基因或蛋白质，或上述来源的组合。例如，杂合基因或蛋白质可以包括来 自相同或不同微生物体的两个或多个片段，例如细菌菌林如芽孢杆菌菌林 或土芽孢杆菌菌抹。
如本文中使用的，术语"蛋白酶"和"蛋白水解活性"指这样的蛋白 质或肽，其表现出水解肽或具有肽连接的底物的活性。存在多种普遍已知 的程序用于测量蛋白水解活性(Kalisz， "Microbial Proteinases," In: Fiechter 编著,Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, [1988)。例如，可以通过比较测定确定蛋白水解活性，所述测定分析所 产生的蛋白酶水解商购底物的能力。可用于此类蛋白酶或蛋白水解活性分 析的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原蛋 白(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625),和牛角蛋白(ICN Biomedical卯21 11)。利用这些底物的比色测定是本领域普遍已知的(参 见例如，WO 99/34011和美国专利号6,376,450，两者均通过引用整合到本 文中)。AAPF测定(参见例如，Del Mar等人，Anal. Biochem.， 99:316-320 [1979)也可用于确定蛋白酶的产量。该测定测量酶水解可溶性合成底物 琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺 (succinyl-alanine-alanine-proline-phenylalanine-p-nitroanilide) (sAAPF-pNA)而释放对硝基苯胺的速率。在分光光度计的410nm处测 量水解反应产生黄色的速率，与活性酶浓度成比例。
如本文中使用的，"直系同源物"和"直系同源基因"指从共同的先 祖基因通过物种形成进化而来的，位于不同物种中的基因。 一般而言，直 系同源物在进化过^中保持了相同的功能。
"所需多肽，，或"目标多肽"指待被宿主细胞表达和分泌的蛋白质/ 多肽。目标蛋白质可以是任何到目前为止认为可以在原核和/或真核细胞中表达的蛋白质。在一个实施方案中，目标蛋白质通过宿主细胞使用的分泌 相关蛋白或系统转移，包括包含信号肽的蛋白质。所需多肽可以是对宿主 同源或异源的。在一些实施方案中，所需多肽是分泌多肽，特别是选自淀 粉分解酶、蛋白水解酶、溶细胞酶、氧化还原酶和植物壁降解酶的酶。在 其它实施方案中，这些酶包括淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、
酚氧化酶、氧化酶、角质酶(cutinase)、纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、过 氧化物酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶、果胶酶、葡糖苷酶、异 构酶、转移酶、半乳糖苷酶和几丁质酶。在其它实施方案中，所需多肽是 激素、生长因子、受体、疫苗、抗体等。但是本发明并非意在限定于任何 特定的蛋白质/多肽，在一些最优选的实施方案中，所需多肽是蛋白酶。
本发明教导的内容U于这样的发现，即多肽在细菌分泌系统内的分 泌涉及一些蛋白质，可以修饰这些蛋白质并且不消除分泌复合体的分泌功 能。在一些实施方案中，可以截短、突变或缺失一些分泌蛋白，同时保持 或者甚至增加了其有利于多肽分泌的能力。因此，本发明提供了对于促进 细菌系统分泌所需多肽有用的细菌宿主系统和多肽及其编码多核苷酸。此 外，本发明教导的内容还提供了利用上述细菌宿主系统和多肽来产生所需 多肽(例如，异源多肽)的方法。在一些实施方案中，截短的分泌蛋白SecG 增加所需蛋白质的产量。
在一些方面，本发明教导的内,供了编码截短的SecG的多核普酸。 根据本发明的教导，截短的SecG可以是全长SecG的任何片段，例如，能 够有利于细菌宿主细胞分泌所需多肽。在一些实施方案中，本发明教导的 内^:供的截短的SecG具有利于细菌宿主细胞分泌所需多肽的活性或能 够有利于细菌宿主细胞分泌所需多肽，所述细菌宿主细胞含有全长内源性 SecG、截短或突变的内源性SecG,或不含有4壬何部分的内源性SecG。在 一些实施方案中，本发明提供的截短的SecG包括一个或多个区域，例如 来自一种或多种全长SecG的连续或不连续的区域。在一些实施方案中， 本发明提供的截短的SecG包括全长野生型SecG的区域。在一些实施方案 中，其包括全长的变体、修饰或突变的SecG的区域。在一些实施方案中，截短的SecG包括全长SecG的区域，所述全长SecG选自克劳氏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、迟緩芽胞杆菌、大肠杆菌(Escherichia coli)或解淀粉芽胞杆菌的SecG。在一些实施方案中，截短的SecG包括任何示例性全长SecG的区域，例如SEQ ID NO: 1画SEQ IDNO: 9。
嗜热脱氮土芽胞杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2的^J^
^列(登录号YP—001127090 )
MHALLVTLLVIVSIALIAIVLLQSGRSAGLSGAITGGAEQLFGKQKARGLDAVFQRVTVVLAIL
YFVLTI LVAYVQPS (SEQ ID NO: 1)
威氏利斯特氏菌(Listeria welshimeri)血清变型6b str. SLCC5334的M酸序列(登录号YP_850596)
VILIALAYFVQ (SEQ ID NO: 2)
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis ) ATCC 14580 (DSM 13)的氨基酸序列(登录号YP_080735)
MAAFLTVLLVIVSIVLIVWLLQSGKSAGLSGAISGGAEQLFGKQKARGLDLILHRMTWLTVLFFFLTIALAYFV (SEQ ID NO: 3)
枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp. subtilis)str. 168的^J^
^列(登录号NP_391243)
MHAVLITLLVIVSIALIIVVLLQSSKSAGLSGAISGGAEQLFGKQKARGLDLILHRITVVLAVLFFVLTIALAYIL (SEQ ID NO: 4)
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ) WCFS 1的^J^酸序列(登录
号NP_784540)
MYNLLLTLILWSVUIIAVMMQPSKTNDAMSSLTGGADDLFAKQKPRGFEAFMQKVTWLGIAFFILALALAWYSSK (SEQ ID NO: 5)
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) ATCC 334的^J^酸序列(登录号
YP—806214)
MQSLLTTFLVIDSILMATLMQPSKQQDALSALSGGATDLFGKTKSRGFEAFMEKVTVALGVIFFGLAIALVYLEAH (SEQ ID NO: 6)金黄色葡萄球菌金黄亚种(Staphylococcus aureus subsp.
aureus)MRSA252的^J^絲列(登录号YP_040260 )MHTFLIVLLIIDCIALITVVLLQEGKSSGFSGAISGGAEQLFGKQKQRGVDLFLNRLTIILSILFFVLMICISYLGM (SEQ ID NO: 7)
大肠杆菌K12的M酸序列(登录号NP—417642 )MYEALLWFLIVAIGLVGLIMLQQGKGADMGASFGAGASAflFGSSGSGNFMTRMTALLATL
FFIISLVLGNINSNKTNKGSEWENLSAPAKTEQTQPAAPAKPTSDIPN (SEQ ID NO: 8)
在其它实施方案中，截短的SecG包括SEQIDNO:9的克劳氏芽孢杆
菌全长SecG的区域。能够有利于细菌宿主细胞分泌所需蛋白质的截短
SecG区域包含N-端M酸序列，其跨越第一跨膜结构域。在其它实施方
案中，截短的SecG具有SEQIDNO:ll。
克劳氏芽孢杆菌全长SecG的JL&酸序列MQLFLMIALIIVSVLLVAWLLQPGRSSGLSGAITGGAEQLLGKQKARGLDAVLHRATIVLAVL
FFILTGLNAYFL (SEQ ID NO:9)
克劳氏芽孢杆菌截短SecG的Jl^酸序列MQLFLMIALIIVSVLLVAVVLLQPGRSSGLSGAITGGAE (SEQ ID NO:11)
在一些实施方案中，截短的SecG包括全长SecG的区域，所述全长SecG来自任何生物体，其具有与克劳氏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪土芽胞杆菌、迟緩芽胞杆菌、大肠杆菌或解淀粉芽胞杆菌的SecG相同或基^目同的^J^酸序列，例如，至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约98%或约99%的同一性。在其它实施方案中，截短的SecG共享与来自克劳氏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂土芽胞杆菌、迟緩芽胞杆菌、大肠杆菌或解淀粉芽胞杆菌的SecG序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约98%或约99%的相似性的#^酸序列。在其它实施方案中，截短的SecG与SEQ ID NO:ll的截短的SecG至少50%同一。
在一些实施方案中，截短的SecG包括全长野生型或全长变体细菌
22SecG的区域。全长SecG可以来自任何已知的或新发现的细菌菌林，例如与细菌系统中多肽分泌通路相关的。在一些实施方案中，细菌SecG是芽孢杆菌属SecG。全长SecG来源的细菌菌林的实例包括但不限于，不动杆菌属(Acinetobacter)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens )、固氮弧菌属(Azoarcus)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens )、枯草芽孢杆菌、迟緩芽孢杆菌(Bacillus lentus)、极端耐碱芽孢杆菌(Bacillus halod訓ns )、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum )、对虫巴克纳氏菌(Buchneraaphidicola) 、 Campestris、 空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens )、大肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora ) 、 土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis )、 流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、 幽门螺杆菌
(Helicobacter pylori)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis )、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides )、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、 原绿球藻(Prochlorococcus marinus )、 肺炎链球菌
(Streptococcus pneumoniae )、肠沙门氏菌(Salmonella enterica )、 沙雷菌(Shewanella oneidensis )、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、 鼠"f另寒沙、门氏菌(Salmonella typhimurium )、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphyl ococcus aureus)、 弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、浅青紫链霉菌 (Streptomyces lividans ) 、 Tropheryma whipplei 、 土拉菌
(Tularensis )、 Temecula、 Thermosynechococcus elongates 、 Thermococcuskodakarensis、地趁草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苛养^fr菌(Xylella fastidiosa)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。
在一些实施方案中，截短的SecG是克劳氏芽孢杆菌SecG。在一些实施方案中，截短的SecG通常包括至少最少数量的氨基酸残基，使其可以有利于例如部分多肽分泌通路，或者直接或间接的功能性作
用于所需多肽的分泌。在一些实施方案中，截短的SecG包括全长SecG的 至少30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38或39个氛基酸。在一些实施 方案中，全长SecG是野生型SecG。在其它实施方案中，全长SecG是变 体SecG。在一些实施方案中，截短的SecG包括全长SecG的N-端区域的 前至少30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38或前39个氨基酸。
在一些实施方案中，截短的SecG包括全长的天然或变体SecG的至少 一个区域或结构域。在一些实施方案中，截短的SecG包括至少一个跨膜 区域。在一些实施方案中，截短的SecG只包括一个跨膜区域。在一些实 施方案中，跨膜区域对应全长SecG的N-端跨膜片段。
在一些实施方案中，截短的SecG可以或可以不与一种或多种"分泌 相关蛋白，，相互作用。在一些实施方案中，截短的SecG与一种或多种分 泌相关蛋白相互作用。在一些实施方案中，截短的SecG不与一种或多种 分泌相关蛋白相互作用。术语"分泌相关蛋白"在本文中通常指在目标蛋 白质从宿主细胞中分泌时涉及的蛋白质。分泌相关蛋白可以帮助新生(即， 在合成过程中或刚结束合成时)蛋白质正确折叠，蛋白质从胞内向胞外环 境的移动(例如，通过细胞质到细胞膜，和/或跨过细胞膜/细胞壁至胞外环 境等)，正确的加工等。可以认为在蛋白质移动的任何方面涉及的蛋白质 都具有分泌相关活性或功能，所述移动为所述蛋白质净iLl&内合成直到出现 在细胞膜的外表面。此类蛋白质的实例包括但不限于，帮助新生的目标蛋 白实现正确的折叠构象所涉及的蛋白质，或来自Sec通路的蛋白质。术语 "分泌相关蛋白"、"分泌相关因子，，和"分泌因子，，在本文中可互换的 使用。
在一些实施方案中，发明提供了编码"杂合"截短SecG的多核苷酸。 杂合的截短SecG包含多余一种全长SecG的区域。此类杂合的截短SecG 包含来自第一种全长SecG的区域和来自第二种全长SecG的区域。第一或 第二种全长SecG可以是野生型SecG或变体SecG。在一些实施方案中， 第一或第二种全长SecG是细菌的，例如芽孢杆菌属的SecG。在一些实施方案中，截短的SecG是杂合的截短SecG,其包含两个区 域，所述区域包括来自两种不同细菌菌林(第一和第二菌林)的全长SecG 的区域。在一些实施方案中，第一菌林是克劳氏芽孢杆菌，第二菌林是枯 草芽孢杆菌。在一些实施方案中，第一菌林和第二菌林包括但不限于地衣 芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌；嗜热脂肪土芽胞杆菌和枯草芽孢杆菌；嗜热脂 肪土芽胞杆菌和地衣芽孢杆菌；克劳氏芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌；迟緩芽 孢杆菌和枯草芽孢杆菌；大肠杆菌和枯草芽孢杆菌；解淀粉芽孢杆菌和枯 草芽孢杆菌；解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。在一些实施方案中，杂合
的截短SecG的N-端区域包含来自克劳氏芽孢杆菌SecG的区域，杂合的 截短SecG的C-端区域包含来自枯草芽孢杆菌SecG的区域。
一般而言，与不含有截短的SecG的细菌宿主细胞的所需多肽的产量 相比，本发明教导的截短的SecG增加了所需多肽的产量。在一些实施方 案中，与不含有截短的SecG的细菌宿主细胞的所需多肽的产量相比，截 短的SecG增加了所需多肽的产量至少约20%、约30%、约40%、约50%、 约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约100%、 约125%、约150%、约175%、约200%或约250%。在一些实施方案中， 含有截短的SecG的细菌宿主细胞包含内源性SecG。在其它实施方案中， 删除了细菌宿主细胞的内源性SecG基因。在其它实施方案中，用异源的 全长SecG基因替换了细菌宿主细胞的内源性SecG基因。在其它实施方案 中，用异源的截短SecG基因替换了细菌宿主细胞的内源性SecG基因。
在一些实施方案中，截短的SecG含有来自野生型或变体全长SecG的 区域，且与^^有全长SecG的细菌宿主细胞对所需多肽的分泌相比，增加 了所需多肽的分泌。在一些实施方案中，与含有全长SecG的细菌宿主细 胞的所需多肽的分泌相比，截短的SecG增加了所需多肽的分泌至少约 20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、 约85%、约90%、约95%、约100%、约125%、约150%、约175%、 约200%或约250%。
在其它一些实施方案中，发明提供了含有上述多核苷酸以及由上述多
25核苷酸编码的多肽的表达载体，例如细菌表达栽体，和宿主细胞。具有合 适的启动子、选择标记等的合适栽体，例如细菌表达载体，是本领域技术
人员已知的。在一些实施方案中，表达载体包括aprE基因的aprE启动子， 其天然的转录枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶。在一些实施方案中，宿主 细胞包括 aprE 启动子，其是野生型 aprE 启动子
(SEQIDNO:39;美国专利申请
发明者A·范齐蒙耐德, C·佩雷斯, C·菲奥雷西, E·费拉里 申请人:丹尼斯科美国公司