专利名称：一种用于防治肝硬化的人源细胞珠蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种用于防治肝硬化真核蛋白质的重组表达。
背景技术：
我国是肝病大国，据2002年国家卫生部肝病研究组的统计资料显示，全国乙型肝炎感 染就诊人数为7500万人次，居全国各类传染病之首。与此同时，脂肪肝、酒精肝、药肝和肝 硬化等其他肝脏疾病的发病率同比上升了 17.8%,达到5000万，已经成为威胁我国人民生 命健康的又一严重社会问题。在慢性肝炎中25%左右经过5 10年将会转为肝硬化，肝硬化 中约20%将转为原发性肝癌。另资料统计显示，60%的嗜酒者患有脂肪肝；30%的酒精性脂 肪肝可演变为肝纤维化；10%以上可转化为肝硬化。
硏究表明，肝纤维化是肝硬化的前期病理阶段,是肝脏受到慢性损伤时，细胞外基质(ECM) 可逆性沉积的创伤愈合过程。积极探索肝纤维化发病机制，寻求有效治疗措施对降低肝硬化发 病率和死亡率具有重要意义。阻止肝纤维化的进展或促进纤维化的逆转是治疗的关键。国内
外目前治疗本病尚无可靠药物，西药抗肝纤维化治疗疗效差且副作用大；近年来国内外医药 界开始重视中医药抗肝纤维化的研究。但在理法方药理论指导下药理实验证实疗效可靠的中 成药尚属空缺。肝硬化患者用药总的原则是少用药、精选用药，切忌滥用、盲目用。因为服 食的各种药物都必须经过肝脏解毒处理，滥用药物很可能不但起不到保护肝脏的作用，反而 加重肝脏的负担，得不偿失。利用生物技术治疗该疾病的研究，是基于机体发病的机理而作 出针对其关键过程的治疗，同时药物来源于机体的本身，具有高疗效、低副作用的特点，市
场前景良好。
目前认为，肝星状细胞(h印atic stellate cell, HSC)在肝纤维化发生发展中起主导作用。 在各种致病因素作用下,静止期HSC被激活并增殖、转化为肌成纤维样母细胞，合成和分泌ECM 上调，同时合成和释放大量基质金属蛋白酶抑制因子(TIMPs)，使间质胶原酶等蛋白酶活性降 低，ECM降解减少，最终导致ECM积聚而发生肝纤维化乃至肝硬化。
国内外学者对肝纤维化的可逆性已无异议。鉴于HSC在肝纤维化发病机制中的主导作用， 大多数抗肝纤维化研究都以HSC为靶标。通过对抗氧化应激，抑制炎症反应，调节相关细胞因 子的活性，干扰细胞因子信号转导等途径抑制HSC增殖、活化，诱导HSC凋亡，均可呈现一定 的抗肝纤维化效应。
Kawada等(见BiolChem. 2001， 276(27) 25318-25323)在进行大鼠肝星状细胞的蛋白 质组学研究时，发现了一种新蛋白，该蛋白在肝星状细胞活化的过程中有明显的上调表达，揭示该蛋白在肝纤维化过程中发挥着重要的生物功能。目前在国际上比较多的被命名为细胞珠 蛋白(cytoglobin, Cygb,GeneID: 114757)，也有人称之为肝星状细胞激活相关蛋白(Stellate cell activation-assciated protein, STAP)，它属于一个S 发5见的hexacoordinate globin超家方矣 的成员，该家族的成员在动物，蓝细菌及植物中都有表达。研究表明，该蛋白家族的一些成 员，可以清除机体内的毒素，例如氧化亚氮(nitric oxide)，过氧化亚硝酸盐 (peroxynitrite)'以及氢过氧化物(hydrogen peroxide) 。 / "J.朋J"等人的研究也证实 了在大鼠的肝星状细胞中过表达cytoglobin可以缓解氧化压力，抑制肌成纤维样母细胞的分 化，同时减少细胞外基质的沉降。
细胞珠蛋白可以从动物和人的细胞组织中提取得到，但是可获得量极少，不能满足临床的 需求，因此，学者们将研究方向转向了原核表达。众所周知，真核生物中的大部分功能蛋白 在表达后需要经过一系列的修饰折叠形成高级结构才具有生物活性，将这类蛋白的基因转到 原核生物中虽然也可获得一级结构相同的蛋白质，但是原核生物中缺少蛋白修饰折叠所需的 工具，往往所得的蛋白质由于不具备正确折叠的高级结构而导致其生物活性较低甚至丧失生 物活性。
中国专利申请"人源肝星状细胞激活相关蛋白(Stellate cell activation-assciated protein, STAP)治疗肝脏疾病的用途"(申请号为200710020563.7)公开了一种利用基因重组技术构 建表达菌获得STAP的方法，具体步骤如下将STAP的cDNA克隆到pET-28a表达载体并 转化到Ecoli BL21中表达出STAP包涵体，所得包涵体用Sephadex G-25层析柱复性和纯化， 得到重组人源肝星状细胞激活相关蛋白(rhSTAP)。但是上述方法所得的rh STAP以包含体 的形式表达出来的，包含体是一种错误折叠的、没有生物活性的、以沉淀状态存在的蛋白质， 即使是经过复性也只可能具备部分生物活性，甚至没有生物活性，难以保证每个生产批次蛋 白质的稳定性和均一性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种生物活性稳定的重组人源细胞珠蛋白。
本发明解决上述问题的技术方案是
一种人源细胞珠蛋白的表达质粒，该质粒是将SEQ NO. 1所示的DNA片段用Afcot和历"dIII 酶切后克隆到载体pET-32a的表达区得到。
一种转化体，其特征在于该转化体的宿主为大肠杆菌BL21 (DE3)，导入的重组载体为本 发明所述的人源细胞珠蛋白的表达质粒。
一种重组人源细胞珠蛋白，该蛋白由本发明所述的转化体在异丙基-e-D-硫代半乳糖苷
的诱导培养下的表达产物经凝血因子FXa切割去除Trx标签、His标签和FXa识别序列后获
4得，其中所述的表达产物是由Trx标签、His标签、FXa识别序列和人源细胞珠蛋白依次连接 构成的融合蛋白。
本发明所述表达质粒的制备方法由以下步骤组成
(1) 提取H印G2细胞的总RNA，用引物1和引物2进行反转录PCR得到序列为SEQN0.2 的DNA片段；
(2) 以序列为SEQ NO.2的DNA片段为模板用引物2和引物4进行PCR反应得到序列 为SEQN0.3的DNA片段；
(3) 以序列为SEQ N0.3的DNA片段为模板用引物3和4进行PCR反应得到序列为SEQ NO.l的DNA片段；
(4) 序列为SEQNO.l的DNA片段用〃co1和他; dl11酶切后克隆到载体pET-32a的表 达区，得到重组质粒pET-32a- hCygb;
所述引物1的序列为5， - CTGGTATTGAGGGTCGCATGGAGAAAGTGCCA-3， ( SEQN0.4); 所述引物2的序列为5' - TCATCATCATCATTCTTCTGGTATTGAGGGTCGCA-3'( SEQN0.5); 所述引物3的序列为5' - GATGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTC-3' ( SEQN0.6); 所述引物4的序列为5， - GCACTCGCTAAGCTTCTACGGCCCCGAAAGGG-3' ( SEQN0.7)。 本发明所述转化体可用常规的方法将重组质粒PET-32a- hCygb转化到大肠杆菌 (^yc力er/c/ ia BL21 (DE3)中获得，如电穿孔法、氯化钙转化法等。
本发明所述重组人源细胞珠蛋白的制备方法由以下步骤组成
(1) 将本发明所述转化体在含异丙基-P -D-硫代半乳糖苷的LB培养基中诱导培养；
(2) 收集菌体，将菌体破碎，取上清，用组氨酸标记亲和层析柱分离出融合蛋白；
(3) 所得融合蛋白用凝血因子FXa酶切，然后上组氨酸标记亲和层析柱，用氯化钠溶液 按1 99% (w/v)的浓度变化进行梯度洗脱，收集出现第一个洗脱峰的洗脱液，最后用pH值 为8. 0、浓度为lOmM的Tris-HCl缓冲液透析，浓缩即可。
本发明人源细胞珠蛋白的表达质粒可在原核宿主中表达融合蛋白，该融合蛋白由Trx标 签、His标签、FXa识别序列和人源细胞珠蛋白依次连接构成，用凝血因子FXa酶切去掉Trx 标签、His标签和FXa识别序列即可获得重组人源细胞珠蛋白，所得重组蛋白具有与天然人 源细胞珠蛋白相同生物活性，对肝硬化有显著的治疗以及预防作用。
本发明所述重组人源细胞珠蛋白(rhCygb)，从原核表达到用凝血因子FXa切割，经历了 两次折叠，由于其在折叠和切割的过程中，用于折叠的一级结构以及折叠的条件不同，形成 的空间结构即不同于天然存在的人源细胞珠蛋白，也不同于以包含体形态表达的复性蛋白。 天然存在的人源细胞珠蛋白(hCygb)是由真核细胞表达的，经过了多重的修饰，而本发明rhCygb是由有修饰缺陷的系统内表达的，没有经过这些修饰，虽然一级结构一样，但是高级 结构已经发生了变化。本发明rhCygb的生物活性与天然存在的hCygb相比，保持了较高的生 物活性，并且可大量获得，有利于工业化生产；与以包含体形式表达的复性蛋白相比，不仅 稳定均一，而且其生物比活性高了 50%。
图1是本发明重组人源细胞珠蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果，其中，A是蛋白质分子 量Marker， B是纯化后的本发明重组人源细胞珠蛋白。
图2是本发明重组人源细胞珠蛋白N-terrainal氨基酸序列的测定结果。 图3是本发明重组人源细胞珠蛋白C-terminal氨基酸序列的测定结果。
图4是本发明重组人源细胞珠蛋白治疗肝纤维化实验中各组小鼠治疗6周后血清ALT 水平比较柱形图。
图5是本发明重组人源细胞珠蛋白治疗肝纤维化实验中各组小鼠治疗6周后血清AST 水平比较柱形图。
图6是本发明重组人源细胞珠蛋白治疗肝纤维化实验中各组小鼠治疗6周后血清白蛋白 水平比较柱形图。
图7是本发明重组人源细胞珠蛋白治疗肝纤维化实验中各组小鼠治疗6周后血清AKP 水平比较柱形图。
图8是本发明重组人源细胞珠蛋白治疗肝纤维化实验中各组小鼠治疗6周后血清透明质 酸水平比较柱形图。
图9是本发明重组人源细胞珠蛋白治疗肝纤维化实验中各组小鼠治疗6周后肝组织 MDA含量比较柱形图。
图10是本发明重组人源细胞珠蛋白治疗肝纤维化实验中各组小鼠治疗6周后肝组织 GSH-Px含量比较柱形图。
图11是本发明重组人源细胞珠蛋白治疗肝纤维化实验中各组小鼠治疗6周后肝组织羟 脯氨酸含量比较柱形图。
图12是本发明重组人源细胞珠蛋白预防肝纤维化实验中各组小鼠预防6周后血清ATL 水平的比较柱形图。
图13是本发明重组人源细胞珠蛋白预防肝纤维化实验中各组小鼠预防6周后血清ASL 水平的比较柱形图。
图14是本发明重组人源细胞珠蛋白预防肝纤维化实验中各组小鼠预防6周后血清白蛋
6白水平的比较柱形图。
图15是本发明重组人源细胞珠蛋白预防肝纤维化实验中各组小鼠预防6周后血清AKP 水平的比较柱形图。
图16是本发明重组人源细胞珠蛋白预防肝纤维化实验中各组小鼠预防6周后血清透明 质酸水平的比较柱形图。
图17是本发明重组人源细胞珠蛋白预防肝纤维化实验中各组小鼠预防6周后肝组织MDA 含量的比较柱形图。
图18是本发明重组人源细胞珠蛋白预防肝纤维化实验中各组小鼠预防6周后肝组织 GSH-Px含量的比较柱形图。
图19是是本发明重组人源细胞珠蛋白预防肝纤维化实验中各组小鼠预防6周后肝组织 羟脯氨酸含量的比较柱形图。
具体实施例方式
为了更好地理解本发明，F面将通过具体的制备例子和效果实验来进一步阐明本发明所 具有的技术效果。
1、本发明所述人源细胞珠蛋白的表达质粒的构建 (1 )提取H印G2细胞的总RNA，用引物1和引物2进行反转录PCR得到序列为SEQ N0.2 的DNA片段；
反转录PCR的反应条件如下94。Cl分钟；58°C ; 1分钟72°C 1分钟；30个循环。
(2) 以序列为SEQN0.2的DNA片段为模板用引物2和引物4进行PCR反应得到序列 为SEQN0.3的DNA片段；
PCR反应条件如下94°C l分钟；58°C ; 1分钟；72°C 1分钟；30个循环。
(3) 以序列为SEQN0.3的DNA片段为模板用引物3和4进行PCR反应得到序列为SEQ NO.l的DNA片段
PCR反应条件如下94°C l分钟；58°C ; 1分钟；72°C l分钟；30个循环。
(4) 序列为SEQ NO.l的DNA片段用Afcol和〃iy7din酶切后克隆到载体pET-32a的表 达区，得到重组质粒PET-32a- hCygb;
上述步骤所用的引物均由Invtrogen公司合成，其DNA序列分别为 引物l: 5， - CTGGTATTGAGGGTCGCATGGAGAAAGTGCCA-3' ( SEQNO.4); 引物2: 5， - TCATCATCATCATTCTTCTGGTATTGAGGGTCGCA-3， ( SEQNO.5); 引物3: 5， - GATGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTC-3， ( SEQNO.6);
7引物4: 5' - GCACTCGCTAAGCTTCTACGGCCCCGAAAGGG-3' ( SEQN0.7)。 2、本发明所述转化体的制备
(1) BL21(DE3)感受态细胞购于TIANGEN公司
(2) 转化
2.2.1从4。C冰箱中取200yl感受态细胞悬液，立即置冰上。加入重组质粒pET-32a-hCygb连接液，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。
2. 2. 2 42。C水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
2. 2. 3向管中加入lml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37'C振荡培养1小时，使细菌恢 复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素Amp抗性基因。
2.2.4将上述菌液摇匀后取lOOul涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时， 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37'C培养16-24小时。 (3)筛选
2. 3. 1每组连接反应转化原液取100 n 1用无菌玻棒均匀涂布于含Amp的筛选平板上，37 'C下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。
.2. 3. 2倒置平板于37'C继续培养12-16小时，待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿 出平板。
2.3.3用无菌牙签分别挑取多个单菌落接种于含Amp 50yg/ml的5ml LB液体培养基 中，37'C下振荡培养12小时。含有重组质粒pET-32a_ hCygb的转化子可以在抗性培养基中正 常生长。保存筛选得到的含有重组质粒？￡1-323- hCygb的转化子，用于后续的诱导表达。
(4)鉴定本发明采取的是最简便快速的PCR鉴定。即提取转化子的质粒作为PCP的 模板，以上文合成的引物1和引物4作为模板，进行PCR反应，可以产生与hCygb cDNA同 样大小片段PCR产物，既说明是正确的转化子。
3、 本发明所述重组人源细胞珠蛋白的获得
U)培养取所得转化体按1% (w/w)的接种量接到LB培养基中，在溶氧量为30°/。， 温度为37'C的条件下培养至菌液OD,为0.6，然后在培养基中添加lmM的异丙基-e-D-硫 代半乳糖苷，3(TC培养12h,离心收集菌体。
(2) 融合蛋白的获得将所收集的菌体先用pH值为8.0、浓度为lOmM的Tris-HC1缓 冲液悬浮，然后用超声波破碎，离心，取上清，以60mL/h的流速上His Bind亲和层析柱， 接着用1 XBinding Buffer洗涤柱床至基线，1 XWash Buffer洗涤柱床至基线，1 XElute Buffer洗脱融合蛋白。
(3) 融合子与目的蛋白的分离收集出现融合蛋白峰的洗脱液，用FXa酶切缓冲透析后按1U FXa : 100吗融合蛋白的比例加入FXa，室温下酶切12h。将酶切后的溶液以60mL/h 的流速上His Bind亲和层析柱，此时含有His标签的融合子由于亲合作用与柱体结合，而 目的蛋白则不再与柱体发生亲合作用。利用NaCl溶液进行梯度洗脱(NaCl浓度变化为 1%-99%)，收集第一个出现洗脱峰，既为目的蛋白。将所收集的洗脱峰用pH值为8.0、浓度 为10mM的Tris-HCl缓冲液透析，冻干法浓縮即可。所得蛋白用SD-PAGE电泳检测蛋白质纯 度，结果见图l。
4、 本发明所述重组人源细胞珠蛋白(rhCyg)的鉴定
纯化后的rhCygb利用Resource RPC柱(Global)进行反向色谱纯化，流动相为A液(2% 乙腈，0.05%三氟乙酸)、B液(98%乙腈，0. 05%三氟乙酸)，利用色谱仪AKTA explorer (Pharmacia Biotech)进行洗脱、收集。收集的rhCygb样品用于以下鉴定
A. rhCyg的N-terminal氨基酸序列利用仪器Protein N-terminal Sequencer (ABI491LC PE)，用HPLC的方法检测，结果见图2。
B. rhCygb的C-terminal氨基酸序列利用仪器Protein C-terminal Sequencer ( LTQ Finnigan)，用tandem mass spectrometry的方法检测，结果见图3。
结果显示，rhCygb经过RPC纯化后，纯度大于95%， N-terminal 10个氨基酸序列为 NH2-M-E-K-V-P-G-E-M-E-1 ' C-terminal 23个氨基酸序列为E-V-G-W-V-Q-Q~V-P-N-A-T-T-P-P-A-T-L-P-S-S-G-P，均与理论值吻合。
5、 本发明所述重组人源细胞珠蛋白(rhCygb)稳定性的研究
将rhCygb配置成标准溶液(lmg/ml)，置于4'C保存，每隔24小时取样，分别检测rhCygb 蛋白标准溶液中的蛋白含量以及rhCygb的比活力。取按中国专利申请200710020563.7所记 载的方法制备的rhSTAP做对比。
rhCygb的比活力(即抗氧化活性)用T-A0C试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测， 具体方法如下
(1) 样品的准备将rhCygb利用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究 所)检测蛋白浓度，利用20mM Tris-HC1 (pH8.0)配置成lmg/ml的标准溶液。
(2) 设立0.1、 0.2、 0.3ml 3个剂量组，按照T-AOC试剂盒的说明进行加样和操作。
(3) 将各检测管在旋涡混匀器充分混匀，放置15rain，蒸馏水调零，lcni光径，520nm 检测各管吸光度(0D)值。
(4) 根据试剂盒的说明进行数据处理。
结果如表1和表2所示，本发明rhCygb比包含体形式表达的复性蛋白质具有更高的生物 活性，所以我们采用了比包含体形式表达的复性蛋白质少50%的给药剂量进行动物实验，同样取得了较好的治疗与预防效果。
表l本发明rhCyg的稳定性研究结果
时间(小时)24487296120144168
可溶性蛋白浓度(mg/ml)0.990.980.990.990.980.980.98
抗氧化活性(U/mg prot)181.5179,2178.4174.3176.9175.6176.3
表2 中国专利申请200710020563.7所述rhSTAP稳定性研究结果时间(小时)24487296120144168
可溶性蛋白浓度(mg/m)1.031,041.021.010.991.000.99
抗氧化活性(U/mgprot)82.181.482.280.681.479.079.7
6、本发明rhCygb治疗肝纤维化效果的研究
取SD雄性大鼠，体重180 200g，室温词养，标准饮食，自由饮水，皮下注射用植物油 稀释的25y。CCL，剂量2ml/kg,每周注射2次，并根据老鼠体重调整用量，共进行12周。
于造模第七周，大鼠眼眶静脉丛取血，测定血清中AST,ALT含量，根据所得数据将模型 大鼠平均分为五组，即模型组，治疗低剂量组(给药剂量rhCygb 1.0mg/kg)，治疗中剂量 组(给药剂量rhCygb 2.0mg/kg)，治疗高剂量组(给药剂量rhCygb 4.0mg/kg)，阳性对 照组(给药剂量甘利欣4.0mg/kg)。另外再设立一个iH常组。从第七周开始治疗，低剂量 组、治疗中剂量组、治疗高剂量组和阳性对照组每天腹腔注射相应药物。治疗6周，末次给 药24h后，眼眶静脉丛取血3ml,分离血清后，测定ALT，AST,白蛋白，碱性磷酸酶(AKP)， 透明质酸。处死后，取每只大鼠同一部位肝脏，10%甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，做病理 学检査。再取一部分肝组织测定其谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，丙二醛(MDA),羟脯氨酸 (Hyp)。
结果显示
(1)与正常照组大鼠相比，大鼠皮下注射四氯化碳3个月后血清ALT，AST,碱性磷酸酶， 透明质酸水平升高明显，而白蛋白比值有所降低，肝组织匀浆中MDA和羟脯氨酸水平明显升 高，GSH-Px含量有所下降。提示四氯化碳己造成大鼠肝脏损伤，出现了肝硬化的症状。
(2) 与模型组大鼠相比，rhCygb治疗六周后，治疗组以及阳性对照组的实验结果显示， 对于血清ALT，AST,碱性磷酸酶，透明质酸升高有明显的抑制，对于肝组织匀浆中MDA和羟 脯氨酸水平升高也有所抑制，同时减少了白蛋白，GSH-Px的下降(见图4 11)。提示rhCygb 大鼠肝脏损伤具有明显的治疗作用。
(3) 治疗低剂量组(给药剂量:rhCygb 1.0mg/kg)，治疗中剂量组(给药剂量:rhCygb
102.0mg/kg)，治疗高剂量组(给药剂量rhCygb4.0mg/kg)的治疗效果有区别，提示了 rhCygb 对肝硬化的治疗作用具有剂量依赖关系。具体的表现为，随剂量的增加，治疗效果加强。
(4)外观结果显示，模型组肝脏病变明显，颜色由正常的红褐色变为棕黄色，表面粗糙， 有颗粒感，治疗组与阳性组对肝脏病变具有明显的保护作用，肝脏表面光滑，颜色为红褐色。
(4) HE染色见模型组大鼠肝脏均出现慢性脂肪性变，并见散在肝细胞坏死，汇管区炎性 细胞浸润，纤维结蒂组织有增生趋势。而治疗组可见肝组织脂肪变性显著减轻，点状坏死灶 与炎性细胞浸润减少，纤维结缔组织增生有明显减轻。
以上结果说明
1、 皮下注射CCl4造成了大鼠的肝脏损伤，导致了肝硬化。
2、 rhCygb缓解了 CCl4造成了大鼠的肝脏损伤，对慢性四氯化碳大鼠肝硬化具有治疗的 作用。
3、 rhCygb对慢性四氯化碳大鼠肝硬化的治疗作用具有剂量依赖关系，剂量增加，治疗 效果加强。
7、本发明rhCygb预防肝纤维化效果的研究
取SD雄性大鼠，体重180 200g，室温饲养，标准饮食，自由饮水，皮下注射用植物油 稀释的25% CC14，剂量2ml/kg，每周注射2次，并根据老鼠体重调整用量，将大鼠随机分为5 组即模型组，预防低剂量组(给药剂量rhCygb L0mg/kg)，预防中剂量组(给药剂量 rhCygb 2.0mg/kg)，预防高剂量组(给药剂量:rhCygb 4. Omg/kg)，阳性对照组(给药剂量: 甘利欣4.0mg/kg)。另外再设立一个正常组。预防组从第一周开始给药，预防周期12周，末 次给药24h后，眼眶静脉丛取血3ml，分离血清后，测定ALT, AST,白蛋白，碱性磷酸酶(AKP)， 透明质酸。处死后，取每只大鼠同一部位肝脏，10%甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，做病理 学检査。再取一部分肝组织测定其谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，丙二醛(MDA),羟脯氨酸 (Hyp)。
结果显示
(1)与正常照组大鼠相比，大鼠皮下注射四氯化碳3个月后血清ALT, AST,碱性磷酸酶 (AKP)，透明质酸水平升高明显，而白蛋白比值有所降低，肝组织匀浆中MDA和羟脯氨酸水 平明显升高，GSH-Px含量有所下降。提示四氯化碳己造成大鼠肝脏损伤，出现了肝硬化的症 状。
(2)与模型组大鼠相比rhCygb预防12周后，预防组以及阳性对照组的实验结果显示， 对于血清ALT，AST,碱性磷酸酶(AKP)，透明质酸升高有明显的抑制，对于肝组织匀浆中MDA 和羟脯氨酸水平升高也有所抑制，同时减少了白蛋白，GSH-Px的下降(见图12 19)。提示rhCygb大鼠肝脏损伤具有明显的预防作用。
(3) 预防低剂量组(给药剂量rhCygb 1.0mg/kg)，预防中剂量组(给药剂量rhCygb 2.0mg/kg)，预防高剂量组(给药剂量rhCygb4.0mg/kg)的预防效果有区别，提示了 rhCygb 对肝硬化的预防作用具有剂量依赖关系。具体的表现为，随剂量的增加，预防效果加强。
(4) 外观结果显示，模型组肝脏病变明显，颜色由正常的红褐色变为棕黄色，表面粗糙， 有颗粒感，预防组与阳性组对肝脏病变具有明显的保护作用，肝脏表面光滑，颜色为红褐色。
(4) HE染色见模型组大鼠肝脏均出现慢性脂肪性变，并见散在肝细胞坏死，汇管区炎性 细胞浸润，纤维结蒂组织有增生趋势。而预防组可见肝组织脂肪变性显著减轻，点状坏死灶 与炎性细胞浸润减少，纤维结缔组织增生有明显减轻。
以卜.结果说明
1、 皮下注射CCl4造成了大鼠的肝脏损伤，导致了肝硬化。
2、 rhCygb缓解了 CCl4造成了大鼠的肝脏损伤，对慢性四氯化碳大鼠肝硬化具有预防的 作用。
3、 rhCygb对慢性四氯化碳大鼠肝硬化的预防作用具有剂量依赖关系。剂量增加，预防 效果加强。
12序列表
〈110〉南方医科大学
〈120> —种人源细胞珠蛋白的表达质粒及其构建方法 <160> 7
〈170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 639
<212> 腿
〈213〉 human
<400> 1
gatggccata tgcaccatca tcatcatcat tcttctggta ttgagggtcg catggagaaa 60
gtgccaggcg卿tggagat cgagcgcagg gagcggagcg aggagctgtc cgaggcggag 120
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aagcacatgg aggatcccct ggagatggag cggagccccc agctgcggaa gcacgcctgc 300
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tctgtgctcg cccttgtggg gaaagcccac gccctcaagc acaaggtgga accggtgtac 420
ttca卿tcc tctctggggt cattctggag gtggtcgccg aggaatttgc cagtgacttc ■
ccacctgaga cgcagagagc ctgggccaag ctgcgtggcc tcatctacag ccacgtgacc 540
gctgcctaca aggaagtggg ctgggtgcag caggtcccca acgccaccac cccaccggcc 600
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〈210〉 2
〈211〉 605
<212> 歸
〈213〉 human
〈400〉 2ctggtattga gggtcgcatg g卿卿tgc ggagcgagga gctgtccgag gcgg卿gga atgccaactg cgaggacgtg ggggtggcca cggccaagca gt已cttc3gc cagttcaagc gcccccagct gcggaagcac gcctgccgag acctgcatga ccccgacaag gtgtcctctg tcaagcacaa ggtggaaccg gtgtacttca tcgccgagga atttgccagt gacttcccac gtggcctcat ctacagccac gtgaccgctg tccccaacgc caccacccca ccggccacac agtgc
caggcg卿t gg卿tcg已g cgc鄉gsgc 60
aggcggtgca ggctatgtgg gcccggctct 120
tcctggtgag gttctttgtg aacttcccct 180
acatggaggs tcccctggag atggagcgga 240
tcatgggggc cctcaacact gtcgtggaga 300
tgctcgccct tgtggggaaa gcccacgccc 360
agatcctctc tggggtcatt ctggaggtgg 420
ctgagacgca gagagcctgg gccaagctgc 480
cctacaagga agtgggctgg gtgcagcagg 540
tgccctcttc ggggccgtag aagcttagcg 600
605
〈210〉 3
〈211〉 622
〈212〉 腿
〈213〉 human
〈400〉 3
tcatcatcat cattcttctg gtattgaggg gatcgagcgc agggagcgga gcgaggagct tatgtgggcc cggctctatg ccaactgcga ctttgtgaac ttcccctcgg ccaagcagt已 cctgg卿tg gagcggagcc cccagctgcg caacactgtc gtggagaacc tgcatgaccc gggga^gcc cacgccctca agcacaaggt ggtcattctg gaggtggtcg ccgaggaatt agcctgggcc aagctgcgtg gcctcatcta
tcgcatggag犯agtgccsg gcgagatgga 60
gtccgaggcg g卿ggaagg cggtgcaggc 120
ggacgtgggg gtggccatcc tggtgaggtt 180
cttcagccag ttcaagcaca tggaggatcc 240
gaagcacgcc tgccgagtca tgggggccct 300
cgacaaggtg tcctctgtgc tcgcccttgt 360
ggaaccggtg tscttcaaga tcctctctgg 420
tgccagtgac ttcccacctg agacgcagag 480
cagccacgtg accgctgcct acaaggaagt 540 14gggctgggtg cagcaggtcc ccaacgccac caccccaccg gccacactgc cctcttcggg 600 gccgtagaag cttagcgagt gc 622
〈210> 4
<211〉 32
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
〈400〉 4
ctggtattga gggtcgcatg gagaaagtgc ca 32
〈210〉 5
〈211〉 35
<212〉 DNA
〈213〉 人工序列
<400> 5
tcatcatcat cattcttctg gtattgaggg tcgca 35
〈210〉 6
〈211〉 32
<212> 腿 〈213〉人工序列
〈400> 6
gatggccata tgcaccatca tcatcatcat tc 32
〈210〉 7
〈211〉 32
〈212〉 DNA <213>人工序列
〈400〉 7
gcactcgcta agcttctacg gccccgaaag gg 3权利要求
1、一种人源细胞珠蛋白的表达质粒，该质粒是将SEQ NO.1所示的DNA片段用NcoI和HindIII酶切后克隆到载体pET-32a的表达区得到。
2、 权利要求l所述的一种人源细胞珠蛋白的表达质粒的制备方法，该方法由以下步骤组成(1) 提取H印G2细胞的总RNA，用引物1和引物2进行反转录PCR得到序列为SEQN0.2 的DNA片段；(2) 以序列为SEQN0.2的DNA片段为模板用引物2和引物4进行PCR反应得到序列 为SEQN0.3的DNA片段；(3) 以序列为SEQ N0.3的DNA片段为模板用引物3和4进行PCR反应得到序列为SEQ NO.l的DNA片段；(4) 序列为SEQ NO.l的DNA片段用Afcol和历'/ clin酶切后克隆到载体pET-32a的表 达区，得到重组质粒pET-32a- hCygb;所述引物1的序列为5， - CTGGTATTGAGGGTCGCATGGAGAAAGTGCCA-3，； 所述引物2的序列为5， - TCATCATCATCATTCTTCTGGTATTGAGGGTCGCA-3，； 所述引物3的序列为5' - GATGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTC-3'; 所述引物4的序列为5' - GCACTCGCTAAGCTTCTACGGCCCCGAAAGGG-3，。
3、 一种转化体，其特征在于该转化体的宿主为大肠杆菌BL21(DE3)，导入的重组载体为 权利要求1所述的人源细胞珠蛋白的表达质粒。
4、 一种重组人源细胞珠蛋白，该蛋白由权利要求3所述的转化体在异丙基-e-D-硫代半 乳糖苷的诱导培养下的表达产物经凝血因子FXa切割去除Trx标签、His标签和FXa识别序 列后获得，其中所述的表达产物是由Trx标签、His标签、FXa识别序列和人源细胞珠蛋白依次连接构成的融合蛋白。
5、 权利要求4所述的一种重组人源细胞珠蛋白的制备方法，该方法由以下步骤组成(1) 将权利要求3所述转化体在含异丙基-P -D-硫代半乳糖苷的LB培养基中诱导培养；(2) 收集菌体，将菌体破碎，取上清，用组氨酸标记亲和层析柱分离出融合蛋白；(3) 所得融合蛋白用凝血因子FXa酶切，然后上组氨酸标记亲和层析柱，用氯化钠溶液 按1 99% (w/v)的梯度洗脱，收集出现第一个洗脱峰的洗脱液，最后用pH值为8.0、浓度 为10mM的Tris-HCl缓冲液透析，浓縮即可。
全文摘要
本发明提供了一种人源细胞珠蛋白的表达质粒，该质粒是将SEQ NO.1所示的DNA片段用NcoI和HindIII酶切后克隆到载体pET-32a的表达区得到。本发明所述人源细胞珠蛋白的表达质粒可在原核宿主中表达融合蛋白，该融合蛋白由Trx标签、His标签、FXa识别序列和人源细胞珠蛋白依次连接构成，用凝血因子FXa酶切去掉Trx标签、His标签和FXa识别序列即可获得重组人源细胞珠蛋白，所得重组蛋白具有与天然人源细胞珠蛋白相同生物活性，对肝硬化有显著的治疗以及预防作用。
文档编号C12N15/70GK101580846SQ200910040558
公开日2009年11月18日 申请日期2009年6月25日 优先权日2009年6月25日
发明者董文其, 威 魏 申请人:南方医科大学