专利名称：一种水环境病毒高效、快速的富集方法
技术领域：
本发明涉及一种水环境中病毒高效而快速的富集方法。
背景技术：
环境中存在的各种致病病毒对人类健康造成了极大的危害。目前已经证实，城市 污水尤其生活污水中含有大量种类的病毒，如脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒、轮状病毒等等， 且含量在5X106PFU/L以上。这些病毒以水为媒介，经常引发传染病的爆发流行，因此必须 对这些病毒进行高效而快速的监测，阻断其传播的途径。目前，对环境水体和污水中病毒的富集方法较多，包括阴电荷、阳电荷过滤浓集方 法，无机、有机沉淀法，无烟煤、树脂吸附法等。Fattal等采用阳电荷吸附-洗脱方法可以 使水中肠道病毒回收率达到50 77%;Ma等采用MK和IMDS过滤方法可以回收水中73 90%的Polio病毒；Bass等报道采用“Zeta Plus”阳电荷过滤器结合有机絮凝沉淀富集 回收污水中的轮状病毒，结果发现回收的病毒低于检测限；Singh等采用同种设备富集水 中的细菌病毒_f2噬菌体、MS2噬菌体，回收率只有16% 44% ；Goyal等的回收率也只 有55%左右；Rose及Kittigul分别比较了阴、阳电荷富集水中细菌病毒和轮状病毒的效 果，结果两者的回收率相当；目前报道污水中病毒回收率最高的是Mehnert等采用“Zeta Plus”阳电荷过滤器回收污水中的轮状病毒，并用PCR方法检测，病毒回收率达81%;此外， 还有采用有机絮凝或铝盐沉淀、玻璃纤维、浙青煤、树脂等回收污水中的病毒，并用细胞培 养法或PCR检测病毒，回收率在40% 80%左右。由此可见，尽管水中病毒的富集方法已 有较多的报道，但效果好或具有实用价值的却很少，主要问题有或病毒回收率低(大多数 低于60% )，效果不稳定；或易受水质条件影响，尤其是污水浊度的限制；或可处理的水样 量太小(絮凝沉淀法处理污水量一般小于1升)，无实际应用价值；或在回收病毒同时，也 将水中对组织细胞培养有毒性的物质浓集，导致假阳性结果；或操作复杂，成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、快速的水环境病毒富集方法。本发明可以将待检 样本中大于50个/ml的病毒进行分离与浓集，分离浓集时间为30分钟左右。本发明的技术方案概述如下一种高效、快速的水环境中病毒富集方法，其特征是包括如下步骤①葡聚糖纳米磁颗粒的制备a.将 0. 5 1. 2mol/L 的 FeCl3 · 6H20 水溶液 10 20ml 与 0. 5 2. 5mol/L FeCl2 ·4Η20水溶液2 6ml混合，在氮气氛围下，滴加至10 30ml的30 70%的葡聚糖 T-40水溶液中，所述葡聚糖T-40水溶液的浓度为g/ml百分比浓度，50 70°C，水浴10 30分钟，在150 500转/分钟的搅拌下，10 30分钟内，向混合液中滴加3 7mol/L的 氨水35-45ml，温度保持50 70°C，并始终通氮气，制成悬液；b.将悬液用乙酸或稀盐酸调至PH为6. 0-8. 0 ；
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C.将悬液中的聚集体在600Xg下离心10 20分钟去除游离的葡聚糖后，经聚丙 烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤获得葡聚糖纳米磁颗粒，其中洗脱平衡液为pH为6 8的0. 005 0. 02mol/L磷酸盐缓冲液，收集的颗粒经冷冻干燥，最后获得的葡聚糖纳米磁 颗粒悬液的浓度为5 10mg/ml ；d.取葡聚糖纳米磁颗粒悬液0. 5 2. Oml，加入10 30mmol/L NaIO4水溶液 0. 25ml, 150转/分钟避光阻氧震荡0. 5 12小时后，加入1 3mol/L乙二醇的水溶液 0. 1 0. 3ml终止氧化，用pH为6 8的0. 005-0. 02mol/L磷酸盐缓冲液4°C透析18 48 小时，去除过量的NaIO4,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为3 8mg/ml ；②纳米免疫磁性颗粒悬液的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10 30μ g/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的病毒抗 体，混勻后，4°C避光放置6 24小时，加入0. 2 lmol/LNaBH4水溶液还原10 60分钟， 加入NaBH4的量为0. 1 0. 5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，多余的抗体用S印hacryl S-300 凝胶层析柱过滤与结合物分离，制成特定病毒的纳米免疫磁颗粒悬液。③富集水环境中特定病毒在Iml检测样本中加入纳米免疫磁颗粒悬液2 20 μ 1，吸附3 20分钟，在 15 35°C，磁板吸引2-10分钟，弃上清后用含体积百分比为0. 05% 0. 的吐温-20的 0. 005 0. Olmol/L的磷酸盐缓冲液0. 5 1. Oml洗涤一次，加入0. Iml生理盐水即可制成
浓集的病毒悬液。病毒回收率(回收后溶液中的病毒量/回收前水中的病毒量)X 100%肠道病毒的指示微生物为f2噬菌体、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒。本发明的优点是1、操作简便，不需要任何仪器设备；2、纳米免疫磁颗粒浓集、分离特定病毒只需2 30分钟。
附图为本发明采用TECNAI-20透射电子显微镜拍得的纳米免疫磁颗粒电镜照片， 放大倍数X 100000。照片显示葡聚糖纳米磁颗粒核心大小为5 lOnm。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明实施例1葡聚糖纳米磁颗粒的制备a)将 0. 5 1. 2mol/L 的 FeCl3 · 6H20 水溶液 10 20ml 与 0. 5 2. 5mol/L FeCl2 ·4Η20水溶液2 6ml混合，在氮气氛围下，滴加至10 30ml的30 70%的葡聚糖 T-40水溶液中，所述葡聚糖T-40水溶液的浓度为g/ml百分比浓度，50 70°C，水浴10 30分钟，在150 500转/分钟的搅拌下，10 30分钟内，向混合液中滴加3 7mol/L的 氨水35-45ml，温度保持50 70°C，并始终通氮气，制成悬液；b)将悬液用乙酸或稀盐酸调至pH为6. 0-8. 0 ；c)将悬液中的聚集体在600 X g下离心10 20分钟去除游离的葡聚糖后，经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤获得葡聚糖纳米磁颗粒，其中洗脱平衡液为pH为6 8的0. 005 0. 02mol/L磷酸盐缓冲液，收集的颗粒经冷冻干燥，最后获得的葡聚糖纳米磁 颗粒悬液的浓度为5 10mg/ml ；d)取葡聚糖纳米磁颗粒悬液0. 5 2. Oml,加入10 30mmol/L NaIO4水溶液 0. 25ml, 150转/分钟避光阻氧震荡0. 5 12小时后，加入1 3mol/L乙二醇的水溶液 0. 1 0. 3ml终止氧化，用pH为6 8的0. 005-0. 02mol/L磷酸盐缓冲液4°C透析18 48 小时，去除过量的NaIO4,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为3 8mg/ml。实施例2富集水环境中f2噬菌体，包括如下步骤
①f2噬菌体纳米免疫磁性颗粒悬液的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10 μ g/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的f2噬菌体抗 体，混勻后，4°C避光放置6小时，加入0. 2mo VLNaBH4水溶液还原60分钟，加入NaBH4的量 为0. lml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，多余的抗体用Sephacryl S-300凝胶层析柱过滤与结 合物分离，制成f2噬菌体纳米免疫磁颗粒悬液；③富集水环境中f2噬菌体在Iml检测样本(分别含有5，10，20，50，100PFU/mL的f2噬菌体)中加入f2噬菌 体纳米免疫磁颗粒悬液2 μ 1，吸附20分钟，在35°C，磁板吸引2分钟，弃上清后用含体积百 分比为0. 05%的吐温-20的0. 005mol/L的磷酸盐缓冲液1. Oml洗涤一次，加入0. Iml生理 盐水制成悬液，即可获得富集的f2噬菌体，各样品病毒回收率见表1。结果表明，f2噬菌体 纳米免疫磁性颗粒的灵敏度为20PFU/ml，当水样中病毒含量超过100PFU/mL时，病毒回收 率在83%以上。表1回收Iml样本中f2噬菌体的灵敏度及回收率(x±s, n=3) *:未检出。实施例3富集水环境中脊髓灰质炎病毒，包括如下步骤①脊髓灰质炎病毒纳米免疫磁性颗粒悬液的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10 μ g/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的脊髓灰质炎病 毒抗体，混勻后，4°C避光放置6小时，加入0. 2mo VLNaBH4水溶液还原60分钟，加入NaBH4 的量为0. lml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，多余的抗体用Sephacryl S-300凝胶层析柱过滤 与结合物分离，制成脊髓灰质炎病毒纳米免疫磁颗粒悬液；③富集水环境中脊髓灰质炎病毒在Iml检测样本(分别含有5，10，20，50，100PFU/mL的脊髓灰质炎病毒)中加入脊 髓灰质炎病毒纳米免疫磁颗粒悬液2 μ 1，吸附20分钟，在35°C，磁板吸引2分钟，弃上清后 用含体积百分比为0. 05%的吐温-20的0. 005mol/L的磷酸盐缓冲液1. Oml洗涤一次，加入0. Iml生理盐水制成悬液，即可获得富集的脊髓灰质炎病毒，病毒回收率见表2。结果表明， 脊髓灰质炎病毒纳米免疫磁性颗粒的灵敏度为50PFU/ml，当水样中病毒含量超过100PFU/ mL时，病毒回收率在78%以上。表2回收Iml样本中脊髓灰质炎病毒的灵敏度及回收率(^±s，n=3) *:未检出。实施例4富集水环境中柯萨奇病毒，包括如下步骤①柯萨奇病毒纳米免疫磁性颗粒悬液的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10 μ g/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的柯萨奇病毒抗 体，混勻后，4°C避光放置6小时，加入0. 2mo VLNaBH4水溶液还原60分钟，加入NaBH4的量 为0. lml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，多余的抗体用Sephacryl S-300凝胶层析柱过滤与结 合物分离，制成柯萨奇病毒纳米免疫磁颗粒悬液；②富集水环境中柯萨奇病毒取5份Iml检测样本(分别含有5，10，20，50，100PFU/mL的柯萨奇病毒)，向其中 加入柯萨奇病毒纳米免疫磁颗粒悬液2 μ 1，吸附20分钟，在35°C，磁板吸引2分钟，弃上清 后用含体积百分比为0. 05%的吐温-20的0. 005mol/L的磷酸盐缓冲液1. Oml洗涤一次，加 入0. Iml生理盐水制成悬液，即可获得富集的柯萨奇病毒，病毒回收率见表3。结果表明，柯 萨奇病毒纳米免疫磁性颗粒的灵敏度为50PFU/ml，当水样中病毒含量超过100PFU/mL时， 病毒回收率在74%以上。表3回收Iml样本中柯萨奇病毒的灵敏度及回收率(5±s，n=3) *:未检出。
权利要求
一种水环境病毒高效、快速的富集方法，其特征是包括如下步骤①葡聚糖纳米磁颗粒的制备a.将0.5～1.2mol/L的FeCl3·6H2O水溶液10～20ml与0.5～2.5mol/L FeCl2·4H2O水溶液2～6ml混合，在氮气氛围下，滴加至10～30ml的30～70％的葡聚糖T 40水溶液中，所述葡聚糖T 40水溶液的浓度为g/ml百分比浓度，50～70℃，水浴10～30分钟，在150～500转/分钟的搅拌下，10～30分钟内，向混合液中滴加3～7mol/L的氨水35 45ml，温度保持50～70℃，并始终通氮气，制成悬液；b.将悬液用乙酸或稀盐酸调至pH为6.0 8.0；c.将悬液中的聚集体在600×g下离心10～20分钟去除游离的葡聚糖后，经聚丙烯酰胺葡聚糖S 300凝胶层析柱过滤获得葡聚糖纳米磁颗粒，其中洗脱平衡液为pH为6～8的0.005～0.02mol/L磷酸盐缓冲液，收集的颗粒经冷冻干燥，最后获得的葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5～10mg/ml；d.取葡聚糖纳米磁颗粒悬液0.5～2.0ml，加入10～30mmol/LNaIO4水溶液0.25ml，150转/分钟避光阻氧震荡0.5～12小时后，加入1～3mol/L乙二醇的水溶液0.1～0.3ml终止氧化，用pH为6～8的0.005 0.02mol/L磷酸盐缓冲液4℃透析18～48小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为3～8mg/ml；②纳米免疫磁性颗粒悬液的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10～30μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的病毒抗体，混匀后，4℃避光放置6～24小时，加入0.2～1mol/LNaBH4水溶液还原10～60分钟，加入NaBH4的量为0.1～0.5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，多余的抗体用Sephacryl S 300凝胶层析柱过滤与结合物分离，制成特定病毒的纳米免疫磁颗粒悬液。③分离、浓集水环境中病毒在1ml检测样本中加入纳米免疫磁颗粒悬液2～20μl，吸附3～20分钟，在15～35℃，磁板吸引2 10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％～0.1％的吐温 20的0.005～0.01mol/L的磷酸盐缓冲液0.5～1.0ml洗涤一次，加入0.1ml生理盐水即可制成浓集的病毒悬液。
全文摘要
本发明公开了一种水环境病毒快速而高效的富集方法。由以下步骤组成(1)向1ml检测样本中加入病毒纳米免疫磁颗粒悬液2μl，吸附20分钟；(2)在35℃，磁板吸引2分钟；(3)弃上清后用含体积百分比为0.05％的吐温-20的0.005mol/L的磷酸盐缓冲液1.0ml洗涤一次，加入0.1ml生理盐水制成悬液，即可获得富集的病毒，本发明可使病毒回收率达70％以上，回收灵敏度为50PFU/ml。本发明涉及的纳米免疫磁颗粒用于富集水环境中的病毒，具有快速、高效、效果稳定的优点。
文档编号C12R1/93GK101928697SQ200910069390
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月23日 优先权日2009年6月23日
发明者李君文, 王新为, 王景峰, 谌志强, 邱志刚, 金敏, 陈照立 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所