专利名称：一种检测嗜铁细菌的检测剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测嗜铁细菌的检测剂和检测方法，尤其是一种适应用于从植物 根系土壤的检测嗜铁细菌的检测剂。
背景技术：
嗜铁菌作为一类重要的植物根际促生菌，主要通过分泌嗜铁素，螯合环境中的铁 离子，增加土壤中铁的生物有效性，满足微生物和植物生长需要，促进植物生长；同时使环 境中的铁的浓度进一步降低，病原微生物由于缺乏铁而不能生长繁殖，进而达到控制植物 病害的目的。目前嗜铁素的检测及嗜铁菌的筛选主要采用通用CAS检测平板法。CAS蓝色 检测液是由铬天青(Chrome AzurolSulphonate, CAS)、溴化十六烷基三甲铵(Hexadecyltr imethy 1 -ammoniumbromide,HDTMA)和铁离子组成的一种复合物，呈亮蓝色。当蓝色检测平 板中的铁离子被微生物分泌的嗜铁素夺走时，即可在微生物生长的菌落周围形成橘黄色晕 圈。CAS检测平板法可用于大多数细菌和真菌分泌的嗜铁素检测，适合于初步筛选产嗜铁 素的菌株，还可根据菌落周围晕圈的大小初步判定产嗜铁素的能力大小，该方法相对比较 简单、方便。但是，该方法检测平板制作烦琐，且检测剂使用量大。双层平板法，下层为通用 CAS检测平板，上层为相应的微生物固体培养基，下层为通用CAS检测平板，可以解决微生 物生长限制的问题，但制作步骤烦琐。Milagres等对检测方法进行了改良，将检测平板一分 为二，一部分用于培养待测菌，另一部分用于检测嗜铁素的产生。经改良的检测平板可用于 所有微生物嗜铁素的检测，然而，该方法耗时太长(需培养15天左右)，待培养物长满培养 用培养基，方可查看结果，而且一个平板仅限于对一个分离物的检测。
发明内容
为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种检测嗜铁细菌的检测剂和检测 方法，缩短检测时间。为达到上述目的，本发明采取的技术方案是按重量比，含有0.0057% -0. 0059% 铬天青 s、0. 0070% -0. 0074% HDTMA,2. 79% -3. 19%哌嗪-1，4-二乙磺酸(Piperazine-1， 4-bis(2-ethanesulfonic acid), PIPES) ,0. 07% _0· 11% FeCl3 · 6Η20,0. 49% _0· 89%琼脂粉。由于在检测嗜铁细菌的检测剂中使用了 0. 49% -0. 89%的琼脂粉作为凝固剂，低 浓度的凝固剂使微生物产生的嗜铁素迅速扩散，缩短检测时间。本发明设计了，1升重量为IOlOg的检测嗜铁细菌的检测剂中含有58. 5-60. 5mg 铬天青 S、70. 9-74. 9mg HDTMA,28. 24-32. 24mg 哌嗪 _1，4_ 二 乙磺酸(Piperazine-1， 4-bis(2-ethanesulfonic acid)，PIPES)、0· 8-1. 2mM FeCl3 · 6H20、5_9g 琼脂粉。由于在1升重量为IOlOg的检测嗜铁细菌的检测剂中使用了 5_9g琼脂粉作为凝 固剂，低浓度的凝固剂使微生物产生的嗜铁素迅速扩散，缩短检测时间。四
附图为本发明的实施例一的1小时后的显色结果示意图。
五具体实施例方式本发明的第一个实施例，按重量比，检测嗜铁细菌的检测剂中含有 0. 0057 % 铬天青 S、0. 0070 % HDTMA、2. 79 % 哌嗪 _1，4_ 二 乙磺酸(Piperazine-1， 4-bis(2-ethanesulfonic acid)，PIPES)、0· 07% FeCl3 · 6Η20、0· 49%琼脂粉。本发明的第二个实施例，按重量比，检测嗜铁细菌的检测剂中含有 0. 0059 % 铬天青 S、0. 0074 % HDTMA、3. 19 % 哌嗪 _1，4_ 二 乙磺酸(Piperazine-1， 4-bis(2-ethanesulfonic acid), PIPES) ,0. 11% FeCl3 · 6Η20、0· 89%琼脂粉。本发明的第三个实施例，按重量比，检测嗜铁细菌的检测剂中含有 0. 0058 % 铬天青 S、0. 0072 % HDTMA、3. 10 % 哌嗪 _1，4_ 二 乙磺酸(Piperazine-1， 4-bis(2-ethanesulfonic acid)，PIPES)、0· 09% FeCl3 · 6Η20、0· 61%琼脂粉。本发明的第四个实施例，以1升重量为IOlOg为例，含有60. 5mg铬天青S、72.9mg HDTMA、30. 24mg 哌嗪 _1，4_ 二 乙磺酸(Piperazine-1，4_bis (2-ethanesulfonic acid), PIPES)、ImM FeCl3 · 6H20(溶于 IOmL IOmMHCl)、7g 琼脂粉。本发明的第五个实施例，以1升重量为IOlOg为例，含有58. 5mg铬天青S、70.9mg HDTMA、28. 24mg 哌嗪 _1，4_ 二 乙磺酸(Piperazine-1，4_bis (2-ethanesulfonic acid), PIPES)、0· 8mM FeCl3 · 6H20(溶于 IOmL IOmMHCl)、5g 琼脂粉。本发明的第六个实施例，以1升重量为IOlOg为例，含有62. 5mg铬天青S、74.9mg HDTMA、32. 24mg 哌嗪 _1，4_ 二 乙磺酸(Piperazine-1，4_bis (2-ethanesulfonic acid), PIPES)、1. 2mM FeCl3 · 6H20(溶于 IOmL IOmMHCl)、9g 琼脂粉。先将微生物(已分离获得的微生物或平板稀释法分离的微生物平板)接种于最适 培养基中，等培养好后，使用1. 5-2mL将检测剂覆盖一薄层于培养物上，15分钟内即可看到 覆盖层上颜色的变化。显色后，用灭菌牙签穿过覆盖层将产生晕圈的菌落挑出，接种于相应 液体培养基进行振荡培养后接种于相应的固体平板上。本发明具有以下特点1、检测剂中低浓度的凝固剂便于微生物产生的嗜铁素迅速扩散，并缩短显色时间，以快速检测出平板中微生物产生的嗜铁素。2、而且只需在培养好的微生物平板上覆盖一薄层检测剂，既满足了微生物生长的 需求，减少了检测剂的用量，同时还便于目标分离物的挑取以纯化培养。3、不仅能简化CAS检测平板制作的步骤，而且还能以少量的检测液快速检测出微 生物产生的嗜铁素，并筛选出平板中的嗜铁菌。
权利要求
一种检测嗜铁细菌的检测剂；其特征是按重量比，含有0.0057％-0.0059％铬天青S、0.0070％-0.0074％HDTMA、2.79％-3.19％哌嗪-1，4-二乙磺酸(Piperazine-1，4-bis(2-ethanesulfonic acid)，PIPES)、0.07％-0.11％ FeCl3·6H2O、0.49％-0.89％琼脂粉。
2.根据权利要求1所述的检测嗜铁细菌的检测剂；其特征是1升重量为IOlOg的检 测嗜铁细菌的检测剂中含有58. 5-60. 5mg铬天青S、70. 9-74. 9mgHDTMA、28. 24-32. 24mg哌 嗪-1,4-二 乙磺酸(Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), PIPES)、0. 8—1. 2mM FeCl3 · 6H20、5-9g 琼脂粉。
全文摘要
一种检测嗜铁细菌的检测剂，按重量比，含有0.0057％-0.0059％铬天青S、0.0070％-0.0074％HDTMA、2.79％-3.19％哌嗪-1，4-二乙磺酸(Piperazine-1，4-bis(2-ethanesulfonic acid)，PIPES)、0.07％-0.11％FeCl3·6H2O、0.49％-0.89％琼脂粉；由于低浓度的凝固剂使微生物产生的嗜铁素迅速扩散，因此缩短检测时间。
文档编号C12Q1/04GK101805778SQ201010163639
公开日2010年8月18日 申请日期2010年4月28日 优先权日2010年4月28日
发明者余贤美, 周广芳, 沈广宁, 艾呈祥 申请人:山东省果树研究所