专利名称：使用重组微生物制造共聚聚酯的方法
技术领域：
本发明涉及使用重组微生物制造共聚聚酯的方法。
背景技术：
到目前为止，已经报道了大量具有以糖为碳源生产聚酯的能力的微生物(非专利 文献1)。由微生物生产的聚酯作为容易在自然界被分解的生物降解性塑料、以及能够从糖 和/或植物油等可再生碳资源合成的“绿色”塑料而受到关注。由微生物生产的生物降解性塑料的代表例是以3-羟基丁酸(3HB)为单体的 聚-3-羟基丁酸(polyhydoroxybutylatelHB)。PHB是具有180°C左右的熔解温度的热塑 性高分子，除了生物降解性之外还具有熔融加工性优异这样的优点。另一方面，PHB由于结 晶性高，因而存在硬且脆、即耐冲击性差这样的物性上的问题。作为消除PHB的物性上的问题的一种方法，开发了使用微生物来制造包含3HB和 其它羟基脂肪酸的共聚聚酯的方法。例如，专利文献1公开了由3HB和3-羟基戊酸(3HV)形成的共聚物的制造方法。 另外专利文献2公开了使甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)、副球菌属(Paracoccus sp.)、产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的微生物与碳原子 数3 7的伯醇接触，从而生产3HB与3HV的共聚物的方法。该3HB与3HV的共聚物比PHB富于柔软性，并且确认了如果共聚聚酯中3HV的含 有率增加则柔软性提高。在上述使用微生物的3HB与3HV的共聚物的制造法中，例如在上 述专利文献1中通过在培养基中添加丙酸来控制共聚聚酯中3HV的含有率，另外在专利文 献3中通过在培养基中添加1-丙醇来控制共聚聚酯中3HV的含有率。例如，专利文献4和专利文献5中也分别记载了作为3HB与3_羟基己酸(以下简 称为3HH) 2种成分的共聚聚酯的P (3HB-co-3HH)及其制造方法。这些公报的P (3HB-co-3HH) 共聚物的制造方法是使用由土壤分离出的猪鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)，由油酸等脂 肪酸和/或橄榄油等油脂进行发酵生产的方法。另外，还有克隆该猪鼠气单胞菌的PHA合 酶基因，使用将该基因导入真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)而得的重组株，以脂肪 酸为碳源来生产P(3HB-co-3HH)的报告(专利文献6)。另外，在上述使用微生物的共聚聚酯的制造法中，任何情况下均需要使用作为具 有直接合成聚合物的活性的酶蛋白质的聚羟基脂肪酸酯合成酶，也进行了改变该合成酶、 并调节单体单元的摩尔比率的尝试。例如专利文献7公开了一种突变酶，是被鉴定为假单 胞菌种(I^eudomonas sp.) 61-3的微生物的聚羟基脂肪酸酯合成酶的氨基酸序列发生变换 而得的，可生产3HB的含有率高的PHB。以上是以3-羟基脂肪酸为单体单元的共聚聚酯、及其使用微生物的制造法。另 一方面，人们期待以除3-羟基脂肪酸以外的成分为单体单元的共聚聚酯具有与上述共聚 聚酯不同的物性。作为含有这样的除3-羟基脂肪酸以外的单体单元的共聚聚酯的例子， 专利文献8公开了将整合有编码丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰CoA转移
5酶的核酸的真养产碱杆菌(feilstonia eutropha，又称罗尔斯通氏菌，旧名Alcaligenes eutrophus)在培养基中添加乳酸的条件下进行培养，从而制造由3HB和乳酸(LA)形成的 共聚聚酯的方法。另外，同一文献中还公开了将整合有编码来源于丙酸梭菌的丙酰CoA转 移酶的核酸、和编码来源于假单胞菌种61-3的聚羟基脂肪酸酯合成酶的核酸的大肠杆菌 在培养基中添加乳酸和癸烯酸的条件下进行培养，从而制造由3-羟基己酸酯、3-羟基辛酸 酯、3-羟基癸酸酯和乳酸形成的共聚物。但是，在培养基中添加乳酸和/或癸烯酸等单体成分来合成聚羟基脂肪酸酯的方 法在原料成本方面是不利的。另外，因为一般通过微生物制造共聚聚酯的聚合物生产性和 碳源收率低，所以即使在利用廉价的天然物等作为碳源的情况下，提高生产性乃至收率对 于减少制造成本来说也是重要的课题。非专利文献ι 《生分解性7^ V n ” (生物降解性塑料手册)》， 生分解性7 ^ ^研究会编，1995年，第178-197页，(株)工？ ·歹^ 一 工7出版)专利文献1 日本特开昭57-150393号公报专利文献2 日本特开平5-74492号公报专利文献3 日本特公平7-79705号公报专利文献4 日本特开平5-93049号公报专利文献5 日本特开平7465065号公报专利文献6 日本特开平10-108682号公报专利文献7 国际公开公报W02003/100055专利文献8 国际公开公报W02006/U679
发明内容
发明要解决的课题本发明的目的是提供以糖为原料通过微生物发酵来高效地生产包含3HB和作为 除3-羟基脂肪酸以外的单体单元的LA的共聚聚酯的方法。另外，本发明的目的是提供根 据所使用的酶的特性来控制聚酯中3HB的摩尔比率，或者通过选择特定的宿主、调节培养 条件，来制造具有各种摩尔比率的LA的共聚聚酯的方法。另外本发明的目的是提供以糖为 原料通过微生物发酵来高效地生产进一步含有除LA和3HB以外的单体单元的共聚聚酯的 方法。用于解决课题的方法本发明者们发现，导入了编码上述非专利文献7所记载的聚羟基脂肪酸酯合成酶 的突变体的核酸的重组微生物，能够由糖直接地有效制造由3HB和LA形成的共聚聚酯，并 且发现，能够调节共聚中LA的摩尔比率，而且通过进一步向培养基中供给除3HB和LA以外 的单体成分的前体能够有效地制造进一步包含除LA和3HB以外的单体单元的共聚聚酯，从 而完成了下述各发明。(1) 一种由3-羟基丁酸和乳酸形成的共聚聚酯的制造方法，其包括下述工序(1) 和工序O)，工序(1)在含碳源的培养基中培养具有催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应 的蛋白质、催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质、催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质、以及包含下述(a)或(b)的氨基酸序列的催化聚羟基脂肪酸酯的合成 反应的蛋白质的重组微生物，(a)序列号2所示氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位氨基酸 的至少1个以上被置换成了其它氨基酸的氨基酸序列，(b)在(a)所定义的蛋白质中，进而除第130位、第325位、第477位和第481位以 外的至少1个以上氨基酸缺失或被置换，或者插入了 1个以上氨基酸残基的氨基酸序列；工序O)从工序(1)的培养物中回收上述共聚聚酯。(2)根据(1)所述的制造方法，其中，催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋 白质的氨基酸序列，是序列号4所示氨基酸序列，或者在序列号4所示氨基酸序列中缺失、 置换或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。(3)根据(1)所述的制造方法，其中，催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的 反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号6所示氨基酸序列，或者在序列号6所示氨基酸序列 中缺失、置换或添加了 1个或几个氨基酸的氨基酸序列。(4)根据⑴所述的制造方法，其中，催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质的氨 基酸序列，是序列号8所示氨基酸序列，或者在序列号8所示氨基酸序列中缺失、置换或添 加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。(5)根据(1)所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的 氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸分别被置换成了 其它氨基酸的氨基酸序列。(6)根据(5)所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的 氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸同时被置换了的 氨基酸序列。(7)根据(6)所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的 氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位的Ser被置换成了 Thr、第481位的Gln 被置换成了 Lys的氨基酸序列。(8)根据(1)所述的制造方法，其中，所述蛋白质都是由被导入微生物中的重组表 达载体所编码的蛋白质。(9)根据⑴ ⑶的任一项所述的制造方法，其中，重组微生物的培养在厌氧条 件下进行。(10)根据(1) (9)的任一项所述的制造方法，其中，微生物是具有乳酸蓄积能力 的微生物。(11)根据(10)所述的制造方法，其中，具有高乳酸蓄积能力的微生物是大肠杆菌 Jw2293菌株、Jw0885菌株或Jw0886菌株。(12) 一种包含3-羟基丁酸和乳酸的共聚聚酯的制造方法，其包括下述工序(1)和 工序⑵，工序(1)在含有除3-羟基丁酸和乳酸以外的羟基脂肪酸和碳源的培养基中培养 具有催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋白质、催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙 酰CoA的反应的蛋白质、催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质、和包含下述(a)或(b)的 氨基酸序列的催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的重组微生物，
(a)序列号2所示氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基 酸的至少1个以上被置换成了其它氨基酸的氨基酸序列，(b)在(a)所定义的蛋白质中，进而除第130位、第325位、第477位和第481位以 外的至少1个以上氨基酸缺失或被置换，或者插入了 1个以上氨基酸残基的氨基酸序列；工序O)从工序(1)的培养物中回收上述共聚聚酯。(13)根据(1 所述的制造方法，其中，催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的 蛋白质的氨基酸序列，是序列号4所示氨基酸序列，或者在序列号4所示氨基酸序列中缺 失、置换或添加了 1个或几个氨基酸的氨基酸序列。(14)根据(12)所述的制造方法，其中，催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA 的反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号6所示氨基酸序列，或者在序列号6所示氨基酸序 列中缺失、置换或添加了 1个或几个氨基酸的氨基酸序列。(15)根据(12)所述的制造方法，其中，催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质的 氨基酸序列，是序列号8所示氨基酸序列，或者在序列号8所示氨基酸序列中缺失、置换或 添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。(16)根据(1 所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质 的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸分别被置换成 了其它氨基酸的氨基酸序列。(17)根据(1 所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质 的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸同时被置换了 的氨基酸序列。(18)根据(16)或(17)所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应 的蛋白质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位的Ser被置换成了 Thr、第 481位的Gln被置换成了 Lys的氨基酸序列。(19)根据(1 所述的制造方法，其中，所述蛋白质都是由被导入微生物中的重组 表达载体所编码的蛋白质。(20)根据(1 (19)的任一项所述的制造方法，其中，除3-羟基丁酸和乳酸以 外的羟基脂肪酸的前体，是选自丙酸、戊酸、十二烷酸、4-羟基丁酸和4-羟基戊酸中的一种 以上前体。(21)根据(1 OO)的任一项所述的制造方法，其中，重组微生物的培养在厌氧 条件下进行。(22)根据(1 的任一项所述的制造方法，其中，微生物是具有乳酸蓄积能 力的微生物。(23)根据0 所述的制造方法，其中，具有高乳酸蓄积能力的微生物是大肠杆菌 Jw2293菌株、Jw0885菌株或Jw0886菌株。04)—种重组微生物，其表达催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋白质、催 化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质、催化乙酰乙酰CoA的还原反应的 蛋白质、以及包含下述(a)或(b)的氨基酸序列的催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白 质，(a)序列号2所示氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基
8酸的至少1个以上被置换成了其它氨基酸的氨基酸序列，(b)在(a)所定义的蛋白质中，进而除第130位、第325位、第477位和第481位以 外的至少1个以上氨基酸缺失或被置换，或者插入了 1个以上氨基酸残基的氨基酸序列。(25)根据04)所述的重组微生物，其中，催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应 的蛋白质的氨基酸序列，是序列号4所示氨基酸序列，或者在序列号4所示氨基酸序列中缺 失、置换或添加了 1个或几个氨基酸的氨基酸序列。(26)根据04)所述的重组微生物，其中，催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA 的反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号6所示氨基酸序列，或者在序列号6所示氨基酸序 列中缺失、置换或添加了 1个或几个氨基酸的氨基酸序列。(27)根据04)所述的重组微生物，其中，催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质 的氨基酸序列，是序列号8所示氨基酸序列，或者在序列号8所示氨基酸序列中缺失、置换 或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。(28)根据04)所述的重组微生物，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白 质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸分别被置换 成了其它氨基酸的氨基酸序列。(29)根据04)所述的重组微生物，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白 质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸同时被置换 了的氨基酸序列。(30)根据08)或09)所述的重组微生物，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应 的蛋白质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位的Ser被置换成了 Thr、第 481位的Gln被置换成了 Lys的氨基酸序列。(31)根据04)所述的重组微生物，其中，所述蛋白质都是由被导入微生物中的重 组表达载体所编码的蛋白质。(32)根据04) (31)的任一项所述的重组微生物，其中，微生物是具有乳酸蓄积 能力的微生物。(33)根据(3 所述的重组微生物，其中，具有高乳酸蓄积能力的微生物是大肠杆 菌Jw2293菌株、Jw0885菌株或Jw0886菌株。发明的效果本发明的制造方法能够以廉价的碳源为原料有效地制造由3HB和LA形成的共聚 聚酯，从而能够降低生物降解性塑料的制造成本。另外，通过选择所使用的酶、以LA的高生 产性微生物作为宿主、在厌氧条件下进行微生物的培养，能够调节由3HB和LA形成的共聚 聚酯中的单体单元的含有率。另外，通过在培养基中加入除3HB和LA以外的羟基脂肪酸， 能够制造进一步含有除3HB和LA以外的单体单元的共聚聚酯。本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本专利申请2008-113127号、 2008-298765号的说明书和/或附图所记载的内容。
图1是显示重组质粒pTVl 18NPCTC1 (ST/QK) AB的构成的概略图。图中，phaA 表示来源于真养产碱杆菌(R. eutropha)的β KT基因，phaB表示来源于真养产碱杆菌(R. eutropha)的AACoA-R基因，phaCl (ST/QK)表示STQK基因，PCT表示来源于埃氏巨球形 菌(Melsdenii)的Pct基因，Pre表示来源于真养产碱杆菌(R. eutropha)的启动子，并且 Plac表示大肠杆菌乳糖操纵子启动子。图2是实施例1所制备的聚合物的分子量分布曲线。图3是表示实施例1所制备的聚合物的热分析的测定结果的图。图4是表示实施例1所制备的聚合物的GC/MS分析的结果的图。图5是表示实施例1所制备的聚合物的1H-NMR光谱分析的结果的图。图6是表示实施例1所制备的聚合物的13C-NMR光谱分析的结果的图。图7是表示实施例1所制备的聚合物的1H1H-NMR光谱分析的结果的图。图8是表示实施例1所制备的聚合物的13C1H-NMR光谱分析的结果的图。图 9 是显示重组质粒 pTV118NPCTC(Re)AB、pTV118NPCTC(Bc)AB、 PTV118NPCTC1 (WT) AB、pTV118NPCTC2AB 的构成的概略图。图10是表示比较例所制备的pTV118NPCTC(Re)AB和pTV118NPCTC(Bc)的各聚合 物的GC/MS分析的结果的图。画面A是pTVl 18NPCTC (Re) AB的图，画面B是pTVl 18NPCTC (Be) 的图，画面C是pTVl 18NPCTC2AB的图。图Ila是实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw2293菌株的聚合物的 分子量分布曲线。图lib是实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0885菌株的聚合物的 分子量分布曲线。图Ilc是实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0886菌株的聚合物的 分子量分布曲线。图1 是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw2293菌株的聚合 物的热分析的测定结果的图。图12b是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0885菌株的聚合 物的热分析的测定结果的图。图12c是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0886菌株的聚合 物的热分析的测定结果的图。图13a是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw2293菌株的聚合 物的GC/MS分析的结果的图。图1 是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0885菌株的聚合 物的GC/MS分析的结果的图。图13c是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0886菌株的聚合 物的GC/MS分析的结果的图。图1 是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw2293菌株的聚合 物的1H-NMR光谱分析的结果的图。图14b是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0885菌株的聚合 物的1H-NMR光谱分析的结果的图。图14c是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0886菌株的聚合 物的1H-NMR光谱分析的结果的图。
图1 是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw2293菌株的聚合 物的"C-NMR光谱分析的结果的图。图1 是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0886菌株的聚合 物的"C-NMR光谱分析的结果的图。图15c是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0886菌株的聚合 物的"C-NMR光谱分析的结果的图。图16是显示重组质粒pACYC117AB的构成的概略图。图17是实施例3所制备的聚合物的分子量分布曲线。图18是表示实施例3所制备的聚合物的热分析的测定结果的图。图19是表示实施例3所制备的聚合物的GC/MS分析的结果的图。图20是表示实施例3所制备的聚合物的1H-NMR光谱分析的结果的图。图21是表示实施例3所制备的聚合物的13C-NMR光谱分析的结果的图。图22是表示实施例3所制备的聚合物的1HuC-NMR光谱分析的结果的图。图23是作为标准物质的聚乳酸的HPLC图。图M是作为标准物质的聚[羟基丁酸(HB)-C0-羟基戊酸(HV)-C0-羟基己酸 (HHx) ](HB :70mol %、HV :23mol %、HHx :7mol % )的 HPLC 图。图25是实施例4所得的聚合物的HPLC图。符号说明phaA 来源于真养产碱杆菌的β KT基因phaB 来源于真养产碱杆菌的AACoA-R基因phaC(Re)来源于真养产碱杆菌的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phaC(Bc)来源于蜡状芽孢杆菌的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phaCl (WT)来源于假单胞菌种61_3的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因(野生型)phaC2 来源于假单胞菌种61-3的聚羟基脂肪酸酯合成酶2基因PCT 来源于埃氏巨球形菌的Pct基因PRe 来源于真养产碱杆菌的启动子Plac 乳糖操纵子启动子
具体实施例方式本发明涉及一种由3HB和LA形成的共聚聚酯的制造方法，其包括下述工序(1)和 工序⑵，工序(1)在含碳源的培养基中培养具有催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应 的蛋白质、催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质、催化乙酰乙酰CoA的 还原反应的蛋白质、以及包含下述(a)或(b)的氨基酸序列的催化聚羟基脂肪酸酯的合成 反应的蛋白质的重组微生物，(a)序列号2所示氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位氨基酸 的至少1个以上被置换成了其它氨基酸的氨基酸序列，(b)在(a)所定义的蛋白质中，进而除第130位、第325位、第477位和第481位以 外的至少1个以上氨基酸缺失或被置换，或者插入了 1个以上氨基酸残基的氨基酸序列；
工序O)从上述工序(1)的培养物中回收上述共聚聚酯。以下，对于本发明中使用的蛋白质、重组微生物和本发明的制造方法的诸条件进 行说明。(1)催化向丙酸和/或乳酸(LA)转移CoA的反应的蛋白质本发明中使用的“催化向丙酸和/或LA转移CoA的反应的蛋白质”是具有催化由 适当的CoA底物向丙酸和/或LA转移CoA的反应的活性的蛋白质。具有该活性的蛋白质 一般被称为丙酰CoA转移酶(丙酰辅酶A转移酶，Propionyl CoA Transferase, Pet)。以 下，在本发明中，将该蛋白质表示为Pet。表1显示到目前位置报告的Pct的来源(微生物名)的代表例、以及公开了编码 它们的碱基序列信息的文献信息。[表1]
权利要求
1.一种由3-羟基丁酸和乳酸形成的共聚聚酯的制造方法，其包括下述工序(1)和工序(2),工序(1)在含碳源的培养基中培养具有催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋 白质、催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质、催化乙酰乙酰CoA的还原 反应的蛋白质、以及包含下述(a)或(b)的氨基酸序列的催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应 的蛋白质的重组微生物，(a)序列号2所示氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位氨基酸的至 少1个以上被置换成了其它氨基酸的氨基酸序列，(b)在(a)所定义的蛋白质中，进而除第130位、第325位、第477位和第481位以外的 至少1个以上氨基酸缺失或被置换，或者插入了 1个以上氨基酸残基的氨基酸序列；工序O)从工序(1)的培养物中回收上述共聚聚酯。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋 白质的氨基酸序列，是序列号4所示氨基酸序列，或者在序列号4所示氨基酸序列中缺失、 置换或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的制造方法，其中，催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的 反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号6所示氨基酸序列，或者在序列号6所示氨基酸序列 中缺失、置换或添加了 1个或几个氨基酸的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的制造方法，其中，催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质的氨 基酸序列，是序列号8所示氨基酸序列，或者在序列号8所示氨基酸序列中缺失、置换或添 加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质 的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸分别被置换成 了其它氨基酸的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质 的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸同时被置换了 的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质 的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位的Ser被置换成了 Thr、第481位的 Gln被置换成了 Lys的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述蛋白质都是由被导入微生物中的重组 表达载体所编码的蛋白质。
9.根据权利要求1 8的任一项所述的制造方法，其中，重组微生物的培养在厌氧条件 下进行。
10.根据权利要求1 9的任一项所述的制造方法，其中，微生物是具有乳酸蓄积能力 的微生物。
11.根据权利要求10所述的制造方法，其中，具有高乳酸蓄积能力的微生物是大肠杆 菌Jw2293菌株、Jw0885菌株或Jw0886菌株。
12.一种包含3-羟基丁酸和乳酸的共聚聚酯的制造方法，其包括下述工序(1)和工序(2),工序(1)在含有除3-羟基丁酸和乳酸以外的羟基脂肪酸和碳源的培养基中培养具有 催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋白质、催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA 的反应的蛋白质、催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质、和包含下述(a)或(b)的氨基酸 序列的催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的重组微生物，(a)序列号2所示氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸的 至少1个以上被置换成了其它氨基酸的氨基酸序列，(b)在(a)所定义的蛋白质中，进而除第130位、第325位、第477位和第481位以外的 至少1个以上氨基酸缺失或被置换，或者插入了 1个以上氨基酸残基的氨基酸序列；工序O)从工序(1)的培养物中回收上述共聚聚酯。
13.根据权利要求12所述的制造方法，其中，催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应 的蛋白质的氨基酸序列，是序列号4所示氨基酸序列，或者在序列号4所示氨基酸序列中缺 失、置换或添加了 1个或几个氨基酸的氨基酸序列。
14.根据权利要求12所述的制造方法，其中，催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA 的反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号6所示氨基酸序列，或者在序列号6所示氨基酸序 列中缺失、置换或添加了 1个或几个氨基酸的氨基酸序列。
15.根据权利要求12所述的制造方法，其中，催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质的 氨基酸序列，是序列号8所示氨基酸序列，或者在序列号8所示氨基酸序列中缺失、置换或 添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。
16.根据权利要求12所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白 质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸分别被置换 成了其它氨基酸的氨基酸序列。
17.根据权利要求12所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白 质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸同时被置换 了的氨基酸序列。
18.根据权利要求16或17所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的 蛋白质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位的Ser被置换成了 Thr、第481 位的Gln被置换成了 Lys的氨基酸序列。
19.根据权利要求12所述的制造方法，其中，所述蛋白质都是由被导入微生物中的重 组表达载体所编码的蛋白质。
20.根据权利要求12 19的任一项所述的制造方法，其中，除3-羟基丁酸和乳酸以外 的羟基脂肪酸的前体，是选自丙酸、戊酸、十二烷酸、4-羟基丁酸和4-羟基戊酸中的一种以 上前体。
21.根据权利要求12 20的任一项所述的制造方法，其中，重组微生物的培养在厌氧 条件下进行。
22.根据权利要求12 21的任一项所述的制造方法，其中，微生物是具有乳酸蓄积能 力的微生物。
23.根据权利要求22所述的制造方法，其中，具有高乳酸蓄积能力的微生物是大肠杆 菌Jw2293菌株、Jw0885菌株或Jw0886菌株。
24.一种重组微生物，其表达催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋白质、催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质、催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白 质、以及包含下述(a)或(b)的氨基酸序列的催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质，(a)序列号2所示氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸的 至少1个以上被置换成了其它氨基酸的氨基酸序列，(b)在(a)所定义的蛋白质中，进而除第130位、第325位、第477位和第481位以外的 至少1个以上氨基酸缺失或被置换，或者插入了 1个以上氨基酸残基的氨基酸序列。
25.根据权利要求M所述的重组微生物，其中，催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应 的蛋白质的氨基酸序列，是序列号4所示氨基酸序列，或者在序列号4所示氨基酸序列中缺 失、置换或添加了 1个或几个氨基酸的氨基酸序列。
26.根据权利要求M所述的重组微生物，其中，催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰 CoA的反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号6所示氨基酸序列，或者在序列号6所示氨基 酸序列中缺失、置换或添加了 1个或几个氨基酸的氨基酸序列。
27.根据权利要求M所述的重组微生物，其中，催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质 的氨基酸序列，是序列号8所示氨基酸序列，或者在序列号8所示氨基酸序列中缺失、置换 或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。
28.根据权利要求M所述的重组微生物，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋 白质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸分别被置 换成了其它氨基酸的氨基酸序列。
29.根据权利要求M所述的重组微生物，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋 白质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸同时被置 换了的氨基酸序列。
30.根据权利要求观或四所述的重组微生物，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应 的蛋白质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位的Ser被置换成了 Thr、第 481位的Gln被置换成了 Lys的氨基酸序列。
31.根据权利要求M所述的重组微生物，其中，所述蛋白质都是由被导入微生物中的 重组表达载体所编码的蛋白质。
32.根据权利要求M 31的任一项所述的重组微生物，其中，微生物是具有乳酸蓄积 能力的微生物。
33.根据权利要求32所述的重组微生物，其中，具有高乳酸蓄积能力的微生物是大肠 杆菌Jw2293菌株、Jw0885菌株或Jw0886菌株。
全文摘要
本发明的目的是提供以糖为原料通过微生物发酵来高效地生产包含3HB和LA的共聚聚酯的方法。本发明提供由3-羟基丁酸和乳酸形成的共聚聚酯的制造方法，其包括下述工序(1)和工序(2)，工序(1)在含碳源的培养基中培养具有催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋白质、催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质、催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质、以及包含下述(a)或(b)的氨基酸序列的催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的重组微生物，(a)序列号2所示氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位氨基酸的至少1个以上被置换成了其它氨基酸的氨基酸序列，(b)在(a)所定义的蛋白质中，进而除第130位、第325位、第477位和第481位以外的至少1个以上氨基酸缺失或被置换，或者插入了1个以上氨基酸残基的氨基酸序列；工序(2)从工序(1)的培养物中回收上述共聚聚酯。本发明的制造方法能够以廉价的碳源为原料有效地制造由3HB和LA形成的共聚聚酯，从而能够降低生物降解性塑料的制造成本。
文档编号C12N1/21GK102066560SQ20098012368
公开日2011年5月18日 申请日期2009年4月23日 优先权日2008年4月23日
发明者佐藤康治, 大野克博, 小畑充生, 山田美和, 嶋村隆, 幸田胜典, 松本谦一郎, 田口精一, 田岛健次, 神户浩美 申请人:丰田自动车株式会社, 国立大学法人北海道大学