一种培育花器官败育的水稻的方法及其专用dna片段的制作方法

专利名称：：一种培育花器官败育的水稻的方法及其专用dna片段的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种培育花器官败育的水稻的方法及其专用DNA片段。
背景技术：
：MIKC型MADS-box基因编码一类很大的转录因子家族，由于这类基因有着类1以的M(MADS)，I(Intervening),K(Keratin-like)和C(C-terminal)四个结构域，故《寻名，这些基因在花的发育过程中起着重要的调控作用。通过对双子叶模式植物拟南芥(/1ra力iofcipsi5、金鱼草(/4/t_z'rr/_z'/wffl/saj'W5)禾口矮牵牛(尸et"77ia//6_r/cfe)花发育分子遗传学的研究表明，各类同源异型MADS-box基因广泛参与了花器官发育各个时期的调控过程，并建立了花发育的ABCDE模型。该模型认为A、B、C、D、E代表5类不同的花器官特征基因，其基因产物以四聚体的方式调控花器官的发育。其中，A类和E类基因控制萼片的发育；A、B和E类基因控制花瓣的发育；B、C和E类基因控制雄蕊的发育；C和E类基因控制心皮的发育；D类和E类基因控制胚珠的发育；A和C类基因相互抑帝iJ。在这5类基因中，E类基因的功能最为复杂，它不仅是花器官特征基因，而且对花分生组织决定性起作用。有关E类基因的功能作用，在单子叶植物中远没有在双子叶植物如拟南芥、矮牵牛中清楚；而根据基因的表达模式及系统进化分析，E类基因在单子叶植:吻中功能发生了很大的变异，但对它的研究目前还很薄弱。双子叶植物中E类基因(5^7^1ike基因)的功能主要体现在对萼片、花瓣、雄慈和心皮的特征性以及花分生组织的决定性起着重要作用。水稻作为单子叶植物的模式植^1，它的典型的E类基因包括0柳/57、(9s厕"5^、(fe鹏"57禾[]6fe紛AW。其中，除了对flsy{//mS7基因有较深入的研究外，对其它几个基因的功能了解较少，尤其是fe，船"S7和fts，朋"5^。
发明内容本发明的目的在于提供一个DNA片段一个DNA片段，由基因片段A、B和C依次连接组成；所述基因片段A的核苷酸序列为序列表中的序列l，所述基因片段A与基因片段C反向互补；所述基因片段B是内含子。上述内含子的核苷酸序列是序列表中的序列2。含有上述DNA片段的重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围之内。上述重组载体具体可为pUJ0sM71，其构建方法如下将上述的DNA片段插入质茅立pU1301的多克隆位点，得到重组载体；所述质粒pU1301是将Ubi启动子插入pCAMBIA1301质粒上的//"din和fe^m酶切位点之间得到的重组质粒。本发明的另一目的在于提供一种培育花器官败育的水稻的方法，是将上述的重组载体导入水稻中，得到重组水稻。本发明的又一目的在于提供一个DNA片段，由基因片段D、E和F依次连接组成；所述基因片段D的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述基因片段D与基因片段F反向互补；所述基因片段E是内含子。上述内含子的核苷酸序列是序列表中的序列2。含有上述DNA片段的重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围之内。上述重组载体可以是pUJ0sM8M，构建方法如下将上述的DNA片段插入质粒pU1301的多克隆位点，得到重组载体；所述质粒pU1301是将Ubi启动子插入pCAMBIA1301质粒上的历/xil11和fe/iH酶切位点之间得到的重组质粒。任一上述的Ubi启动子是以玉米基因组DNA为模板，用ubi启动子的引物U-1:5-AAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCC-3和U-2:5-GGATCCCTGCAGAAGTAACACCAA-3进行PCR扩增得到的片段。本发明的又一目的在于提供一种培育花器官败育的水稻的方法，是将上述的重组载体导入水稻中，得到重组水稻。得到花器官败育的水稻可以作为一种筛选材料，在以后的育种工作可以利用这种花器官败育的材料，筛选一些可以令其重新开花的激素、化合物或者基因。通过转基因技术获得不育水稻的方法同样可以应用于其它植物，特别是禾本禾斗的农作物和牧草。经过培育的不育植物可以避免因为结实产生的能量消耗，增加总的生物量和提高茎叶营养价值，为畜牧业提高优质的青储饲料。此外，可以让花器管败育的研究在杨树，柳树等不期望起开花的物种中得到应用，避免花絮满天飞的现象，以增强园林绿化的效果。本发明通过实验证实过量表达fts紛Z^9转基因植株产生了早花和矮化的表型。同时，利用RNAi技术单独的特异性抑制Os厠仍7或^鹏"M基因的表达后，转基因株系没有任何表型，这说明E类基因存在着功能冗余；当同时抑制0AMZ^7和fla^Z^S基因时，转基因水稻株系产生明显的表型改变。主要表现为植株矮化，晚花，内三轮花器官都带有了部分稃片化的特征，并丧失了花分生组织的决定性。当同时抑制4个5S^like基因fls朋"5V,ft湖Z57和fo船/tt^时，导致所有花器官都变成叶状结构，同时失去了花分生组织决定性，在花的中心顶端形成新一轮花器官或花分生组织转逆转为花序分生组织。图1为I和Z力oI双酶切鉴定cDNA文库中插入片段的大小。图2为RNAi载体构建模式图。图3为fez*I和/V"I双酶切pBluescriptII(SK)和pJawohl3载体，其中M为marker，1是fez*I和AbtI双酶切pBluescriptll(SK)图；2是丄和/VMI双酶切pJawohl3图。图4为扩增片段，其中，M为marker;1为8C引物扩增片段；2为8M引物扩增片段。图5为pUJOsM8C和pUJOsM8M的酶切鉴定图，其中，M为marker;1为pBJOsM8M载体经5"raHI+历"dIII酶切图；2为pBJOsM8M载体经￡coRI酶切图；3为pBJOsMSC载体经5amHI+战"dIII酶切图；4为pBJOsM8C载体经￡coRI酶切图。图6为pBJOsM71载体的酶切检测图，其中，M为marker;1为pBJOsM71载体经五coRI酶切图。图7为扩增片段，其中；M为marker;1为71引物扩增片段；2为7C引物扩增片段。图8为pUJOsM7C载体的酶切检测图，其中，M为marker;1为pUJOsM7C载体经五coRI酶切图。图9为转基因水稻幼苗的GUS染色鉴定，A:转基因水稻(左侧)和空载体对照(右侧)对照再生幼苗叶片横截面的GUS染色结果；B:转基因水稻(左侧)和空载体对照(右侧)幼苗根段GUS染色结果。图10为PCR鉴定RNAi-T-DNA的插入，A:特异抑制OsM4DS7基因的植株(Os7C)中T-DNA插入的PCR鉴定；B:同时抑制&柳"57//7柳/8基因(Os71)中T-DNA插入的PCR鉴定。WT:空载体对照；0s7I-l、0s7I-2、0s71-16:Os7I中的不同株系；0s7C-l、0s7C-12:Os7C中的不同株系。图ll为转基因株系的开花时间，其中，开花时间单位是天。图12为空载体对照小穗和OsM4DS7,OsM4DSS基因沉默后的株系表型。图13为空载体对照小穗和E类基因沉默后的株系表型。图14为0SM8M株系的心皮石蜡切片。图15为0SM7I株系的心皮石蜡切。图16为Northern杂交检测插入0SM8M载体中的基因片段在转基因株系叶片中的转录，WT为空载体对照；M卜M8是同时抑制Qs細ASl、fls朋"55、Gs柳Z67^7Os細仍8基因产生的不同株系图17为RT-PCR分析水稻E类基因在转基因小穗中的表达，WT为空载体对照；M1-M8是同时抑制fls鹏"51、flsi/ymS5、Cls鹏Z^7^7fls湖/68基因产生的不同株系图18为转基因株系的real-timePCR结果，A:同时抑制Os朋"51、&厕"65、0i^"57和fe鹏"58基因所产生的不同株系的real-time;B:特异抑制fe.紛Z^7基因所产生的不同株系的real-time;C:同时抑制te湖Z58基因所产生的不同株系的real-time。图19为RT-PCR检测转基因水稻的基因表达，WT:空载体对照；0s7I:同时抑制Os，i^"6Y浙&細"58基因所产生的不同株系；0s7C:特异抑制6te鹏AS7基因所产生的不同株系。图20为和(^7K4AS7基因表达模式的检测，其中A-H:6teyl^"5^基因的表达模式；I-Q:^細Z57基因的表达模式。图21为E类蛋白酵母双杂交分析。图22为Co-IP分析E类蛋白之间的相互作用模式。图23为0sMADS8过量表达载体示意图，A.将tag融合在feyK^6^编码区下游；B.将tag融合在Cte細"5^编码区上游。图24为转基因植株的PCR(A)和RT-PCR(B)鉴定结果。图25为MF0s8、Os8MPF蛋白的免疫杂交结果。图26为水稻空载体对照和各种矮化突变体茎节伸长模式示意图。图27为0鹏"5^过量表达植株株型。A.空载体对照和MF0s8株系植株株型比较；B.空载体对照和0s8MPF-1株系植株禾朱型比较；C.空载体对照和0s8MPF-2株系植株株型比较。MF0s8转基因水稻叶片深绿色；叶夹角增大。图28为&#^0《过表达植株的株高(A)和节间相对长度统计(B)。图29为0s8MPF植株的开花期大大提前，A.空载体对照植株(左)和0s8MPF植株(右)形态比较；B.A图白色方框的局部放大，示0s8MPF植株的小穗结构；在空载体对照水稻还在营养生长阶段时，0s8MPF植株已经开始了开花过程。图30为Os8MPF植株花器官没有发生明显改变，A-C空载体对照水稻花器官解剖结构；D-FOsMPF植株花器官解剖结构。图31为转基因水稻中BRs合成相关基因的RT-PCR，左边MFOs8植株；中间Os8MPF植株；右边空载体对照(WT植株)。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例l、水稻E类基因在花器官发育中的调控功能一、基因的沉默1、基因的克隆基因是用RACE方法克隆得到的，&湖"57基因是用0,紛Z5^基因为探针筛选水稻cDNA文库得到的。1)稻幼穗cDNA文库的构建取野生型水稻中花11号(购自中国农科院作物科学研究所)1-5cm的幼穗提取总RNA，分离mRNA后，采用Stratagene公司的ZAP-cDNASynthesisKit构建cDNA文库-。经滴度检测原始库的滴度为3.7X10"繁菌斑数/m1,扩增库的滴度为9.3Xl(f噬菌斑数/ml。兰白斑鉴定得出空斑率只有0.8%。随机挑取17个噬菌斑，经环化后提取质粒，用构建文库时所用的内切酶进行酶切鉴定，结果在17个克隆中，lkb以上的片断有13个，占总数的76%(图l)，说明文库的质量符合要求。2)筛选cDNA文库的探针模板a.从水稻基因组扩增MADS-box保守区序列为了从文库中筛选得到MADS-box基因，首先根据MADS-box基因保守区的序列特点设计简并性引物TP1和TP2，从水稻基因组扩增MADS-box保守序列，以作为筛选cDNA文库的探针模板。引物序列为TP1:5'-ATGGGG(/A)AGAGGAAAGATA(/T)GAG-3'(21bp)TP2:5'-ATTCATAGAGG(/C)CGGCCACG-3'(19bp)扩增条件为96。C，2min;94°C，30sec，52°C,30sec，72°C，30sec，30个f盾环；72°C延伸10rain。扩增结束后，PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳，回收250bp左右的条带，连接到pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5a。挑取单克隆，经PCR、酶切鉴定后测序。结果获得了170bp的MADS保守区CGTGGCCGCCTCTATGAAT经序列比对分析，该序列与水稻C/D类MADS-box基因的相应区段相同性高达86%，与E类基因相应区段的相同性达79W,与A、B类基因稍低一些，分别为74%和75%。故筛库时得到C/D类和E类基因的可能性更大一些。b.RACE克隆&7^"5^基因^細"幼基因是从水稻发育中的胚胎中得到的。根据拟南芥的研究结果，MADS-box基因^;Z75参与了胚胎的发育，我们推测在水稻的胚胎发育中也应该有MADS-box基因的参与，所以设计了扩增MADS-box基因的简并引物，用PCR的方法，从水稻胚胎中克隆MADS-box基因。从水稻中花11号授粉一周后的胚胎中提取总RNA，分离mRNA后，用GIBICO-BRL公司的Superscript111RNaseH-反转录酶进行反转录，3'-端引物PTA序列为5'-CCGGATCCTCTAGAGCGGCCGC(T),「3，，反转录结束后，以第一链cDNA为模板，用5，一端特异引物UBP和3'—端引物扩增MADS-box基因。引物序列为UBP:5'-ATGGC(G)A(G)AGAGGG(A)AA(G)ITIC(G)A_3'，3'-端引物就是PTA引物去掉polyT的序列。扩增条件为94°C，2min;94°C，30sec，50°C,30sec，72°C,lmin，35循环；72°C延伸10min。扩增结束后，lX的琼脂糖凝胶电泳，回收lkb左右的条带，并连接到pGEM-TEasy载体，转化大肠杆菌DH5a。挑取单克隆先进行PCR、酶切鉴定，然后测序验证。其中的一个克隆经序列比对分析发现，与^鹏"5S基因仅有一个核甘酸的区别，氨基酸序列完全相同。我们认为这个克隆就是&i^Z^S基因，一个核甘酸的区别很可能是不同基因型间核甘酸序列多态性的表现。从胚胎表达基因中分离到了fl5.紛"5S基因，说明Cte紛"5^基因可能参与了水稻胚胎的发育。c.从水稻cDNA文库筛选6l柳Z67等其它MADS-box基因在得到了水稻MADS盒序列和^朋i^《基因后，我们以此为混合探针，从水稻幼穗cDNA文库中筛选其它MADS-box基因。结果又得到了Cte細"5^和Os^^057基因。系统进化分析表明，fls朋"5^、fe朋Zi5^、&#AO^、Osi/v4ft57和fe拟"5^4与拟南芥中的S5P基因聚为一类，为6"57Hike类基因。根据氨基酸序列比对分析，0sMADS8和0sMADS7的序列相似性最高，与拟南芥中SEP3序列相似。2、RNAi载体的构建为了研究水稻5E^like基因的功能作用，我们构建了四个RNAi载体，分别命名为pUJ0sM8C、pUJ0s廳、pUJ0sM7C和pUJ0sM7T，用于转化水稻。pUJ0sM8C:利用8C1和8C2引物扩增该基因3'端的特异序列，用来特异沉默Os崩AS^基因；pUJ0sM8M:利用8M1和8M2扩增fe湖"5S基因5'端的保守序列，用来沉默水稻中5^严like类基因；pUJOsM7C:利用7C1和7C2扩增该基因3'端的特异序列，用来沉默&#/1/^7基因；pUJ0sM71用来沉默fls掘"57和0厕/^基因，利用了靠近I区的序列，由引物711、712扩增；6te紛/W7和Os細"5^两个基因的这一段序列相同性非常高，因此RNA干扰将同时降低这两个基因的转录本。载体构建时，RNAi特异片段的选择是通过&鹏"57，61si^"S5;0&紛"57，fls^4"5^和6te紛"5"W五个E类基因序列比对分析而决定的。构建所选取基因片段图示如图2:详细的载体构建过程如下-(1)pU1301的构建以玉米基因组DNA为模板，以ubi启动子的引物U-1:5-AAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCC-3和U-2:5-GGATCCCTGCAGAAGTAACACCAA-3为引物，其中划线部分为酶切位点分别是历"dIII和5aMlI;94。C预变性4min，94。C变性lmin,57。C退火lmin，72。C延伸2min40s，30个循环，最后72。C延伸10min,进行PCR扩增，产物为2Kb左右的片段即为Ubi启动子。该启动子经测序验证正确后通过〃i/7dIII和fe州I两个酶切，将Ubi启动子连接到pCAMBIA1301(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriclture，www.cambia.org)上，构成pU1301载体。(2)pBJW13构建将pJawohl3(GenebankAccessionNumberAF404854)的内含子及终止子经Ss/*I和M^I双酶切连接到pBluescriptII(SK)载体(图3)，构成pBJW13中间载体。(3)中间载体pBJ0sM8C的构建以pTEQs7^Z5^(RACE方法得到的flsi^Z55基因全长片段插入PGEM-TEasy(promega，美国)载体得到pTE&湖仍W为模板，用8C引物(8C1:5'-GCCGGATCCTCTAGAGCACGGCGCCACCC-3'，8C2:5'-GGACCATGGCCCGGGCGTGCATCACATCAG-3')扩增片段(图4)。构建pBJ0sM8C时，因8C引物扩增的片断有JteI位点，与pBJW13的&eI位点为同尾酶，故先把8C引物扩增的产物经屈3I和5feaI双酶切后插入经5>I和I双酶切的pBJW13载体，构成pBJ0sM8C—，8C引物扩增的产物再经Ss/HI和I位点正向插入pBJ0sM8C—载体，最终构成pBJ0sM8C。(4)转化载体pUJ0sM8C的构建将中间载体pBJ0sM8C上的正反向插入片段和终止子经SaMiI和5scI酶切位点转移到植物表达载体pU1301，构建成转化载体pUJOsM8C(图5)。(5)中间载体pBJ0sM8M的构建以pTEQs掘Z^《为模板，用8M引物(腦l:5'-GCCGGATCCTCTAGATGGGGAGAGGGAGGG-3',8M2:5'-GGACCATGGTCCACCCGGGCCTTCAG-3')扩增片段(图4)。8M引物的PCR产物先经fey*I和AfcoI位点正向插入pBJW13，构成pBJ0sM8M+，再经8M引物扩增的片断有sI位点，与pBJW13的5》e1位点为同尾酶将PCR产物经J6sI和5/zaI双酶切后插入经&eI和S脇I双酶切的pBJ0sM8M+载体，构成pBJ0sM8M。(6)转化载体pUJ0sM8M的构建因pBJ0sM8M载体上没有6"scI位点，故先用yVotI单酶切pBJ0sM8M,补平，再用I单酶切；同样，先用5"acI单酶切pU1301，补平，再用^mHI单酶切，然后将这两个片断连起来，构成pUJ0sM8M转化载体(图5)，其中转化载体pUJ0sM8M有一DNA片段，该DNA片段由基因片段D、E和F依次连接组成；所述基因片段F是片段D(序列3)的反向序列；所述基因片段E的核苷酸序列是序列表中的序列2。(7)中间载体pBJ0sM71的构建以OsMADS7基因为模板，分别用7I引物(7I1:5'-GCCGGATCCTCTAGACCGCGGCAAGCTCTACG-3'，712:5'-GGACCATGGCCCGGGTCAACCAGATGTTTTGTC-3')扩增，因71引物扩增的片断有JfeI位点，与pBJW13的&eI位点为同尾酶，故先把8C引物扩增的产物经J6aI和6"/肥I双酶切后插入经&eI和5bsI双酶切的pBJW13载体，构成pBJ0sM7I—，71引物扩增的产物再经As/zHI和I位点正向插入pBJ0sM7I—载体，最终构成pBJ0sM71，经五coRI酶切验证，结果如图6所示。(8)转化载体pUJOsM7I(pUJWA+)的构建因pBJ0sM71载体上没有&cI位点，故先用Abtl单酶切pBJ0sM71，补平，再用5a;zHI单酶切；同样，先用&cI单酶切pU1301,补平，再用ife/^I单酶切，然后将这两个片断连起来，构成pUJ0sM7I转化载体，其中，pUJ0sM7I转化载体中有一DNA片段，由基因片段A、B和C依次连接组成；所述基因片段A的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述基因片段C是基因片段A的反向序列；所述基因片段B的核苷酸序列是序列表中的序列2。(9)中间载体pBJ0sM7C的构建以0sMADS7基因为模板，用7C引物(7C1:5'-GCCGGATCCTCTAGAGCAAGTGTGGGAGCAG-3'，7C2:5'-GGACCCGGGAAGGTAGTATCTCACACAAG-3，)扩增，因7C引物扩增的片断有laI位点，与pBJW13的I位点为同尾酶，故先把7C引物扩增的产物经J6aI和51/^I双酶切后插入经&eI和5iaI双酶切的pBJW13载体，构成pBJ0sM7C—，7C引物扩增的产物再经fe/zHI和I位点正向插入pBJ0sM7I—载体，最终构成pBJ0sM7C。(10)转化载体pUJ0sM7C(pUJWB+)的构建将中间载体pBJ0sM7C上的正反向插入片段和终止子经^/diI和fecI酶切位点转移到表达载体pU1301，构建成转化载体pUJ0sM7C,经五coRI酶切验证，结果如图8所示。3、载体的转化将上述构建好的RNAi转化载体用电击法分别导入农秆菌EHA105,用农杆菌介导的方法转化水稻中花11号成熟胚诱导的愈伤组织。浸染后的愈伤组织经共培养，在潮霉素筛选培养基上经过多次筛选培养得到独立转化的抗性愈伤组织块。成功转化的愈伤组织转移到分化培养基上分化出苗；分化的水稻苗经鉴定为阳性的转基因水稻苗移栽到温室的土壤中生长，分别获得了10个以上独立的RNAi的水稻T。代转基因株系。按照获得RNAi的转基因株系的方法，制备转pU1301的水稻，作为空载体对照。4、转基因植物的鉴定(1)组织GUS染色鉴定对分化培养基上分化出的再生水稻苗经一周左右的炼苗处理后，在向室外移栽前全部按不同株系分成单株，编号并进行GUS染色鉴定。初步筛选出的相应叶片和根段呈现蓝色的阳性转化苗(图9)，以及同批次对照苗同时移栽到室外种植，并重新按株系进行单株编号标记。(2)PCR鉴定RNAi-T-DNA的插入对移栽到室外种植成活的转基因水稻苗生长一段时间后，按编号的不同株系，,叶片的基因组DNA进行RCR鉴定RNAi-T-DNA的插入。使用载体潮霉素基因片段上的特异引物HygF:5，-CTgCTCCATACAAgCCAACCAC-3，和HygR:5'-AgCCTgACCTATTgCATCTCCC-3'，对再生的T。代水稻株系进行PCR鉴定。结果表明，所有经GUS染色鉴定初步筛选出的再生植株全都是阳性苗(图IO)，也证明GUS染色筛选的结果是可靠的。5、RNAi转基因株系的表型观察pUJ0sM7C载体(特异抑制tei^Z^Z)转化水稻愈伤后，得到17个株系，称之为0sM7C株系；pUJ0sM8C载体(特异抑制^崩"5S)转化水稻愈伤后，46个转化的株系，称之为0sM8C株系；pUJ0sM7I载体(同时抑制0al^/57和6te^"&)转化水稻愈伤后，共得到18个具有明显表型的株系，称之为0sM71株系；pUJ0sM8M载体(同时抑制6la^"W,foi^"5"5",fls細"57禾Plfe朋"5W转化水稻愈伤后，得到26个具有明显表型的株系，称之为0sM8M株系。(1)转基因水稻生长特性观察0sM7C株系的株高和株型与空载体对照以及野生型对照相比，没有明显差别，0sM7C植株结实率明显降低，所有植株结实率普遍低于50%;而0sM7I株系植株明显矮化，平均株高只有80厘米左右，远低于空载体对照水稻的120厘米。0sM71植株抽穗期有一定程度的延长(图ll，0sM7I-2、0sM7I-5、0sM7I-8、0sM7I-14是不同0sM71株系;WT:空载体对照)，而且始终观察不到开花和散粉，随后花序逐渐变成褐色干枯，完全不结实。(2)花结构的表型观察我们对所有转基因株系的小穗结构进行了解剖观察，单独沉默^紛"W或化劇"5"《基因的小穗与空载体对照以及野生型对照相比，没有任何可见区别。同时抑制^i^/^7和&/^/^《基因表达的0sM71株系的颖片和内外稃片基本正常(图12A-D)，但是内三轮花器官的发育受到严重影响浆片数目部分增多，所有的浆片都伸长变薄呈薄膜状(图12E，F);雄蕊数目异常，花药扁平伸长，部分花丝扁平或基部扁平膨大，呈现片状化的趋势(图12E,H-J);心皮结构异常，其中弱表型的心皮绿色膨大(图12G)，伸长成稃片状结构，柱头2—4个(图12H,E)，强表型的心皮开裂不闭合，并且又从中长出心皮状和雄蕊状结构(图12G)。心皮结构的改变也通过扫描电镜进行了观察，强表型的心皮开裂不闭合(图13H，1)，心皮内部又长出了小花状或花序状的结构，而且在这些结构的基部还长了丝状的毛状物(图12P，Q),类似于一级分枝苞片上的绒毛(图12T);另外，通过扫描电镜还发现，与空载体对照细胞相比(图12R)，转基因株系心皮的远轴表皮细胞重排没有发生明显变化，但是细胞表面明显凹凸不平，并且长出了毛状附属物，类似空载体对照内外稃片上的结构(图12J-P)。以上表型的分析表明，0sM7I株系的内三轮花器官都不同程度的片状化，并且开始具有稃片的特征。同时沉默了其它E类基因的小穗，四轮花器官的发育均受到了不同程度的影响。所有小穗的颖片都没有表型变化(图13)，说明E类基因沉默对颖片没有影响。强表型株系小穗的内外稃片瘦长，呈叶片状(图13C)，类似于&,紛"57突变体；内三轮所有花器官均发生同源异型转换，变成叶状结构，在原有花器官处长出小花状结构，而在该结构内部又长出几个狭长的小穗状幼嫩肉质结构(图13c-F)，从而使整个花序结构发生了改爽(图13a)。这个表型特征与拟南芥中s卬7s印2^as印4四突变体的表型非常相似。由于0SM8M株系的心皮产生了强烈的突变，为了更加细致地观察其表型变化，我们进行了扫描电镜分析。一个空载体对照小穗的心皮由子房、花柱和两个羽状柱头组成，心皮内发育一个胚珠，花分生组织由于形成胚珠而被耗尽。在E类基因沉默的转基因小穗中，小花分生组织没有因形成心皮而失去分生能力，而是继续进行花器官类结构的分化或转变为花序分生组织。在进行花器官类结构分化时，所形成的花器官大多数类似雄蕊，突破心皮向外生长，与此同时，已经分化的心皮原基继续生长，并逐渐显现出羽状柱头。在小花分生组织转变为花序分生组织时，这些花序分生组织又产生新的分生组织，新的分生组织可能进行枝梗原基及小穗原基的分化，分化的这些器官原基同样突破心皮向外生长。在心皮之外生长的器官原基之间形成的苞毛有力地表明小花分生组织已经转变为花序分生组织(图13E-H)。随着花序分生组织分化的各类器官的生长发育，己经分化的心皮原基生长缓慢，并逐渐停止生长，最终出现了在小穗心皮的位置长出了几个新的小穗的突变表型(图131)，新小穗与空载体对照小穗非常相似。停止生长的心皮处于新花序枝梗的基部，表面仍有茸毛突起，就像苞片一样包着花序基部，在解剖镜下不易观察。有的小穗的心皮随着生长发育，从外观看类似外稃，新的花序从类似外稃的心皮内长出。以上这些突变表型说明E类基因具有小花分生组织决定(detemirmcy)作用。当E类基因突变时，小花分生组织失去了其决定性，继续进行花器官的分化或转变为花序分生组织。由于在解剖镜下观察到0SM8M株系的心皮表面长有茸毛而类似稃片结构，为了证实心皮与桴片间发生了同源异型转换，我们在扫描电镜下对空载体对照心皮、突变型心皮和空载体对照外稃远轴面的表面结构进行了观察。结果表明，空载体对照心皮的表面细胞光滑平整，排列整齐，而突变型心皮的表面细胞略微突起，更加细长，细胞间长有细长的莺毛，并有气孔分布(图13J箭头所指)。这些特点与空载体对照外稃的表面结构类似，说明突变心皮具有了稃片的特征，至少与稃片间发生了部分同源转换。所有转基因株系中小花结构的统计表如表l。(3)石蜡切片观察突变心皮的内部结构随着生长发育，空载体对照心皮内部形成一团具有分裂活性的细胞，称为珠心组织。在珠心组织产生孢原母细胞的同时，内外珠被原基开始在胚珠原基四周形成突起(图14A、B)。在E类基因沉默的突变小穗中，花分生组织在分化出心皮原基后继续进行花器官类结构的分化或转变为花序分生组织，心皮内部是否形成了有分裂性的珠心组织，我们进行了正中石蜡切片观察。在0SM8M株系的心皮内部是一些难以鉴别的组织结构，有的似乎是珠被，但珠心没有进一步分化(图14C，D);有的是一些片状类结构，可能是以后长出的类似稃片的器官(图14E-G)，有的在心皮顶部产生了明显的花分生组织(图14H)。总之，没有看到正常的胚珠结构。说明E类基因对于胚珠的正常发育至关重要。0SM71株系的心皮尽管发生了各种变异，但内部组织结构与空载体对照(图15A)相比还是基本正常的，能够观察到珠被、珠心等结构(图15B-C)。有些柱系的心皮完全不闭合的，从中又长出新的心皮状结构，其内部也能观察到珠被、珠心等结构(图15D)。但内部的大孢子细胞的分化是否正常还需要进一步的观察。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>a:-,正常；+十，内稃叶片状；b:-，正常；+，外稃与空载体对照相比细长；C:-，正常；+，浆片薄膜状++，一枚^片呈内稃状；+++，浆片叶片状；d:-，正常；+，雄蕊与空载体对照相比细长+++，雄蕊消失或转变成叶片状；e:-，正常；+，心皮呈绿色稃片状，部分融合并有2-4个畸形的花柱。++,心皮不融合，花柱和柱头消失，多心皮状结构；+++,心皮变成叶片状结构；f:-/种子正常；+，心皮内器官结构异常；++，心皮内长出雄蕊或心皮状器官；+++,不正常的花穗。g:育性受到影响。注每个株系分析200个以上的小穗。(4)基因的功能单独的特异性抑制^湖"67或ft鹏"5^基因的表达后，转基因株系没有任何表型，这说明E类基因存在着功能冗余；当同时抑制&#4"57和fla紛/5W基因时，转基因水稻株系产生明显的表型改变。主要表现为植株矮化，晚花，内三轮花器官都带有了部分稃片化的特征，并丧失了花分生组织的决定性。当同时抑制5个5^,like基因flsi^Z67,fe鹏"57，fe湖/5^和化淑"5^时，导致所有花器官都变成叶状结构，同时失去了花分生组织决定性，在花的中心顶端形成新一轮花器官或花分生组织转逆转为花序分生组织。这与拟南芥中s印7s印3s印4四突变体的表型是类似的，水稻中不同5B产like基因的mRNA吋空表达和蛋白互作模式都是高度相似的，只是基因功能的特异性有区别，这表明了5^/Mike基因在花分生组织特异性和花器官决定性中具有功能的保守性，而且说明fl朋A57和fls朋"5^基因很可能是拟南芥的527^1ike基因在水稻中的直系同源基因，它们在水稻花发育过程中起了重要作用。同时，也揭示了单子叶植物E类基因特异的新功能或亚功能化，揭示了5S^like进化的动态性和多样性。二、基因功能的验证为了证明转基因株系的表型是由目的基因受到抑制而引起的，我们设计了一系列的验证实验1.检测外源基因是否己经转入水稻体内并成功表达我们对抑制了E类基因的转基因株系叶片中外源基因的转录进行了Northern杂交分析，结果在4个转基因株系中出现了长度不等的RNA片段，而在空载体对照植株中没有信号，说明由RNAi载体导入并已整合在基因组中的外源基因的反向重复序列发生了转录，并且在体内形成了双链RNA结构，被剪切后产生了大小不等的RNA片段(图16)2.验证目的基因的表达是否被成功抑制为了验证已成功转入体内并被降解的小RNA是否寻找了到目的基因并对它们进行了有效的抑制，我们用不同方法对目的基因的表达进行了检测。同时抑制E类基因(&J//^57,fe，鹏"5^fe鹏"57和fls紛"5^基因)的0sM8M株系共有26株，我们对其中的5株进行了RT-PCR检领U。结果5个E类基因fla紛/^9、&#力仍7、fls鹏"5厶fls必JZ6^和(^i/^ftS"^的转录比对照显著减少(图17)，说明这些基因的表达受到了抑制。其中6^鹏flSW减少的程度略低一些。根据序列比较分析，6te柳/^^基因序列与双链RNA干涉序列相比，大于21bp完全相同的区域仅有一24bp区域，明显比其他几个基因匹配的区域短，有可能在体内小RNA与目标基因0#^^<^结合的机会更少一些，所以受到降解的程度低一些。以上结果表明，转基因株系产生的强烈突变表型就是E类基因被抑制的结果，说明了这类基因在花发育中起着重要的作用。对转基因株系进行了real-timePCR的检测，图18中CK为空载体对照。结果显示0sM8M株系中fc細Z57,fla)/AaS7和基因表达水平显著下降(图18A)，同时抑制flsv^"57和O湖"幼基因的0sM71株系也检测到了fts鹏/57禾Q&#^05^基因表达水平的明显下降(图18C)，这两个株系都观察到明显的表型异常，以上结果说明了转基因株系表型的出现和基因的改变是密切相关的，E类基因功能的缺失是导致表型改变的主要原因。对特异抑制(&^"57基因的0sM7C株系和特异抑制《5#^5^基因的0sM8C株系的基因表达情况的检测结果显示6te#7r(09#D株系转基因植株在&朋/67(fls細ZD基因的表达被抑制后，(fls鹏Z幼)基因的表达有着显著下降，但是fls紛"55(&掘ZWT)基因依然正常转录，并且同其他几个E类基因一样，表达水平还有一定程度的升高(图18B,C)，弥补了ftsi^/57(&鹏"550基因的功能缺失，直接的结果可能导致了单基因突变没有任何表型变化，证明tfe細"67和foi^5"S基因在功能上存在一定的冗余。3.检测目的基因的表达受抑制的同时，其他相关基因(B类和C类基因)的表达是否受到影响花发育的"ABCDE"模型中，内三轮花器官的正常发育过程中除了E类基因的之外，还需要B类和C类基因的参与。为了检测转基因水稻中B类和C类基因表达水平是否受到了影响，对两类不同的转基因株系中的B类基因(6te紛"5"力禾tlC类基因(&蒯"5^和fls細Z^5S)表达水平各选取了两株系进行了RT-PCR检测。结果表明与空载体对照水稻相比，在转基因水稻株系中，B类和C类基因表达水平基本保持不变，并没有受到明显影响(图19)。4.原位杂交方法检测6te紛AS7和&测"5基因表达模式的差异为了确定水稻5S^like基因在花和胚胎发育过程中的时空表达方式，我们对和^y^"57基因进行了详细的组织原位杂交检测。新鲜材料在FAA固定液(50%乙醇，5%醋酸，3.7%甲醛)中，4'C固定14-28小时，经过乙醇脱水和二甲苯透明后，包埋到石蜡中，将蜡块修整后切成lO-Wn厚的蜡片并粘贴到载玻片上，42'C烤片后进行脱蜡复水前处理，然后用基因的特异序列作为探针，地高辛标记后进行杂交，杂交完成后进行显色并用SSC洗液进行系列洗脱，封片照相。结果表明&#^^的1^離最初在枝梗原基表达，随着小穗原基的形成，又集中在小穗原基。在小穗原基分化颖片、内外稃片后，fe，鹏/y《RNA的转录定位在小花分生组织原基。己分化的颖片和稃片没有表达。在雌雄蕊开始分化，内、外稃片合拢之前，集中在浆片、雄蕊和心皮表达，这种表达方式一直持续到花发育结束(图20A-B)。说明tts湖Z5^基因确实参与了花器官的发育。0蒯"57基因的表达方式与fei^Z^9相同，只是表达的开始时期要比0鹏"5^晚，结果显示0#力/^基因首先在一级分支原基处检测到信号(图20A-B);而此时^fe紛"57并没有检测到表达信号(图201-J)。在二级分支原基分化后，fe^"5"《基因强烈表达(图20C),此时tts厕"67只有较弱的表达(图20K)。在小花原基时期fe細"5"《的表达信号也比^船/^7强(图20E，N)，随着小花的逐渐发疼，两个基因都特异的局限于内三轮花器官表达(图20E-H,N-Q)，在成熟的小花中，二者都只在生殖器官雌蕊和雄蕊中表达(图20H,Q)。5.水稻E类蛋白之间的互作模式研究——酵母双杂交和Co-IP分析为了更进一步的理解E类基因的功能，尤其是它们在蛋白质水平上是如何发挥调控功能。试验中对五个E类蛋白0sMADSl、0sMADS5、0sMADS7、0sMADS8、0sMADS34和D类蛋白0sMADS13间的相互作用差异，用酵母双杂交系统和Co-IP的方法对这些重要MADS-box蛋白间的相互作用能力进行一系列检测。'Cte細/^/,tfe崩"57和Os柳flSy基因的全长cDNA序列分别用特异引物扩增后用Afco1/I或1/AWeI酶切后连接到pGADT7和pGBKT7载体上，构建成酵母双杂载体pAD-0sMADS1,pAD-0sMADS7，pAD-0sMADS8，pBD-0sMADSl，pBD-0sMADS7禾卩pBD-0sMADS8。然后将这些载体的不同组合后用LiAc介导的方法转化到酵母菌株AH109中，制备成不同的双质粒组合，在确认单质粒菌没有自激活活性和自身毒性的检测后，即可在四缺筛选培养基(SD-His-Leu-Trp-Ade+5mM3-AT)上对已转化了双质粒的酵母细胞进行相互作用能力检测。如果在四缺培养基中能生长，说明有相互作用，否则没有互作。多肽标签可以在活细胞体内定位基因产物，鉴定与其相互作用的蛋白，追逐目标蛋白的迁移。这些很小的肽标签不会与融合蛋白发生干扰。使用最为广泛的有多聚精氨酸，FLAG-，多聚精氨酸-，c-myc-，S-和Str印II-tag等。我们选用pCMl307-6Xmyc和pRT105-3Xflag为母载体。构建了八个原生质体转化融合载体载体pCM1307-6Xmyc-Osl/5/7/8和pRT105-3Xflag-Os1/5/7/8。使用不同组合的融合质粒共转化拟南芥叶肉细胞原生质体，分别用anti-MYC和anti-FLAG检测转化结果，当共转成功时，即可进行免疫共沉淀的分析。结果表明0sMADS7和0sMADS8蛋白有相似的互作模式。OsMADS7和OsMADS8蛋白都能自身作用形成同源二聚体(图211,M)，二者也都可以和OsMADSl互作形成异源二聚体(图21C，D,J,N)。OsMADSl蛋白自身也存在较弱的作用(图21A)。当OsMADS7和BD融合，OsMADS5和AD融合时，0sMADS7和0sMADS5能相互作用形成异源二聚体(图21K)，在其他条件下，0sMADS5不与其他E类蛋白包括自身相互作用形成二聚体。0sMADS8蛋白和0sMADS13蛋白可以形成异源二聚体作为阳性对照(Favaroets7.，2003);质粒空载体组合为阴性对照。Co-IP分析得到了相一致的结果(图22)。6、基因沉默的结果分析在控制花发育的MADS-box基因中，E类基因的功能最为复杂，根据对双子叶植物的研究结果，它参与了所有花器官的发育并对花分生组织的决定性起作用。在单子叶植物中，根据已克隆基因的表达模式和系统发育分析认为，E类基因比其它MADS-box基因的功能发生了更大的变异。水稻是单子叶植物的模式植物，我们对水稻中E类基因尤其是和^細"5^两个基因的表达模式进行了更进一分析，同时利用RNAi技术对其功能作用迸行了研究。得到以下结论1)0sMADS7和0sMADS8基因共同参与水稻内三轮花器官的发育，二者既有很大程度的功能变异又存在明显的功能冗余我们的研究证实无论是单独抑制OsMAZ^《还是Qs^^S7的表达水平，都不能引起转基因水稻株系花器官结构明显的表型改变。当同时抑制&#/1"57和fei^AW基因时，转基因水稻株系产生明显的表型改变。同时，原位杂交的结果也表明6fe紛"57和6fe^AW表达模式非常类似，这就证明两个基因功能很可能存在很大的重叠(功能冗余)，其中某个单基因的表达缺失会被另一个基因的表达所弥补，因而不能表现出明显的表型改变，但是从原位杂交的结果来看，二者的表达模式又有所差异，说明二者存在一定的功能变异。当同时抑制ft崩"57和^i^Z5^基因时，转基因水稻株系主要表现为植株矮化，抽穗期延迟，内三轮花器官的发育受到严重影响浆片转变为稃片类的结构，雄蕊没有花粉，心皮具有了稃片的特点，同时失去了花分生组织决定性，在花的中心顶端形成新一轮花器官。然而，通过对转基因水稻内源E类基因和B、C类基因表达量的real-timePCR和RT-PCR分析，证实转基因水稻株系中RNAi介导的fe朋"57禾卩&朋"5"《表达水平显著下降，但是内源B、C类基因表达并没有受到影响，这说明花器官异常表型的出现是由E类基因表达水平变化而引起的。而表型又仅限于内三轮花器官的变异，因此，我们认为，fe^4"57和&#力"5基因参与了水稻内三轮花器官发育的调控，并且这两个基因存在明显的功能冗余。2)ft鹏"57和0朋/^9的表达水平影响水稻花分生组织的决定性E类基因的功能一方面是参与花器官的发育，另一方面是具有花分生组织决定性。拟南芥中s印V^/三突变体失去了花分生组织决定性，出现了花中生花的突变表型，这种表型与ag和SA强突变体类似(Coen"s丄，1990;Pelazeta义，2000)。在水稻中，E类基因&掘"57缺失突变体表现出内三轮花器官(包括浆片、雄蕊和，心皮)同源转化为内稃和外稃类结构，并且这样基本的变形结构重复出现在同一朵小花中心位置的花梗上，说明花分生组织决定性的丧失。我们的研究也发现，在沉默E类基因的水稻转基因水稻小穗中花分生组织决定性丧失，导致小花中心位置不以最终形成胚珠而结束分化，而是继续进行花器官类结构的分化或转变为花序分生组织，花序分生组织产生新的小穗。在同时抑制&朋"57和fla紛"5^的转基因水稻中，它的内三轮花器官发生了明显的表型改变，同时也在不闭合的心皮内又长出新的雄蕊状和心皮状结构。这表明，在转基因水稻小花的花分生组织决定性一定程度上丧失了，而导致小花最中央位置继续保持分生能力，分化出新的花器官类结构。3)水稻中^崩i57和ft崩Z5S基因是拟南芥中E类基因的直系同源基因在"ABCDE模型"中，E类基因参与了萼片、花瓣、雄蕊和心皮包括胚珠的发育的过程。双子叶植物拟南芥中的5E^/2/J/么矮牵牛中的faW和番茄中的7￥5是最早研究并获知其功能的典型E类基因。在拟南芥巾，5^P单基因突变体都不能引起明显的表型改变，而s印7//三突变体的花内三轮花器官转变为萼片，第四轮花器官由只有萼片组成的新花取代，显示花分生组织决定性的丧失(Pelaz"a丄，2000)。这与我们所观察到的转基因株系的表型是相似的，说明水稻中的E类基因与拟南芥中^S^尸基因相比存在功能的保守性，从进化分析上来看，二者的亲缘关系也比较近。纵上所述，我们的研究结果表明Cte鹏/^7和fls厕"5^基因是拟南芥的5^,like基因在水稻中的直系同源基因，它们在水稻花发育过程中起了重要作用。实施例2、基因的过表达一、基因的过表达1、过量表达载体的构建为了便于在转基因植株蛋白水平的检测，我们在6teWAW编码区前面或后面融合了MYC-FLAGtag;Ubiqutin启动子是一个在单子叶植物中有较强表达的启动子，实施例2用的Ubiqutin启动子是实施例1制备的启动子。我们选用该启动子从而构建了两个0i/AftW过量表达载体pU1301MF0s8和pU13010s8MPF(图24)。根据fe湖"5^序列设计引物H8F和H8R，正向引物H8F在起始密码子前面弓|物引入feaHI位点，序列为5'-ACTAggAI^ATggggAgAgggAgggT-3';H8R反向引物，将^湖/^《序列中的终止密码子TGA突变成了ATC(lie)并引入C7aI位点，序列为5'-CAgg^g^gggTAgCCATgTCggCA-3'。载体构建过程如下方所示。最终载体测序验证读码框的正确性。pU1301MFOs8的构建过程将35S::MCS::polyA表达框(GenBank:X05868.1，MCS:多克隆位点来自载体pBluescriptIIKS(+)(Stratagene公司，美国))插入到pUC19载体(TaKaRa宝生物公司，中国大连)构成表达载体pUC35s。将MYC-FLAGtag(GAGCTCATGGAACAGAAACTGATCAGCGAAGAGGATCTGGACTACAAGGACGACGACGACAAATCTAGA)利用5"acl和插入到表达载体pUC35s得到载体pUC35sMF。&力1单酶切载体pUC35sMF，得到35s::MF::polyA表达框，将其l禹入pGEM-TEasy载体(promega公司，美国)得到中间载体pTe-MF35s中间载体。用5孕HI和酶切pTe-MF35s中间载体，补平并自连得到pTe-MF(b+x)35s载体。利用5"scl和fcoRI酶切pTe-MF(b+x)35s载体，将得到的片段插入到pCAMBIA1301载体(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriclture,www.cambia.org)，得到pl301MF(b+x)载体。利用和feaHI将UBi启动子插入pl301MF(b+x)载体，得到pU1301MF载体。以pTEfc湖Z5^(RACE方法得到的Os細Z6^基因全长片段插入pGEM-TEasy(promega公司，美国))载体为模板，以H8F和H8R为引物，扩增得到ftsi^Z^《的编码区序列利用5a/rfH和67sl双酶切，插入pTe-MF35s载体，得到pTe-MF0S835s载体。用/Vafel单酶切pTEfeifW"6^和pTe-MF0S835s载体，分别回收小片段和大片段，将其连接而成pTeMF0s8中间载体。将利用单酶切质粒pTeMF0s8获得的&#^"<编码区，连入pU1301MF载体，挑选正确方向连入的质粒，得到最终表达载体pU1301MF0s8。pU13010s8MPF的构建过程将MYC-FLAGtag(GTCGACATGGAACAGAAACTGATCAGCGAAGAGGATCTGGACTACAAGGACGACGACGACAAAGGTAAC)利用5"aZt和,/ml插入到表达载体pUC35s,得到载体pUC35sMPF。Sp/I单酶切载体pUC35sMPF，得到35s::MPF::polyA表达框，将其插入pGEM-TEasy载体(promega公司，美国)，得到中间载体pTe-MPF35s中间载体。以pTEfts鹏"5S(RACE方法得到的Os鹏Z^《基因全长片段插入pGEM-TEasy(promega，美国)载体)为模板，以H8F和H8R为引物，扩增得到0#力/^《的编码区序列利用5s』1和Gsl双酶切，插入pTe-MPF35s载体，得到pTe-OS8MPF35s载体。利用5a/dH和fcoRI酶切pTe-0S8MPF35s载体，将得到的片段插入到pCAMBIA1301载体，得到pl3010s8MPF载体。利用范"dIII和fe州T将UBi启动子插入pl3010s8MPF载体，得到最终表达载体pU13010s8MPF。对照载体的构建将35S::MCS::polyA表达框(GenBank:X05868.1，MCS:多克隆位点来自载体pBluescript丄lKS(+)(Stratagene公司，美国))插入到pUC19载体(TaKaRa宝生物公司，中国大连)构成表达载体pUC35s。将MYC-FLAGtag5"acl和J力al插入到表达载体pUC35s得到载体pUC35sMF。单酶切载体pUC35sMF，得到35s::MF::polyA表达框，将其插入pGEM-TEasy载体(promega公司，美国)得到中间载体pTe-MF35s中间载体。用fez*I和屈ol酶切pTe-MF35s中间载体，补平并自连得到pTe-MF(b+x)35s载体。利用fecl和fcoRI酶切pTe-MF(b+x)35s载体，将得到的片段插入到pCAMBIA1301载体(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriclture,www.cambia.org)，得至Upl301MF(b+x)载体。禾U用析/dl11禾口5arfil将UBi启动子插入pl301MF(b+x)载体，得到对照载体pU1301MF载体。2、转基因植物的获得将构建好的两个表达载体pU1301MFOs8、pU13010s8MPF和对照载体pU1301MF用电击法转入农杆菌EHA105中，用Agrobacteri咖-mediated转化方法导入水稻中花11号幼胚愈伤组织，经两次潮霉素筛选后，获得的抗性愈伤组织块，转到分化培养基，最后得到转基因小苗，壮苗期，做GUS组织染色，呈阳性结果的小苗移栽室外桶内。转pU1301MF0s8、pU13010s8MPF和pU1301MF株系分别称为MF0s8、0s8MPF和pU1301MF株系(表2)。pU1301MF株系是空载体对照，命名为WT。表2转基因株系统计株系名称再生苗株系数GUS阳性苗株系数百分比MFOs8823340Os8MPF543666pU1301MF82253、过表达转基因水稻的分子鉴定1)基因组DNA的GUS基因片段的检测采用CTAB法提取WT、MF0s8、0s8MPF株系植株水稻幼嫩的叶(叶片、叶鞘)中的基因组DNA。以T-DNA上35S启动子和GUS基因片段的上游引物p5y35s:5'-CgTTCCAACCACgTCTTCAAAgC-3'和下游引物p3gus:5'-TggCCTgCCCAACCTTTCg-3'为引物，以基因组DNA为模板，作PCR反应检测(图24)。由图可见，WT植株GUSPCR结果为阴性，MF0S8、0S8MPF植株GUSPCR结果为阳性。说明T-DNA已经整合进转基因植株的基因组中。2)转基因植株Os鹏AS"《转录本的RT-PCR检测己报道了Cfe紛Z5^基因在空载体对照水稻的枝梗原基、小穗原基、浆片、雄蕊、心皮和发育的种子表达。我们以WT、MF0s8、0s8MPF株系植株水稻幼嫩的叶(叶片、叶鞘)为材料，Trizol法提取总RNA，用6te紛"5^基因特异引物pC8:5'-CTGGAATTCAGCAACCAGTTG-3';pR8:5'-GGAGTCTCGAGTAGCCATGTC-3'为引物作RT-PCR检测(图25)。结果表明MFOs8、0s8MPF株系都获得了预期大小的条带。基因组PCR和RT-PCR的结果证明了过表达fe,紛"5^载体已整合到水稻基因组并表达。3)收集保存转基因水稻的幼嫩的小穗，液氮速冻，保存在-70。C，用作提取蛋白质的材料。按前所述的方法提取转基因水稻小穗蛋白，进行12%SDS-PAGE。水稻小穗总蛋白经12。/。PAGE胶电泳分离后，电转移到PVDF膜上，用抗FLAG抗体进行免疫杂交，以观察转基因蛋白的表达情况，采用检测辣根过氧化物酶-ECL法显色。结果显示(图25):MF0s8和0s8MPF转基因植株都有预期大小的杂交条带，表明6>&^"5-tag融合基因在转基因水稻中已经正确表达。二、过表达转基因水稻的表型分析1)过量表达《^"5"<9弓I起植株矮化PU1301株系在营养和生殖生长阶段在表型特征上与野生型对照没有肉眼可观察到的差别，MF0s8株系植株相比空载体对照株型矮化。Os腦PF株系植株的表型发生了很明显的改变。0s8MPF株系植株的表型可以分为两大类，命名为0s8MPF-l和Os8MPF-2株系。这两类的共同表型主要表现在叶片深绿色、叶夹角增大植株矮小；分蘖数减少(图27)。Os8MPF-l和Os8MPF-2株系的差别主要在株型方面，虽然二者都表现植株矮化，但二者的矮化类型不同。水稻植株的矮化是节间长度縮短或节间数减少的结果，也可能时两者共同作用的结果。以水稻植株上4节(或5节)间的节间伸长样式不同，可将水稻株型分为N，dn,dm，d6，nl,和sh6种类型。图26为不同类型节间长度占株高的比例示意图(Yama咖ro"s丄，2000)。在水稻中，将紧接圆锥花序的节间定为第一节间，余者类推。将节间比例正常的品种标定为N型。dn类型矮化的特征是节间比例与N型相同，即每节间都按相对比例缩短；dm型的特征是第二节间縮短；d6型的特征是第一节间以下各节间都不同程度的縮短；nl型的特征是有颈叶，第二节间长而第四节间短，偶尔有第6节伸长节间。sh型的特征是第l节间几乎不伸长，穗子包藏在剑叶叶鞘中。由此，我们测量了转基因矮化植株的株高(图28A)和个节间的相对长度(图28B)。MF0s8和0s8MPF-1株系矮化表型，属于dn类型，即每个茎节都相对的縮短；而0s8MPF-2株系属于d6类型。图28中WT是实验室内的空载体对照，WTfield是在野外田间空载体对照。2)过量表达^M^5^引起植株提前开花MF0s8株系植株开花期、花器官结构和空载体对照、野生型对照相一致，没有明显的表型。0s8MP植株开花期大大提前，一般大约提前3-4周(图29)，但是花器官结构没有异常(图30)。由图可见，当空载体对照植株还在营养生长时期时，0s8MP植株已经进入了繁殖生长时期。已有文献报道改变水稻体内BRs的含量或对BRs敏感性可改变水稻的株型。植物激素13Rs在植物的生长发育中发挥多方面的作用。在单子叶模式植物水稻中，分离到许多BRs突变体。通过对这些突变体的研究，揭示了BRs在水稻生长发育中的作用，主要体现在三个方面即茎节的伸长(internodeelongation)、叶夹角的改变(bendingofthelaminajiont)、光形态建成(skotorphogenesis)。由转基因水稻在叶夹角上的表型，我们用半定量RT-PCR方法检测了水稻中和BRs合成或信号转导有关的基因的表达水平的变化，结果如图31。从RT结果看，MF0s8植株BRs合成或信号转导有关的基因的表达水平和空载体对照相比没有变化，而在0s8MPF植株中fls57"/的表达量上调，^服/入&贝7的表达量下调，的表达量基本没变化。0^ffl/、fls"2和fls/^/编码细胞色素P450酶类，参与体内BRs合成途径的晚期步骤；&^//是拟南芥中BRs受体朋Y/的同源基因，编码BRs受体类蛋白激酶。&5///和fl"/7受BRs的负反馈调节。基于0s8MPF植株的株型，特别是转基因植株的叶夹角的增大，我们推测在转基因水稻中BRs的作用被加强了。fei^Z5^的过量表达，引起BRs合成基因6te^W的表达量的升高，转基因水稻体内的BRs含量增加，增大了植株的叶夹角，BRs含量增加又负调节了其他BRs相关基因0&^//和a"w的表达量的下降。本研究过量表达&#^/^转基因植株产生了早花和矮化的表型。同时，利用RNAi技术同时沉默fl5細Z57和^鹏"6^两个基因或者同时沉默fts鹏"57、ft柳Z615、fts紛Z57和四个基因的转基因植株开花期明显延长。表明水稻中like基因参与了开花时间调节的基因调控网络。过量表达like基因引起的植株矮化，认为是因为提前开花，而影响了体内的激素水平的结果。早花和矮化是重要的农艺性状。营养生长和生殖生长的平衡状态在很大程度上影响着作物的产量。利用矮化基因提高农作物的性状已经有实际应用。过量表达5^P-like基因可能会诱导开花相关基因的表达，从而缩短开花时间并产生矮化表型。目前，虽然具体机制还不清楚，但这个机制在不同的植物体中是保守的。利用组织特异启动子或诱导型启动子驱动5X7Hike基因在转基因植物中的表达，会增加在实践中应用的前景。序列表〈110>中国科学院植物研究所〈120>—种培育花器官败育的水稻的方法及其专用DNA片段<130>CGGNARL92485<160>3〈210>1<211>286<212>腿〈213>水稻(0;^^加Va)〈400〉1ccgcggcaagctctacgagttctgc已gcggccaaagcatgaCC3g33Ctt603gtt3tggtgggccagatactgcaMacagatgagttagt120gC3犯gC3gCCgC犯tg3gtg3鄉C3Cgggtggaaaattt3C3gagg3C180cc33aggaatcttcttggtg犯gatcttgggacacttggcataaaagBgctagagc已gct240tgagaaacaBcttgattcatccttgaggcacatt8g已tcc286〈210〉2〈211〉199〈212〉腿<213〉未知〈220〉〈223〉<400〉2gtacggaccgtatagaggc已ttccacttaatactactctatctttattatattat3ta^gttcgtttxaatatatttatttttaaattttgtgtcactcaacat已ttctcgattatatattgtttcsgctgsctgcaag已60120180199〈210〉3〈211〉266〈212〉DNA<213〉7jC稻(O拜似细)<400〉3caggcaggtgacgttcgcgaagcggaggaatgggctgctcaagaaggcgtacgagctctc60cgtgctctgcgacgccgaggtcgccctcatcatcttctccaaccgcggcaagctctacga120gttctgcagcggccaaagcatgaccagaactttggaaagataccaaaaattcagttatgg180tgggccagatactgcaatacagaacaaggaaaatgagttagtgcaaagcagccgcaatga240gtacctcaaactgaaggcacgggtgg26权利要求1、一个DNA片段，由基因片段A、B和C依次连接组成；所述基因片段A的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述基因片段A与基因片段C反向互补；所述基因片段B是内含子。2、根据权利要求1所述的片段，所述内含子的核苷酸序列是序列表中的序列2。3、含有权利要求1或2所述DNA片段的重组载体、转基因细胞系或重组菌。4、根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述重组载体的构建方法如下将权利要求1或2所述的DNA片段插入质粒pU1301的多克隆位点，得到重组载体；所述质粒pU1301是将Ubi启动子插入pCAMBIA1301质粒上的历/7dIII和S』I酶切位点之间得到的重组质粒。5、一种培育花器官败育的水稻的方法，是将权利要求3或4所述的重组载体导入水稻中，得到重组水稻。6、一个DNA片段，由基因片段D、E和F依次连接组成；所述基因片段D的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述基因片段D与基因片段F反向互补；所述基因片段E是内含子。7、根据权利要求6所述的片段，其特征在于所述内含子的核苷酸序列是序列表中的序列2。8、含有权利要求6或7所述DNA片段的重组载体、转基因细胞系或重组菌。9、根据权利要求8所述的重组载体，其特征在于所述重组载体的构建方法如下将权利要求6或7所述的DNA片段插入质粒pU1301的多克隆位点，得到重组载体；所述质粒pU1301是将Ubi启动子插入pCAMBIA1301质粒上的〃//dIII和I酶切位点之间得到的重组质粒。10、一种培育花器官败育的水稻的方法，是将权利要求8或9所述的重组载体导入水稻中，得到重组水稻。全文摘要本发明公开了一个DNA片段，由基因片段A、B和C依次连接组成；所述基因片段A的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述基因片段A与基因片段C反向互补；所述基因片段B是内含子，所述内含子的核苷酸序列是序列表中的序列2。本发明还公开了含有该片段的重组载体，将该载体导入水稻后得到花器官败育的水稻。具体地讲，当同时抑制OsMADS7和OsMADS8基因时，转基因水稻株系产生明显的表型改变。主要表现为植株矮化，晚花，内三轮花器官都带有了部分稃片化的特征，并丧失了花分生组织的决定性。文档编号C12N15/11GK101629176SQ20091009054公开日2010年1月20日申请日期2009年8月19日优先权日2009年8月19日发明者凤吴,征孟,崔荣峰,赵素珍,韩加坤申请人:中国科学院植物研究所