海棠提取物在制备保肝药物或保健食品中的用途的制作方法

专利名称：：海棠提取物在制备保肝药物或保健食品中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及海棠提取物的新用途，具体地，是在制备保肝药物或保健食品中的用途。
背景技术：
：湖北海棠(#W"s/wpe/e"sisRehd.)又名野海棠、野花红、茶海棠。树姿优美、花蕾深粉红，开放后近白色，有芳香。历来被用作观赏植物。可植物庭院、亭边、廊际、草坪绿地，也可盆栽。湖北海棠嫩叶作茶叶饮用已有400多年的饮用历史，是盛夏不可多得的解暑凉茶。果能消食并供酿酒。湖北海棠含有茶多酚、黄酮、Zn、Cr、Mn等多种矿物质等，具有抗菌抗炎、耐缺氧、抗疲劳、降血糖等多种药理作用。目前湖北海棠的文献报道较多，如方荣，等，湖北海棠中根皮苷含量测定，《食品科技》，2008年33巻6期；比较湖北海棠不同部位的根皮苷含量，为湖北海棠的利用提供参考，其报道的方法是采用高效液相色谱法进行根皮苷含量测量。结果湖北海棠嫩枝含量最高，为12.94%;高海拔(1600m)生长的湖北海棠叶中含根皮苷(8.27%),明显高于低海拔(50m)生长的湖北海棠。结论湖北海棠可作为提取根皮苷的植物加以利用。王耀峰，等，湖北海棠叶黄酮类物质提取工艺的研究，《武汉工业学院学报》，2008年27巻2期，通过实验测定了湖北海棠叶中总黄酮的含量，并对湖北海棠叶黄酮提取工艺进行了研究。主要探讨了采用乙醇浸提法提取湖北海棠叶黄酮类物质的最佳工艺条件。实验结果表明湖北海棠叶中总黄酮的含量为4.572%;乙醇浸提法的最佳工艺参数为乙醇浓度50%、料液比1:50、浸提温度6(TC、浸提时间4h。汪鎏植，等，湖北海棠抗大蒜病毒活性研究，《安徽农业科学》，2008年36巻8期，探讨湖北海棠抗大蒜病毒的活性。以湖北海棠提取物浸泡大蒜，用电镜法检测病毒数量。张欣，湖北海棠叶中黄酮类化合物抗氧化作用的研究，《农产品加工.学刊》，2008年4期；以湖北海棠叶中黄酮类化合物为研究对象，采用乙醇回流提取法，用乙醇体积分数、料液比、提取温度以及提取时间为主要考查因素，通过正交试验，确定了湖北海棠叶中黄酮类化合物的最佳提取工艺为乙醇溶液体积分数为50%,料液比为1:20，在8(TC水浴条件下提取3h。通过定期测定猪油样品过氧化值(POV)的变化，研究了湖北海棠叶中黄酮类化合物的抗氧化性能。湖北海棠叶中黄酮类化合物对猪油具有较强的抗氧化作用，且随着其添加量的增加而增大。屈克义，等，湖北海棠叶煎液药效学实验研究，《时珍国医国药》，2000年11巻2期，对湖北海堂叶水煎液进行了体外抑菌与小鼠缺氧，氏温、疲劳实验，结果发现湖北海棠叶水剪液对金葡萝及大肠杆菌有较好的抑菌作用，并具提高小鼠耐缺氧、耐低温瑕运动耐受能力的作用。王春玲，等，湖北海棠对小鼠血糖的影响，《基层中药杂志》，1999年13巻2期。目前尚无报道湖北海棠用于保肝的相关报道。
发明内容本发明的技术方案是提供了一种海棠提取物，本发明的另一技术方案是提供了该海棠提取物的新用途，及含有该提取物为活性成分的药物或保健食品组合物。本发明提供了一种海棠提取物，它是由蔷薇科苹果属为原料，加入水或有机溶液提取制备而成，其中，提取物中根皮苷的重量百分比为5%-92%。其中，所述的蔷薇科苹果属植物为湖北海棠ife7"s力"pe力e/wisRehd.、垂丝海棠ifek泡Wa/aKoehne、变叶海棠他7i/stori，iotes(Rehd.)Hughes。其中，所述的有机溶液是正丁醇，海棠正丁醇提取物中含有下述重量百分含量的化合物橙酮苷0.04-0.5%，金丝桃苷0.0H%，异槲皮苷0.03-0.1%、根皮苷50-92%、化合物6:malusoh叩ehenin0.04-0.5%;橙酮苷，分子式C2晶。0n，结构式为OHOH金丝桃苷，分子式C21H2Q012，结构式为:6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>根皮苷，分子式C21H24O10，结构式为:HOH化合物6:malusohupehenin,分子式C42H42021，结构式为:7<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>本发明还提供了海棠提取物在制备保肝药物或保健食品中的用途。其中，所述的药物或保健食品是治疗或预防病毒性肝炎、药物性肝损伤、酒精性肝病ALD、非酒精性脂肪肝的药物或保健食品。其中，所述的药物或保健食品是抗乙肝病毒、肝纤维化所引起的肝功能异常或肝功能衰竭的药物或保健食品。其中，所述的药物或保健食品是治疗或预防急性酒精中毒的药物或保健食n叫o本发明还提供了一种保肝药物或保健食品组合物，它是由所述的海棠提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。其中，所述的活性成分还包括菊花、天麻，其中原料的重量配比为海棠3-10份，菊花1-3份，天麻0.5-5份。进一步优选地，所述的原料重量配比为海棠6份，菊花1份，天麻0.5份。本发明还提供了该组合物在制备治疗或预防病毒性肝炎、药物性肝损伤、酒精性肝病ALD、非酒精性脂肪肝病、肝纤维化所引起的肝功能异常或肝功能衰竭、治疗或预防急性酒精中毒的药物或保健食品中的用途。本发明药物或保健食品可用于多种原因引起的肝功能异常，具有抗病毒，降酶、降酯保肝多种作用，适用于病毒性肝炎，药物性肝损伤，酒精性肝病(ALD)和非酒精性脂肪肝病，肝纤维化所引起的肝功能异常或肝功能衰竭；改善乏力、食欲减退、恶心、呕吐、肝区胀痛、肝肿大及黄疸、发热等症状，修复损害的肝细胞，维护肝功能。本发明原料还可用于制备治疗或预防急性酒精中毒的药物或保健食品，具有保肝、提高乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)活性，促进酒代谢作用。明显改善醉酒引起的头晕、头痛，乏力、恶心、呕吐，口渴、兴奋失眠等症状。减少酒对肝脏损害，短期醉酒引起的身体不适时间。具体用法用量保肝，一日三次，一次一片(粒，包)，温水冲服或吞服。醒酒，饮酒前后各一片(粒，包)，温水吞服。或取一袋将粉末倒茶杯中加热水冲饮，每袋加水300-500ml。本发明药物属于纯天然制剂，不经有机溶解处理。安全可靠。由食品开发成药品，毒性小，长期使用无不良反应。可当茶饮用，使用方便，味道可口。对各种原因引起的肝损伤均有保护作用，对因肝损伤出现的各种疾病均有防治作用；治疗或预防急性酒精中毒，效果良好，能明显改善醉酒引起的头晕、头痛，乏力等各种症状。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。图1湖北海棠叶正丁醇部位单体化合物制备图2湖北海棠叶正丁醇部位单体化合物制备具体实施例方式实施例l海棠提取物的制备取湖北海棠v^7"s力"/e力朋sisRehd.，加12倍水80。C提取两次，每次0.5-2小时，过滤减压浓縮成浸膏。其中根皮苷的重量百分含量为10-70%。实施例2海棠提取物的制备取垂丝海棠ife7^^a77i朋aKoehne，加12倍量的70%乙醇回流提取两次，每次O.5-2小时，过滤减压浓縮成浸膏。其中根皮苷的重量百分含量为10-75%。实施例3海棠提取物的制备取变叶海棠ife7〃sz^ri/^ozVes(Rehd.)Hughes,力B12倍量的500/0乙醇回流提取两次，每次0.5-2小时，过滤减压浓縮成浸膏。其中根皮苷的重量百分含量为15-80%。实施例4海棠提取物的制备取湖北海棠ife7〃s力〃/e力e77s^Rehd.，加12倍量的90%乙醇回流提取两次，每次0.5-2小时，过滤减压浓縮成浸膏。其中根皮苷的重量百分含量为20-82%。实施例5本发明药物的制备取海棠600g、菊花100g、天麻50g加30倍的水100'C加热提取3次；滤液经下列方法之一处理。1、常压或减压浓縮得干浸膏。浸膏经粉碎成粉末过60-100目筛备用。2、常压或减压浓縮得稠浸膏，稠浸膏冷冻干燥得粉末，过60-100目筛备用。3、常压或减压浓縮至固型物含量20-40%，喷雾干燥得粉末，过60-100目筛备用。喷雾干燥条件固形物含量15-30%;干燥温度进风温度选用160-200。C左右，出口温度70-ll(TC左右。流量根据设备性能调节，保证进出口温度。取上述3种方法之一所得干燥粉末1000-10000份，加入淀粉和1%硬脂酸镁，压片，使每片含根皮苷5-40mg(所用的辅料可以是微晶纤维素、改性淀粉、乙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等片剂常用的辅料中的一种或几种)。经压片机压制成片，片重0.5-2g。取上述3种方法之一所得干燥粉末1000-10000份，加入辅料，制粒，整粒，装胶囊，每粒胶囊中含根皮苷5-40mg(所用的辅料可以是微晶纤维素、改性淀粉、乙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等胶囊剂常用的辅料中的一种或几种)。取上述3种方法之一所得干燥粉末1000-10000份，加入辅料，制粒，整粒，装袋。每袋中含根皮苷5-40mg(所用的辅料可以a半乳糖、p环糊精等颗粒剂常用的辅料中的一种或几种)。实施例6本发明药物的制备取海棠600g、菊花100g、天麻50g加30倍的95%(v/v)乙醇回流提取3次。滤液按实施例5的方法处理。实施例7本发明药物的制备取海棠100g，菊花300g,天麻500g,加10倍的水50。C提取2次或10倍的50(v/v)乙醇回流提取2次。滤液按实施例5的方法处理。实施例8本发明药物的制备取海棠300g，菊花100g，天麻50g，加30倍的水IO(TC提取3次或30倍的95(v/v)乙醇回流提取3次。滤液按实施例5的方法处理。实施例9本发明湖北海棠叶正丁醇部位单体化合物制备制备的工艺流程见图1和图2，分离出的几个化合物通过结构测定，分别如下橙酮苷，分子式C21H2oOOH金丝桃苷，分子式C21H2()0异槲皮甙，分子式C21H2()0OHH根皮苷，分子式C21H240《七合物6malusohupehenin，分子式C42H42O21oho化合物6malusohupebenin的'H(500MHz)和13C-NMR(125MHz)数据(CH3OH-rf4)査耳酮部分橙酮部分No<5fcNo1138.1qC-2148.1qC-213UCH7.24(d,8.5)3182.4qC-3I19.1CH-6.88(d，8.5)4158.6qC-4157.8qC-599.2CH6.32(d，2.0)5119.1CH6.68(d，8,5)6170.3qC6131.1CH7.24(d,8.5)793.9CH6.37(d,1.5)r106.9qC-7a169.9qC-2，167.7qC-3'a105.5qC-3，9S.6qCH5.95(d,2.5)107.6CH6.954，166.1qC-r116.6qC-5，95.7CH6.18(d,2.5)2,118.0CH7.81(s)6,162.5qC-3，150.7qC-C-a46.7CH23.50(m)4,108.1CH6.39(s)C-P30.9CH22.95(t,7.5)5，143.4qC-c=o206.4qC6，152.5qCGlcGlcr，106.19CH-1:105.73CH-2"76.25CH-2，，74.67CH-3"78.89CH-3，，78.96CH-4"71.77CH-4"71.77CH-5"78.65CH-5,'77.86CH-6，，63.11CH2-6，，62.96CH2-经测定，海棠正丁醇提取物中含有的化合物的重量百分含量分别为橙酮苷0.04-0.5%,金丝桃苷0.01-1%，异槲皮苷0.03-0.1%、根皮苷50-92%、化合物6:mal湖hupehenin0.04-0.5%。以下通过药效学试验证明本发明的有效效果。实验原料湖北海棠^fe7"s力"pe力e/s"Rehd.)、垂丝海棠ife7"s^a7h'a/aKoehne、变叶海棠胞7〃stori/卵j'ofe5"(Rehd.)Hughes。海棠提取物，天然产物研究与利用湖北省重点实验室自制。试验例1-7的海棠提取物是由水提方法制备而成的。实验动物昆明种小鼠，体重(10士2)g，(20士2)g，性别均为雄性，Balb/c小鼠，雌雄各半，56周龄，体重(18士2)g，SPF级，由湖北省实验动物研究中心提供，合格证号SCXD(鄂)2003-0005。实验试剂RPMI1640培养液；新生小牛血清；四氯化碳(CCL4);二甲基亚砜；联苯双醋滴丸；丙氨酸氨基转移酶试剂盒(ALT)，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒，总胆红素(TBIL)试剂盒(北京利德曼生化技术有限公司)；羧甲基纤维素钠；考马斯亮蓝G-250;花生油；联苯双酯滴丸；38°白酒；土酶素注射针剂(江西省创欣动物药业有限公司)；脂必妥(成都地奥九泓泓制药厂)；猪油；蛋黄；猪血清；秋水仙碱等。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)诊断试剂盒(酶联免疫法)(上海科华生物技术有限公司)，乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)诊断试剂盒(酶联免疫法)(北京科卫临床诊断试剂有限公司)；丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物制品公司)；透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)放射免疫试剂盒(北京北方免疫试剂研究所)；秋水仙碱(西安化学试剂厂)。实验仪器超净工作台；96孔培养板；匀浆器；酶标仪；恒温水浴锅等试验例l海棠提取物对体外肝细胞损伤的保护作用实验方法与结果1、肝细胞分离培养取10g左右小鼠1只，断头放血，无菌分离肝脏，称重后置PBS液中，灌注冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成lmm3左右的组织块，并用尼龙筛网碾磨，加入PBS液，1000r/min离心5min，去上清，加入10ml培养液，用滴管轻吹打成肝细胞悬液。2、CCU诱导肝细胞损伤模型的建立取50ul上述肝细胞悬液转到96孔板中，然后往每个孔中再加入30ul的培养液，并加入不同浓度的CCU((116mmol.L—"，以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为O.1%(体积分数)〕，作用不同时间(14h)后，收集96孔板中培养上清检测ALT。根据检测结果制备CCL4诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线。选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组设3个复孔。3、海棠提取物对CCU诱导肝细胞损伤的作用取上述培养肝细胞悬液，设CCL4损伤模型组、不同剂量给药组、正常对照组，每组设6个复孔。模型组和给药组加入4mmol.L—'CCU,同时给药组加入不同浓度的药物，37。C孵育3个小时后，2000r/min离心5min，收集培养上清液检测ALT活性。结果如下-表l药物对CCL4诱导肝细胞损伤的影响(X±Sn=6)组别剂量Mg/kgALTu/L空白组/27.2±3.1**模型组/50.2±3.5海棠提取物8048.0±4.8海棠提取物4041.7±4.3氺承海棠提取物2031.6±3.2***表示与模型组比p<0.05，林表示与模型组比p<0.01结果表明海棠提取物对ccu诱导的肝细胞损伤均具有保护作用。试验例2海棠提取物体内对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用实验方法与结果1、实验方法动物分组和造模方法取90只雄性昆明小鼠，随机分成9组，每组10只，分别为正常组、模型组、海棠提取物组(低、中、高剂量组)、联苯双酯组(BDP)。各给药组按0.2ml/20g/d)剂量灌胃给药，正常对照组和模型组予以相应体积的溶媒CMC-Na，连续灌胃给药4d。于末次给药后lh，除正常对照组腹腔注射(ip)等量生理盐水外，其余各组均ip0.1%CC14花生油溶液0.1ml/10g。禁食16h后，再给一次药并称重，半小时之后，所有小鼠摘眼球采血，分离血清，测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)。2、实验结果如下表2药物对四氯化碳致急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、TBIL的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注**表示与模型组比较，P〈0.01结果表明海棠提取物对四氯化碳致急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、TBILI具有显著降低作用，表明其具有良好的保肝作用。试验例3、海棠提取物对慢性酒精性肝损伤小鼠的保护作用实验1.实验方法取90只雄性昆明小鼠，随机分成9组,每组10只，分别为正常组、模型组、海棠提取物组(低、中、高剂量组)、联苯双酯组(BDP)。各组均以每次0.lml/10g体重灌胃。对照组每日灌胃蒸馏水，白酒组和给药组上午灌胃38°白酒,6h后乙醇组灌胃蒸馏水，给药组按低、中、高剂量顺序分别灌胃，连续40d。最后一天禁食16h后，再给一次药并称重，半小时之后，所有小鼠眼球采血，分离血清，赖氏法测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)。2.实验结果如下表3药物对慢性酒精性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、TBIL的影响G±s)n二10组别齐廿量mg/kgALTu/LASTu/LT-Bilumol/L正常组/37.2±3.1**264.2±40.3**2.37±0.49林模型组/53.2±3.5516.2±36.813.61±1.14海棠提取物(低)7547.5±3.7*446.7±43.2*6.95±0.52**海棠提取物(中)15046.9±3.5*389.8±59.6**5.47±0.86**海棠提取物(高)30041.7±4.3**322.4±78.5**4.31±0.62**联苯双酯组1045.9±4.5*411.0±76.1**11.53±1.19*注林表示与模型组比较P〈0.01，承表示与模型组比较P〈0.05结果表明海棠提取物对慢性酒精性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、TBIL具有显著降低作用，表明其具有良好的保肝作用。试验例4海棠提取物对慢性非酒精性肝损伤小鼠的保护作用实验1.实验方法取84只雄性昆明小鼠，随机分成7组,每组10只,分别为正常组、模型组、海棠提取物(中、高剂量组分别为150，300mg/kg)、脂必妥组(300mg/kg)。各组均以每次O.lml/10g体重灌胃。模型组和给药组给予高脂饮食(即80%普通饲料+10%猪油+10%蛋黄粉)，并按10mg/100g剂量腹腔注射氧四环素(每lml针剂含药物20mg)，每4天给药一次。正常对照组给予普通饲料喂养,在模型组注射氧四环素的同一时间，按相同体积比例的生理盐水腹腔注射。给药组按低、中、高剂量顺序分别灌胃，连续28d。最后一天禁食12h后,再给一次药并称重，半小时之后，所有小鼠眼球采血，分离血清，测定谷丙转氨酶(ALT)、15谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)。然后迅速取出肝脏，取肝右叶lg，4°C下制成100g/L左右的肝匀浆，采用硫代巴比妥法检测丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，严格按试剂盒操作步骤检测。2、实验结果如下表4药物对慢性非酒精性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、TBIL的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注林表示与模型组比较P〈0.01,承表示与模型组比较P〈0.05表5药物对慢性非酒精性肝损伤小鼠血清中MDA的影响(5土s)n=10<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注林表示与模型组比较P〈0.01，承表示与模型组比较P〈0.05结果表明海棠提取物对慢性非酒精性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、TBIL、MDA具有显著降低作用，表明其具有良好的保肝作用。试验例5海棠提取物对Balb/c小鼠免疫损伤性肝纤维化的保护作用1.实验方法取105只Balb/c小鼠,雌雄各半，随机分成7组，每组15只，分别为正常组、模型组、海棠提取物(中、高剂量组分别为150，300mg/kg)、秋水仙碱组(l.Omg/kg)。对照组腹腔内注射0.85%氯化钠，模型组腹腔内注射猪血清，每次0.1ml/10g，每周1次，共6周。各组均以每次0.1ml/10g体重灌胃。对照组每日灌胃蒸馏水，给药组按中、高剂量分别灌胃,连续6周。最后一天禁食16h后，各组随机取IO只小鼠，再给一次药并称重，半小时之后，所有小鼠眼球采血，分离血清。用放射免疫试剂盒测定血清中透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)含量。2.实验结果如下表6药物对小鼠免疫损伤性肝纤维化的的影响(S±S)n=10<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注林表示与模型组比较P〈0.01，伞表示与模型组比较P〈0.05结果表明海棠提取物能降低小鼠免疫损伤性肝的肝纤维化血清学指标透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)含量，与模型组相比差异有显著性。海棠提取物组小鼠死亡低于模型组，且小鼠发育良好，活泼好动，皮毛柔顺有光泽，而模型组动物精神差，活动少，发育迟缓,皮毛松弛，毛色黯淡，厌食，消瘦，体重明显减轻。表明海棠提取物具有抗肝纤维化作用。试验例6海棠提取物治疗或预防急性酒精中毒(醒酒作用)(1)醒酒活性A、海棠提取物对急性酒精中毒小鼠翻正反射的影响取昆明小鼠60只，随机分成6组，每组10只，禁食12h后，给药组分别灌服海棠提取物，阳性对照组灌服康华酒友解酒晶(l,5g/kg)，模型对照组灌服等量的生理盐水。30min后各组分别灌服38度枝江大曲(0.34mLl/20g)。小鼠醉酒与否以翻正反射消失为指标，即将小鼠背向下轻轻放在动物笼里，若仰位姿势保持30s以上，则认为小鼠翻正反射消失，记录给酒后小鼠翻正反射消失的潜伏时间和维持时间，实验结果见下表。表7海棠提取物对小鼠翻正反射的实验结果(5±&"=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>与模型组比较*户<0.05,**尸<0.01结果表明海棠提取物对急性酒精中毒小鼠酒精中毒具有明显拮抗作用。(2)海棠提取物对小鼠肝中乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)活性的影响取昆明种小鼠60只，随机分成6组，每组10只。小鼠禁食12小时后，给药组分别灌服海棠提取物和阳性对照组灌服康华酒友解酒晶；模型对照组灌服等量的生理盐水。30min后各组分别灌服38度江大曲(0.34mL/20g)，空白对照组灌服等量的蒸馏水。酒后1小时，处死各组小白鼠，取其肝脏。将0.5g肝脏先用生理盐水，后用蔗糖溶液冲洗，再放入2ml蔗糖溶液中，在冰水浴中剪碎、匀浆，匀浆液以6000rps离心10分钟。取出上清液，以9000rps再次离心10分钟，得上清液用于ADH活力的测定，沉淀为线粒体，加入1.0mL蔗糖，制成悬浮液后可以进行ALDH活力的测定，整个离心操作过程保持在0-40。C下进行。小鼠肝脏ADH活力的测定用移液管向1.0cm比色皿内移入2.5mLph8.8焦磷酸钠缓冲液，0.3mL底物溶液和0.1mL氧化型辅酶I溶液，并恒温至25"C，加入O.lOmL酶溶液，动秒表。在10min内，每隔1min读取340nm处的吸光度，直至每分钟吸光度的增大值达到稳定为止。小鼠肝脏ALDH活力的测定用移液管向1.0cm比色皿内移入2.3mLpH9.0焦磷酸钠缓冲液，0.1mLNAD+溶液，0.5mL乙醛底物，恒温至25。C，然后加入25。C上面制得悬浮酶液0.lmL，在连续大约10分钟内，每隔l分钟读取340nm处的吸光度，直至每分钟吸光度的增大值达到稳定时为止。根据上述步骤和方法，测定结果见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>与模型组比较*尸<0.05，**P<0.01结果表明，海棠提取物能提高ADH、ALDH的活性，加快酒的代谢谢。从而具有醒酒作用。试验例7海棠提取物抗病毒作用选取处于对数生长期H印G2115细胞，稀释至细胞浓度约为105/ml，于96孔细胞培养板每孔加样200ul，培养24h岳加入不同浓度药物2ul。设计6个浓度(50，25，12.5，6.25，3.13，1.56umg/ml)，每个浓度3个复孔。细胞在培养箱中培养4d后，吸出培养液，换液后再加药一次。继续培养4d后，按试剂盒检测方法，表检测HBsAg和HbeAg。用酶标仪在450nm处测定OD值。以OD值代表HBsAg和HbeAg含量。同时用MTT实验在490nm波长测定OD值，判断药物的细胞毒性，计算ICs。。结果海棠提取物、在受试浓度无明显的细胞毒作用，有抗病毒作用。海棠提取物对HBsAg和HbeAgr的IC幼分别为19"g/ml，4.5ug/ml。试验例8湖北海棠叶正丁醇部位单体化合物对H印G2细胞四氯化碳损伤的保护作用1材料与方法1.1材料H印G2细胞株(武汉典藏中心)，湖北海棠单体化合物(由本室分离得)。RPM-11640培养基(InvitrogenCorporation)、胎牛血清(武汉三利生物技术有限公司)、MTT(购自Gibco公司)，StatFax2100酶标仪(西盟生命技术有限公司)。1.2方法1.2.1细胞培养H印G2细胞，用含1(F。小牛血清的RPMI-1640培养液于37。C、5%C02、饱和湿度条件下静置培养。当细胞铺满瓶底80%以上，对数生长期增殖活跃的细胞传代进行分组试验。1.2.2CCl4损伤液制备将DMS0与CCl4以物质的量比1:2混合振荡后，加入1640培养液中(终浓度为0.4umol/ul)，得到结晶细小的CCl4悬液，放置4。C冰箱保存。用前振荡后使用。1.2.3分组实验设正常对照组、CCl4损伤组和单体化合物损伤保护组。正常对照组不做特殊处理；损伤组加入用1640配制的CCl4悬液(终浓度为6umol/ml);单体化合物损伤保护组分五组(单体化合物浓度分别为10、20、50、100、125Pg/ml)，每组6个复孔，于CCl4损伤前12h加入单体化合物。三组细胞均于37°C、5%C02饱和湿度条件下静置培养。1.2.4MTT法检测细胞活力将H印G2细胞以5X107ml接种在96孔培养板中，每孔100pl。培养12h后，保护组加入不同浓度的单体化合物，终浓度分别为10、20、50、100、125ug/ml，继续培养12h，加入CCl4(终浓度为6iimol/ml)，正常对照组不做特殊处理。每组设6个复孔。于损伤后2h取细胞培养上清液测定各项生化指标。然后加入5mg/ml的MTT20y1，放入0)2培养箱继续培养4h，取出培养板，小心吸去培养液，加入100ulDMSO，振摇至MTT结晶溶解后，用全自动酶联仪测定各孔吸光度(0D值)(测试波长570nm)。用以下公式计算实验组细胞存活率，细胞存活率二实验0D/对照0DX10(F。(以空白组0D值调零)。1.2.4ALT、AST活性的测定取细胞培养上清液，按试剂盒说明书测定ALT、AST活性。1.3结果对H印G2细胞培养上清液中AST、ALT的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>+P<0.05,++P<0.001vs空白；*P<0.05,**P<0.01vs模型试验例9湖北海棠叶正丁醇部位单体化合物对HepG2细胞酒精性损伤的保护作用1材料与方法1.1材料同试验例8中1.11.2方法1.2.1细胞培养同试验例8中1.2.11.2.3分组实验将细胞数调整到5X1(T个/mL，接种于96孔培养板，培养24h，每组6个复孔，加入单体化合物终浓度分别为10，20，50，100，125ug/mL，另设模型组和对照组。加入单体化合物5h后，除正常对照组之外，其余各组添加乙醇6uL，损伤12h之后取细胞培养上清液测定各项生化指标。1.3结果对H印G2细胞培养上清液中AST、ALT的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>+P<0.05，"P〈0.001vs空白；*P<0.05，**P<0.01vs模型试验例10、湖北海棠叶正丁醇部位单体化合物体外抗乙肝病毒实验l材料H印G2.2.15细胞株乙型肝炎病毒DNA克隆转染人肝癌细胞(H印G2.2.15)由军事医学科学院引进本室自行传代培养。MEM干粉、胎牛血清、G-418，GIBC0公司，L-谷氨酰胺，EMERC公司；HBsAg、HBeAgELISA法测定试剂由上海天呈生物科技有限公司提供。2方法选取处于对数生长期H印G2115细胞，稀释至细胞浓度约为10Vml，于96孔细胞培养板每孔加样200ul，培养24h后加入不同浓度药物2ul。设计6个浓度(125，100，50，20，10ug/ml)，每个浓度3个复孔。细胞在培养箱中培养4d后，吸出培养液，换液后再加药一次。继续培养4d后，按试剂盒捡测方法，检测HBsAg和HbeAg。用酶标仪在450nm处测定OD值。3结果组别剂量(ug/ml)HbeAgHEsAgOD值抑制率OD值抑制率正常组/2.9962.767根皮苷102.9003.2%2.7092.1%202.8255.7%2.5717.1%502.53815.3%2.5129.2%1002.20526.4%2.34115.4%1252.17827.3%2.28017.6%根皮素102.7538.1%2.6783.2%202.53815.3%2.6185.4%501.92635.7%2.5717.1%1001.63945.3%2.08424.7%1251.60646.4%1.83233.8%异槲皮苷102.9362.0%2.6673.6%202.8883.6%2.6265.1%502.7089.6%2.5627.4%1002.66311.1%2.5298.6%1252.51116.2%2.48210.3%金丝桃苷102.61612.7%2.6075.8%202.54115.2%2.28817.3%502.23525.4%2.02326.9%1001.23158.9%1.03262.7%1251.12962.3%0.88368.1%橙酮苷102.9690.9%2.7092.1%202.7538.1%2.6404.6%502.58013.9%2.29717.0%1002.15128.2%1.97628.6%1252.00733.0%1.95129.5%化合物6102.9571.3%2.7480.7%202.8225.8%2.7341.2%502.46017.9%2.40213.2%1002.32822.3%2.16721.7%1252.25324.8%2.15022.3%22通过试验例8-10的试验可知，本发明药物湖北海棠叶正丁醇部位及单体化合物对H印G2细胞四氯化碳损伤具有保护作用；对H印G2细胞酒精性损伤具有保护作用，此外还可抗乙肝病毒。综上所述，本发明药物或保健食品可用于多种原因引起的肝功能异常，具有抗病毒，降酶、降酯保肝多种作用，适用于病毒性肝炎，药物性肝损伤，酒精性肝病(ALD)和非酒精性脂肪肝病，肝纤维化所引起的肝功能异常或肝功能衰竭。改善乏力、食欲减退、恶心、呕吐、肝区胀痛、肝肿大及黄疸、发热等症状，修复损害的肝细胞，维护肝功能，此外本发明药物还具有治疗或预防急性酒精中毒作用，可用于醒酒。2权利要求1、一种海棠提取物，其特征在于它是由蔷薇科苹果属为原料，加入水或有机溶液提取制备而成，其中，提取物中根皮苷的重量百分比为5％-92％。2、根据权利要求1所述的海棠提取物，其特征在于所述的蔷薇科苹果属植物为湖北海棠ife2"5"力"pe力朋w'sRehd.、垂丝海棠i/a7"svfeL^/73Koehne、变叶海棠勸7〃6"力ori/7卵油s(Rehd.)Hughes。3、根据权利要求1或2所述的海棠提取物，其特征在于所述的有机溶液是正丁醇，海棠正丁醇提取物中含有下述重量百分含量的化合物橙酮苷0.04-0.5%,金丝桃苷0.01-1%,异槲皮苷0.03-0.1%、根皮苷50-92%、4七合物6:malusohupehenin0.04-0.5%;橙酮苷，分子式C21H2Q0，结构式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>金丝桃苷，分子式C21H2。012，结构式为:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>异槲皮苷，分子式C21H20O12,，结构式为:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>根皮苷，分子式C21H2401()，结构式为:化合物6malusohupeheni分子式C42H42O21，结构式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>4、权利要求1-3任意一项所述的海棠提取物在制备保肝药物或保健食品中的用途。5、根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的药物或保健食品是治疗或预防病毒性肝炎、药物性肝损伤、酒精性肝病ALD或非酒精性脂肪肝的药物或保健食品。6、根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的药物或保健食品是抗乙肝病毒、肝纤维化所引起的肝功能异常或肝功能衰竭或急性酒精中毒的药物或保健食品。7、一种保肝药物或保健食品组合物，其特征在于它是由权利要求1-3任意一项所述的海棠提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。8、根据权利要求7所述的组合物，其特征在于所述的活性成分还包括菊花、天麻，其中原料的重量配比为海棠3-10份，菊花1-3份，天麻0.5-5份。9、根据权利要求8所述的组合物，其特征在于所述的原料重量配比为海棠6份，菊花1份，天麻0.5份。10、权利要求8或9所述的组合物在制备治疗病毒性肝炎、药物性肝损伤、酒精性肝病ALD、非酒精性脂肪肝、抗乙肝病毒、肝纤维化所引起的肝功能异常或肝功能衰竭或急性酒精中毒的药物或保健食品中的用途。全文摘要本发明提供了一种海棠提取物，以及该提取物在制备保肝药物或保健食品中的用途及含有海棠提取物的药物组合物。本发明药物属于纯天然制剂，不经有机溶解处理，安全可靠；由食品开发成药品，毒性小，长期使用无不良反应。可当茶饮用，使用方便，味道可口；对各种原因引起的肝损伤均有保护作用，对因肝损伤出现的各种疾病均有防治作用；治疗或预防急性酒精中毒效果良好，能明显改善醉酒引起的头晕、头痛，乏力等各种症状。文档编号A23L1/30GK101683411SQ200910175099公开日2010年3月31日申请日期2009年9月22日优先权日2008年9月24日发明者红叶,媛周,张宏岐,荣方,进杨,汪鋆植,坤邹,郭志勇申请人:汪鋆植