专利名称：一种酶催化一锅法合成青霉素类抗生素的方法
技术领域：
本发明涉及青霉素类抗生素的制备方法，尤其涉及一种在含少量水的 有机溶剂/緩沖盐介质中酶催化一锅法合成青霉素类抗生素的方法。
背景技术：
目前，工业上半合成的青霉素类抗生素如氨爷西林、阿莫西林、头孢 克洛、头孢氨节及头孢羟氨节都是通过化学方法制备的，反应过程中涉及 到侧链的保护、羧基的活化、缩合反应和侧链的去保护等众多化学反应步 骤，因此生产过程中三废排放量大，严重污染环境。
近几年来，已有很多文献报道采用酶法来制备卩-内酰胺抗生素，该
方法的突出优点是反应步骤少，条件温和，能耗低，同时避免使用各种 保护试剂和有毒溶剂，对环境的污染小。
在酶法合成p -内酰胺抗生素的研究取得一定的进展以后，人们开始 关注合成效果上的提高，特别是合成产率与合成水解的比值这两个方面的 提高。
J. Mol. Cat. B: Enzym.中报道了 一种在有机溶剂/水的双相体系中酶促
合成头孢唑啉的方法(J. Mol. Cat. B: Enzym. 2000, 9， 275 )。其中，乙酸
乙酯和四氯化碳的引入能够有效地抑制产物和原料的水解从而提高了合 成的产率和合成水解比值。
专利申请WO 9920786中公开了一种酶促合成头孢菌素的方法，将底 物母核通过pH调节，使其达到过饱和浓度，在青霉素酰化酶作用下，与 相应侧链酰胺缩合，得到产品。这种方法比不将底物母核调到过饱和浓度， 转化率高10%左右，但是其侧链与母核摩尔比不大于2.5。
美国专利US 6048708中公开了一种酶促合成卩-内酰胺抗生素的方法，该方法使抗生素母核与酰基供体的浓度在反应过程中 一直保持在一个
比较高的水平上(饱和浓度的70%甚至85%以上)，反应至少5个小时， 能够提高母核的转化率。
J, Chem. Technol. Biotechnol.中报道了在氨节西林的合成当中引入乙 二醇作为混合溶剂，改变了原料的pKa值达到抑制水解的效果从而提高了 合成的产率(J. Chem. Technol. Biotechnol. 2003， 78， 431 )。
另外，专利CN 1265706， CN 1144274， CN 1572873, WO 9704086 和US 5525483分别公开了涉及到水溶液介质中高底物浓度下，以及新的 固定化青霉素G酰化酶催化下合成(3 -内酰胺抗生素的方法。
在上述方法中，用于合成青霉素类抗生素的原料基本上都是青霉素的 母核，具体地说就是采用6-氨基青霉烷酸(6-APA)作为反应的起始原料。 这种原料一般是通过酶法或者化学方法裂解青霉素来得到的，其反应式可 表示如下
裂解所得的6-APA通过结晶分离以后才能够作为原料用于下游的合 成，会增加整个酶法合成的步骤。
一锅法合成是近年来化学合成研究的热点之一 ，如能将一锅法合成51 入到P-内酰胺类抗生素酶促合成中可以有效地避免中间产物(抗生素母 核)的分离而直接将其原位应用于下游的合成，这样就能够明显简化整个 合成过程，降低成本。
Tetrahedron. Lett中报道的新型化学酶法合成头孢唑啉的方法 (Tetrahedron. Lett. 1997， 38, 4693 )，以头孢菌素C为起始原料，在水溶 液中，经三步酶法和一步化学法合成头孢唑啉，不需要分离纯化中间体， 每步酶法的收率接近100%。
Biotechnol. Bioeng中报道了两步 一锅法制备头孢氨节的方法
5(Biotechnol. Bioeng. 2002， 79, 356 )，将1 ， 5-二羟基萘加至反应液，与头 孢氨节一起结晶，这使头孢氨节浓度很低，避免了水解，收率为79%。
中国专利200510011635.2中公开了一种在水或水/醇的混合介质中采 用"一锅法"合成P-内酰胺类抗生素的方法，采用水或含大量水的水与醇混 合物(其中水的重量百分含量为50- 100%)的均相反应体系来实现卩-内 酰胺类抗生素的合成，取得了一定效果。
但是上述方法中由于反应体系含的水量较大，反应过程中酰基供体侧 链和产物的水解仍然难以控制，产率有待于进一步提高。
发明内容
本发明提供了 一种在含少量水的有机溶剂/緩沖盐介质中酶催化一锅 法合成青霉素类抗生素的方法，该方法简单、产率高、副产物少。
一种在有机溶剂/緩沖盐介质中酶催化一锅法合成青霉素类抗生素的 方法，包括将结构式(II)所示的化合物、结构式(IV)所示的酰化试 剂、緩沖盐水溶液和有机溶剂混合构成反应体系，加入青霉素酰化酶后在 5 55。C反应10~48小时，制得结构式(I)所示的青霉素类抗生素；其 反应方程式如下
RCONHi
-s,
NH2
R2 IT 严2 H
(IV) IV
青霉素酰化酶 o<
eQQRl水/有机溶剂 fc00H (II) (I>
其中，R为苄基；
Ri为金属离子、氢、C「Q烷基、未取代的烯基、取代的烯基、4~ 6元环基或4 ~ 6元杂环基；
R2为未取代的6元环基、取代的6元环基、未取代的6元杂环基或取 代的6元杂环基；
R3为C广C4烷氧基、氨基、氧乙烯基、烷基取代氧乙烯基或肟基。
6作为优选，R^中，所述的金属原子为钾、钠或锂； 所述的C广C4烷基为曱基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁 基或叔丁基；
所述的取代的烯基为l-氯-丙烯基； 所述的未取代的烯基为乙烯基、丙烯基或l-丁烯基； 所述的4 ~ 6元环基为苯基或对羟基苯基；
所述的4 6元杂环基为1，2,3-三唑基、5-甲基-l，3，4-噻二唑-2-基硫亚 曱基或1,2，3-三唑-4-基^ 危亚曱基。
R2为苯基或对羟基苯基。
R3中，烷基取代氧乙烯基为异丙烯氧基； 將基为丙酮將基。
所述的有机溶剂在反应体系中的体积百分含量为50%~98%，优选 80%~98%。由于增加有机溶剂的含量有助于增加反应底物的溶解性，同 时少量水存在的有机溶剂/緩沖盐体系能够有效地提高酶的活性，利于反应 进行，提高产率。
所述的有机溶剂选自C广Q的一元醇、乙二醇、丙三醇、二曱基亚 砜、N, N-二甲基曱酰胺、二氧六环、曱酸乙酯、乙酸曱酯、乙酸乙酯、 乙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸庚酯、乙酸癸酯、Q Cu)烷烃、环己烷中的 一种或多种。
所述的C广C8的一元醇优选异丙醇、叔丁醇、叔戊醇、2， 2-二曱基 -l-丙醇、2-甲基-l-丙醇中的一种或多种。
所述的緩沖盐水溶液用于控制反应体系的pH值为6~10。用緩沖盐 水溶液可以直接控制反应体系的pH值，不必在反应过程中重新对反应体 系的pH值进行调节，方便操作且更利于反应的进^f亍。
所述的緩冲盐水溶液可选用本领域常用的緩冲盐溶液，如磷酸盐緩冲 溶液、草酸钠-柠檬酸緩沖溶液、三羟曱基氨基甲烷(Tris)-盐酸緩沖溶液、 硼砂-硼酸緩沖溶液、广泛緩沖盐溶液或巴比妥-盐酸緩沖盐溶液；其中， 盐类含量不超过100mmol/L。由于本反应体系中水含量较低，盐类含量超的广泛緩冲盐溶液，其主 要成分为柠檬酸、巴比妥钠和硼酸。结构式(II)所示的化合物与结构式(IV)所示的酰化试剂用量满足 化学反应方程的摩尔比即可， 一般结构式(IV)所示的酰化试剂的用量可 适当加大，以使结构式(II)所示的化合物反应完全，为了保证酰化试剂 能够得到更经济合理的利用，节约成本，结构式(II)所示的化合物与结 构式(IV)所示的酰化试剂的摩尔比优选为1: 1 ~ 10。结构式(II)所示的化合物在反应体系中的含量优选为50 - 800 mmol/L。若含量低于50mmol/L，反应体系中底物浓度过低，产率较低， 酰化试剂水解严重。若含量高于800mmol/L,反应体系中底物的溶解度降 低，不利于该反应的进行。本发明方法中反应原料及生成的反应物，在反应体系中有部分是以固 体的形态存在的，在一些情况下反应期间的反应混合物将是桨液，反应混 合物中的工业盐和酰化试剂在溶解状态和任意的沉淀状态下的总含量，通 常维持在某一浓度，这样做是防止反应混合物的粘度变得太高导致反应的 效果变差。因此，在本发明中，最好是保持工业盐和酰化试剂在溶解状态 和任意的沉淀状态下的总含量都不超过800mmol/L反应体系，优选是不 超过300mmol/L反应体系。本发明方法使用的青霉素酰化酶选用本领域合成青霉素类抗生素常 用的青霉素酰化酶即可，可采用市售的游离或固定化的青霉素酰化酶，优 选固定化的青霉素酰化酶，例如湖南福来格生物技术有限公司生产的商品 名为固定化青霉素G酰化酶IPA-750的酶。所用的青霉素酰化酶一般是以 大肠埃希氏菌、马氏醋杆菌、柑桔黄单胞菌、巨大芽孢杆菌或粪产4^菌为 出发菌制得的。通常地，本发明方法中的反应温度优选10°C~45°C,反应时间优选 10 ~ 24h,以便合成反应取得更加满意的效果。适宜的酶浓度通常用活性单位IU (IU == —个酶活性单位)表示，本浓度为10~300 IU / ml反应体系，优选为30 100IU /ml反应体系。酰化试剂由于含有氨基，在化学合成时得到的产物通常都是胺盐，如 盐酸盐或^e克酸盐的形式。本发明采用的酰化剂优选非盐形式的酰化试剂或 按本领域现有常规方法脱盐处理的酰化试剂。本发明反应是以有机溶剂/緩沖盐水溶液作为反应介质，首先结构式 (II)所示的化合物在青霉素酰化酶催化下，水解得到结构式(III)所示 的化合物，然后与结构式(IV)所示的酰化试剂发生酰胺化反应，得到结 构式(I)所示的青霉素类抗生素，反应的过程可以简单表示如下本发明具有如下有益效果(1)直接采用工业上普遍使用的青霉素G及其盐作为反应原料，在 反应的过程中没有进行中间产物的分离和提纯，极大简化了生产工艺，可 以非常有效地减少"敬入，降低生产成本。(2 )本发明方法反应过程中产生的苯乙酸能选择性的抑制青霉素酰 化酶对酰化试剂和产物的水解作用，提高反应产率及合成/水解比值。(3) 与纯水介质的一锅法相比，有机溶剂有助于提高酶合成活性同 时抑制青霉素酰化酶对酰化试剂和产物的水解作用，从而提高产率。(4) 催化剂青霉素酰化酶的回收与重复利用效率高，进一步降低生产成本。
具体实施方式
实施例1在正己烷/緩沖盐体系中以D-苯基甘氨酸甲酯(D-PGM)和青霉素G钾盐制备氨爷西林将6.138克青霉素G钾盐(16.5 mmol)加入到浓度为50 mmol/L的 磷酸二氢钾」畴酸氢二钾緩沖溶液(pH 7.0 )中形成总体积30ml的混合物。 然后，加入3.652克D-PGM (22 mmol), 80ml的正己烷，20克(2400IU) 的青霉素G酰化酶在15。C的温度下进行酰化，反应18小时以后，氨苄西 林的产率达到70%,合成产物氨节西林和水解产物D-苯基甘氨酸的摩尔 比选择性为U: 1。实施例2在正己烷/緩沖盐体系中以D-对羟基苯基甘氨酸甲酯(D-HPGM)和 青霉素G钾盐制备阿莫西林将3.72克青霉素G钾盐(lOmmol)加入到50 mmol/L的磷酸二氢钾 -磷酸氢二钾緩冲溶液(pH 8.0)中形成总体积10ml的混合物。然后，加 入5.46克D-HPGM ( 30mmo1 )， 90ml的正己烷，30克(3600IU)的青霉 素G酰化酶在25。C的温度下进行酰化，反应25小时以后，阿莫西林的产 率达到80%，合成产物阿莫西林和水解产物D-对羟基苯基甘氨酸的摩尔 比选择性为2:1。实施例3在乙酸甲酯/緩冲盐体系中以D-PGM和青霉素G钾盐制备氨苄西林 将3.72克青霉素G钾盐(10 mmol)加入到20 mmol/L的硼砂-硼酸 緩冲溶液(pH 8.0 )中形成总体积5ml的混合物。然后，加入1.66克D-PGM (lOmmol), 95ml的乙酸曱酯,35克(4200IU)的青霉素G酰化酶在30 。C的温度下进行酰化，反应29小时以后，阿莫西林的产率达到85%，合 成产物氨苄西林和D-苯基甘氨酸的水解产物的摩尔比选择性为2.5: 1。实施例4在乙二醇/緩沖盐体系中以D-对羟基苯基甘氨酸乙酯和青霉素G钾盐制备阿莫西林将3.72克青霉素G钾盐(10 mmol)加入到40 mmol/L的硼砂-硼酸 緩冲溶液(pH 7.0)中形成总体积4ml的混合物。然后，加入4.20克0-对羟基苯基甘氨酸乙酯(20mmo1)， 96ml的乙二醇，30克(3600IU)的 青霉素G酰化酶在25。C的温度下进行酰化，反应15小时以后，阿莫西林 的产率达到80%，合成产物阿莫西林和水解产物D-对羟基苯基甘氨酸的 摩尔比选择性为2: 1。实施例5在丙三醇/緩冲盐体系中以D-对羟基苯基甘氨酸甲酖胺和青霉素G钾 盐制备阿莫西林将3.72克青霉素G钾盐(lOmmol)加入到20 mmol/L的磷酸二氬钾 -磷酸氬二钾緩沖溶液(pH 6.5)中形成总体积10ml的混合物。然后，加 入5.43克D-对羟基苯基甘氨酸曱酰胺(30mmo1 )， 90ml的丙三醇，30克 (3600IU)的青霉素G酰化酶，将反应的混合物至于35。C恒温的培养箱 中振荡，反应16小时以后，阿莫西林的产率达到85%，合成产物阿莫西 林和水解产物D-对羟基苯基甘氨酸的摩尔比选择性为1.8: 1。实施例6在二氧六环/緩冲盐体系中以D-对羟基苯基甘氨酸乙烯酯和青霉素G 钾盐制备阿莫西林将3.72克青霉素G钾盐(lOmmol)加入到50 mmol/L的磷酸二氢钾 -磷酸氬二钾緩沖溶液(pH 7.5)中形成总体积10ml的混合物。然后，加 入6.21克D-对羟基苯基甘氨酸乙烯酯(30mmol)， 90ml的二氧六环，40 克(4800IU)的青霉素G酰化酶，将反应的混合物至于29。C恒温的培养 箱中振荡，反应28小时以后，阿莫西林的产率达到78%,合成产物阿莫 西林和水解产物D-对羟基苯基甘氨酸的摩尔比选择性为3: 1。实施例7在乙二醇/乙酸乙酯/緩沖盐体系中以D-苯基甘氨酸曱酯和青霉素G 钾盐制备氨千西林将3.72克青霉素G钾盐(lOmmol)加入到50 mmol/L的三羟曱基氨 基曱烷-盐酸緩冲溶液(pH 7.0)中形成总体积10ml的混合物。然后，加 入4.98克D-苯基甘氨酸曱酯(30mmo1)， 40ml的乙二醇，50ml的乙酸乙 酯，40克(4800IU)的青霉素G酰化酶，将反应的混合物至于2卯。C恒温 的培养箱中振荡，反应17小时以后，氨千西林的产率达到85%，合成产 物阿莫西林和水解产物D-苯基甘氨酸的摩尔比选择性为2.5: 1。
权利要求
1、一种酶催化一锅法合成青霉素类抗生素的方法，包括将结构式(II)所示的化合物、结构式(IV)所示的酰化试剂、缓冲盐水溶液和有机溶剂混合构成反应体系，加入青霉素酰化酶后在5～55℃反应10～48小时，制得结构式(I)所示的青霉素类抗生素；其反应方程式如下其中，R为苄基；R1为金属离子、氢、C1～C4烷基、未取代的烯基、取代的烯基、4～6元环基或4～6元杂环基；R2为未取代的6元环基、取代的6元环基、未取代的6元杂环基或取代的6元杂环基；R3为C1～C4烷氧基、氨基、氧乙烯基、烷基取代氧乙烯基或肟基；所述的有机溶剂在反应体系中的体积百分含量为50％～98％。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的有机溶剂在反 应体系中的体积百分含量为80% ~ 98%。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的有机溶剂 选自d-Q的一元醇、乙二醇、丙三醇、二曱基亚砜、N， N-二曱基曱酰 胺、二氧六环、曱酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸庚酯、乙酸癸酯、C4 d()烷烃、环己烷中的一种或多种。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的d C8的一元 醇为异丙醇、叔丁醇、叔戊醇、2, 2-二曱基-l-丙醇、2-曱基-l-丙醇中的一种或多种。
5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的緩沖盐水溶液为磷酸盐缓冲溶液、草酸钠-柠檬酸緩沖溶液、三羟曱基氨基曱烷(Tris)-盐 酸緩冲溶液、硼砂-硼酸緩冲溶液、广泛緩沖盐溶液或巴比妥-盐酸緩沖盐 溶液；其中，盐类含量不超过100 mmol/L。
6、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于Ri中，所述的金属离 子为钾、钠或锂，所述的C广C4烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、 正丁基、仲丁基或叔丁基，所述的取代的烯基为1-氯-丙烯基，所述的未 取代的烯基为乙烯基、丙烯基或l-丁烯基，所述的4-6元环基为苯基或 对羟基苯基，所述的4 6元杂环基为1,2，3-三唑基、5-曱基-l,3，4-噻二唑 -2-基硫亚甲基或1，2,3-三唑-4-基疏亚曱基；R2为苯基或对羟基苯基；R3中，烷基取代氧乙烯基为异丙烯氧基，肟基为丙酮肟基。
7、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于结构式(II)所示的化 合物与结构式(IV)所示的酰化试剂的摩尔比为1: 1 ~ 10。
8、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于结构式(II)所示的化 合物在反应体系中的含量为50 ~ 800 mmol/L。
全文摘要
本发明公开了一种在有机溶剂/缓冲盐介质中酶催化一锅法合成青霉素类抗生素的方法，包括将结构式(II)所示的化合物、结构式(IV)所示的酰化试剂、缓冲盐水溶液和有机溶剂混合构成反应体系，加入青霉素酰化酶后在5～55℃反应10～48小时，制得结构式(I)所示的青霉素类抗生素；所述的有机溶剂在反应体系中的体积百分含量为50％～98％。本发明酶催化合成青霉素类抗生素方法具有原料易得便宜、反应步骤少、可以有效抑制青霉素酰化酶的水解活性、生产成本低等特点，从而获得更好的酶催化合成青霉素类抗生素方法。
文档编号C12P37/00GK101659977SQ200910152438
公开日2010年3月3日 申请日期2009年9月14日 优先权日2009年9月14日
发明者起 吴, 杜莉莉, 林贤福 申请人:浙江大学