专利名称：植物病毒表达载体及其用于在植物基因组中产生遗传型变异的用途的制作方法
植物病毒表达载体及其用于在植物基因组中产生遗传型变
异的用途发明的领域和背景本发明在其一些实施方案中涉及植物病毒表达载体，并且更特别但非排它地，涉 及该病毒表达载体用于在植物基因组中产生遗传型变异的用途。作物的遗传修饰和改进以及新品种的保护是现代农业的基础。在过去的若干年 中，从各种大基因组测序工程中获得了巨量的数据，这使得在农业转基因技术中产生显著 的进步。此类技术包括植物基因组序列的基因表达、基因修饰、位点特异性基因诱变和基因 打靶，这发展了基础植物研究模式并且可直接用于农业上重要的植物物种的遗传改良和保 护。将源自土壤杆菌(Agrobacterium)的外源DNA分子(例如，T-DNA)整合至植物基 因组中，整合入可通过稀有切割限制性酶产生的天然双链断裂处(DSB)。这些DSB可通过 植物非同源末端接合(NHEJ)蛋白识别并修复，并且导致了外源DNA频繁地整合到这些随机 位点中[Salomon 等，EMBO J(1998) 17 :6086-6095 Jzfira 等，Plant Physiol (2003) 133 1011-1023，Tzfira 等，Trends Genet (2004) 20 :375-383] DSB 还可以导致经改进的在植 物细胞中基于同源重组(HR)的基因打靶[Puchta等，Proc Natl Acad Sci USA(1996) 93 5055-5060]。在锌指核酸酶(ZFN)作为用于基因组修饰的新工具的领域的最新进展给植物基 因组中DSB的位点特异性诱导和用于植物物种基因打靶及植物保护的基于NHEJ的方法的 发展带来了新的希望。ZFN是合成的限制性酶，可将其特异地设计为结合并切割dsDNA序列 的几乎任意的长片段(参见
图1)。ZFN显示适于应用非病毒载体在植物物种中位点特异性 地诱导基因组 DSB [Lloyd 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (2005) 102 :2232-2237 ；Tovkach 等，The Plant Journal (2009) 57,747-757] 在人类[Moehle 等，Proc Natl Acad Sci USA (2007) 104 :3055-3060]和昆虫基因组[Beumer 等，Genetics (2006) 172 :2391-2403]中 也显示了类似的效果。植物病毒作为载体以在植物中引入并表达非病毒基因的用途已得到了很好的证 实[例如，Donson 等，Proc Natl Acad Sci USA. (1991)88 :7204-8 ； Chapman 等，Plant J. (1992) 2 :549-57 ；Dolja 等，Virology (1998) 252 :269-74]。用经修饰的病毒感染植 物比再生稳定转化的植物(如上所述)更简单且更快，因为植物病毒通常很小(3000至 10，000核苷酸之间)，容易操作，具有进入植物细胞的固有能力，导致异源基因的迅速表达 并且将增殖以产生高拷贝量的目标基因。已改造了病毒载体以用于递送遗传材料并在植 物中表达重组蛋白[例如，Pogue, Annu. Rev. Phytopathol. (200 40 :45-74 ;Gleba，等， Curr. Opin. Plant Biol. (2004)7 :182-188 ；Dolja 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89 10208-10212 ；RNA病毒载体的US专利号5316931和US专利号5811653]。病毒表达系统被 认为是瞬时表达系统，因为病毒载体不整合至宿主基因组中，然而，取决于使用何种病毒， 病毒复制和基因表达可维持很长的时间(长达数周或数月)。至今，没有记载或建议病毒载体用于在植物基因组中引入DSB的用途。
相关技术美国专利7，229，829号公开了携带用于递送至植物中的异源核酸序列的TRV载体 (TRV-RNA1和TRV-RNA2)，其用于转化植物和植物细胞。具体地，美国专利7，229，829号教 导了诱导基因沉默的病毒(VKS)的载体，包括设计用于抑制宿主植物基因表达(例如，用 于敲除基因表达而不需要遗传转化该植物的反义转录物)的载体，或设计用于表达异源核 酸(例如，介导基因沉默或基因抑制的核酸)的载体。美国
发明者A·朱克, A·瓦因斯坦 申请人:丹齐格创新有限公司, 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司