专利名称：副溶血性弧菌的实时fq-pcr检测试剂盒及检测方法
专利说明副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒及检测方法 (一)发明领域 本发明涉及微生物测量的组合物，具体地说是涉及一种副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒及检测方法，FQ-PCR即为实时荧光定量聚合酶链反应。
背景技术：
副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus，vp)是一种嗜盐性细菌，属弧菌科(vibrio)弧菌属，存在于近海的海水、海底沉积物和鱼类、虾类、贝壳类等海产品中，是我国大陆沿海地区食物中毒和急性腹泻的主要病原菌。神奈川现象(Kanagawa phenomenon，kp)阳性菌株为致病菌株，该菌株含两种致病因子基因(tdh与trh)，从tdh与trh基因序列中设计的PCR引物可使神奈川现象阴性菌株漏检。不能完整地反映食品中副溶血性弧菌污染的详细情况。
目前，我国食品副溶血性弧菌国家标准检测方法是细菌培养法(GB4789-2003)，国标要求检测食品中所有副溶血性弧菌，但国标方法需经增菌、分离培养、生化鉴定、血清凝集等，存在操作繁琐、所需时间长(约4天)等不足。
随着微生物基因组学的发展，近年来又出现了一种实时荧光定量PCR技术，该技术把荧光标记、探针、计算机与PCR四种技术融为一体，是目前国际上公认的最灵敏、特异、重复性最好的核酸定性定量检测方法(本领域内普遍技术人员都知道)。根据副溶血弧菌的不耐热溶血素基因Thermolabilehemolysin或简称TLH的序列设计引物，可以进行所有已知的副溶血性弧菌的常规PCR检测。但是直接使用常规的PCR检测试剂盒来检测副溶血性弧菌，尚存在下列难以解决的技术问题1、常规的PCR检测试剂盒的反应管内不含有TaqMan探针，必须“开盖操作”将PCR产物转移，进行琼脂糖电泳或Southem转移杂交等实验对PCR产物进行鉴定，容易污染，造成假阳性，而且耗费时间(4-5小时)，国家卫生部已限制其在临床上使用；2、常规PCR检测试剂盒不含标准品，不能对副溶血性弧菌进行定量检测；3、常规PCR检测试剂盒不能对副溶血性弧菌进行实时监测；4、常规PCR检测试剂盒灵敏度低。
发明内容
本发明的目的是提供一种可定量定性、操作简便、实时快速、特异度好、灵敏度高、重复性好的副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒及检测方法，解决目前在副溶血性弧菌检测中需经增菌、分离培养、生化鉴定、血清凝集等步骤，从而使操作繁琐、所需时间长等不足，并能实现快速检测所有副溶性弧菌的效果。
所述的副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒由以下试管和各部分组成副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒包括PCR反应液管、样本处理液管、阳性对照管、阴性对照管、标准品管、去离子水管。
(1)、2×PCR反应液内含2×PCR缓冲液、Taq酶、Mg++、KCl，序列为5′—CAC GCA TTG CGCTCT GAG T—3′的上游引物、序列为5′—CGA GAC ATC CCA GAA CAC AAA—3′的下游引物、序列为5′—FAM—TCG GGC GTC TGG TGC TGA—TAMRA—3′的TaqMan探针、去离子水； (2)、DNA提取剂内含0.9％ NaCl和0.1％二硫基乙醇； (3)、阳性对照管内含副溶血性弧菌TLH基因； (4)、阴性对照管不含副溶血性弧菌TLH基因； (5)、标准品管病毒拷贝数浓度，2×107cfu/ml、2×106cfu/ml、2×105cfu/ml、2×104cfu/ml、10μM上游引物、10μM下游引物、3μMTaqMan探针； (6)、去离子水管管内试剂为去离子水，即为无菌双蒸水。
副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒中，其2×PCR反应液浓度为两倍稀释，上游引物浓度为10μM，下游引物浓度为10μM，TaqMan探针浓度为3μM，双蒸水各试剂的体积比为2×PCR反应液上游引物下游引物TaqMan探针＝10044468。
所述的检测方法，是副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒用于快速检测所有副溶性弧菌的方法，该检测方法由下列步骤组成先采集和处理待测标本再进行加样。
(1)、每份PCR反应液的配制； (2)、溶血性弧菌模板制备； (3)、标准品与阴性对照，阳性对照模板制备的各步骤与溶血性弧菌模板制备相同；； (4)、待测样品、标准品； (5)、预变性； (6)、聚合酶链反应，也称为基因扩增； (7)、结果判断。
每份PCR反应液的配制2×PCR反应液10μl、上游引物0.4μl、下游引物0.4μl、TaqMan探针0.4μl、去离子水6.8μl，共18μl，混合即成； 溶血性弧菌模板制备吸取样本或菌液1ml到1.5ml尖底塑料管，用14000转/分钟，离心10分钟，轻轻倒掉上层液体，各加蒸馏水50μl，加DNA提取剂50μl混合，在100℃，15分钟，然后在冰水中冷却2分钟，用13000转/分钟，离心10分钟，上清液即为定时荧光定量PCR模板； 预变性94℃，60秒，1个循环，扩增94℃，5秒，60℃，30秒共40个循环； 结果判断标准曲线的相关系数(r)≧0.985或≦-0.985；Ct值<38时为阴性结果，38≦Ct<40时需重新测定，Ct值＝0或Ct值＝40为阴性结果。
采用本发明方法有益效果在于 1、可定量定性，测定数据范围2.0×101～2.0×108cfu/ml； 2、操作简便、实时快速全程共4步(菌液离心、DNA提取、加样、上机)，约60分钟完成并可随时观察扩增效果； 3、控制PCR产物污染，由于加盖，而且扩增产物不需电泳观察，防止扩增产物污染环境； 4、特异度好与霍乱弧菌、溶藻性弧菌等9种肠道细菌无交叉反应，灵敏度高最低检测限20cfu/ml副溶血性弧菌； 5、重复性好，适宜质量和精密度控制。
2.0×108cfu/ml s＝0.125cv＝1.105％ 2.0×107cfu/ml s＝0.100cv＝0.703％ 2.0×106cfu/ml s＝0.260cv＝1.535％ 2.0×105cfu/ml s＝0.212cv＝1.057％ 2.0×104cfu/ml s＝0.557cv＝2.244％ 2.0×103cfu/ml s＝0.157cv＝0.541％
图1为本发明中试剂盒的实施例的纵向剖视图。
图2为本发明中试剂盒的实施例的横向剖视图。
图1、图2中1、纸盒 2、衬板 3、有盖大塑料管 4、有盖小塑料管 具体实施例方式 下面结合实施例对本发明作进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。2×PCR反应液，内含2×PCR反应液、MgCl、dNTP、Taq酶等，如图1所示，所述的副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒，由纸盒1和衬板2形成空槽，空槽中设有有盖大塑料管3和有盖小塑料管4，有盖大塑料管3和有盖小塑料管4由以下组成，即所述的副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒由以下试管和各部分组成 (1)、2×PCR反应液序列为5′—CACGCATTGCGCTCTGAGT—3′的10μM上游引物、序列为5′—CGA GAC ATC CCA GAA CAC AAA—3′的10μM下游引物、序列为5′—FAM—TCG GGCGTC TGG TGC TGA—TAMRA—3′的3μM TaqMan探针、去离子水； (2)、样本处理液管； (3)、DNA提取剂内含0.9％NaCl和0.1％二硫基乙醇； (4)、阳性对照管内含副溶血性弧菌TLH基因； (5)、阴性对照管不含副溶血性弧菌TLH基因； (6)、标准品管病毒拷贝数浓度2×107cfu/ml、2×106cfu/ml、2×105cfu/ml、2×104cfu/ml，10μM上游引物、10μM下游引物、3μMTaqMan探针； (7)、去离子水管管内试剂为去离子水，即为无菌双蒸水副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒中，2×PCR反应液浓度为两倍稀释，上游引物浓度为10μM，下游引物浓度为10μM，TaqMan探针浓度为3μM，双蒸水各试剂的体积比为2×PCR反应液上游引物下游引物TaqMan探针＝10044468。
所述的检测方法，是副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒用于快速检测所有副溶性弧菌的方法，该检测方法由下列步骤组成 (1)液体样品处理吸取样本1ml放入到1.5ml空eppendorf管，15000转/分离心10分钟，弃尽上层液加蒸馏水与DNA提取剂各50ml混匀，在100℃，15分钟，13000转/分，离心10分钟，上层液即为实时荧光PCR反应模板，固体样本加等量生理盐水(w/v)，研磨混匀后2000转/分低速离心取上层液1ml，进入液体样品处理步骤； (2)、每份PCR反应液的配制2×PCR反应液10μl、上游引物0.4μl、下游引物0.4μl、TaqMan探针0.4μl、去离子水6.8μl，共18μl，混合即成，按所需测定量配制，分装每管18μl； (3)、溶血性弧菌模板制备吸取样本或菌液1ml到1.5ml尖底塑料管，用14000转/分钟，离心10分钟，轻轻倒掉上层液体，各加蒸馏水50μl，加DNA提取剂50μl混合，在100℃，15分钟，然后在冰水中冷却2分钟，用13000转/分钟，离心10分钟，上清液即为定时荧光定量PCR模板； (4)、标准品与阴性对照，阳性对照模板制备的各步骤与溶血性弧菌模板制备相同； (5)、待测样品、标准品阴、阳性对照模板各取2μl分别加入测定定时荧光测量PCR反应液中，加盖后4000转/分钟，离心1分钟； (6)、预变性94℃，60秒，1个循环，扩增94℃，5秒，60℃，30秒共40个循环； (7)、基线与阈值设定(以Light Cycler荧光PCR仪为例)基线与阈值设定，以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且阴性对照品的Ct值＝0为原则，调整起始阈值； (8)结果判断定量测定时，标准Ct值<38时为阴性结果，38≦Ct<40时需重新测定，Ct值＝0或Ct值＝40为阴性结果。
权利要求
1、一种副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒及检测方法，其特征在于
所述的副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒由以下试管和各部分组成
(1)、2×PCR反应液内含2×PCR缓冲液、Taq酶、Mg++、KCl，序列为5/—CAC GCA TTG CGC TCTGAG T—3/的上游引物、序列为5/—CGA GAC ATC CCA GAA CAC AAA—3/的下游引物、序列为5/—FAM—TCG GGC GTC TGG TGC TGA—TAMRA—3/的TaqMan探针、去离子水。
(2)、DNA提取剂内含0.9％NaCl和0.1％二硫基乙醇；
(3)、阳性对照管内含副溶血性弧菌TLH基因；
(4)、阴性对照管不含副溶血性弧菌TLH基因；
(5)、标准品管病毒拷贝数浓度2×107cfu/ml、2×106cfu/ml、2×105cfu/ml、2×104cfu/ml；
(6)、去离子水管管内试剂为去离子水，即为无菌双蒸水；
所述的检测方法，是副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒用于快速检测所有副溶性弧菌的方法，该检测方法由下列步骤组成
(1)、每份PCR反应液的配制；
(2)、溶血性弧菌模板制备；
(3)、标准品与阴性对照，阳性对照模板制备的各步骤与溶血性弧菌模板制备相同；
(4)、待测样品、标准品；
(5)、预变性；
(6)、聚合酶链反应，也称为基因扩增；
(7)、结果判断。
2、根据权利要求1所述的副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒及检测方法，其特征在于上述2×PCR反应液浓度为两倍稀释，上游引物浓度为10μM，下游引物浓度为10μM，TaqMan探针浓度为3μM，双蒸水各试剂的体积比为
2×PCR反应液上游引物下游引物TaqMan探针＝10044468。
3、根据权利要求1所述的副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒及检测方法，其特征在于该方法由下列步骤组成
(1)、PCR反应液的配制2×PCR反应液10μl、上游引物0.4μl、下游引物0.4μl、TaqMan探针0.4μl、去离子水6.8μl，共18μl，混合即成；
(2)、溶血性弧菌模板制备吸取样本或菌液1ml到1.5ml尖底塑料管，用14000转/分钟，离心10分钟，轻轻倒掉上层液体，各加蒸馏水50μl，加DNA提取剂50μl混合，在100℃，15分钟，然后在冰水中冷却2分钟，用13000转/分钟，离心10分钟，上清液即为定时荧光定量PCR模板；
(3)、标准品与阴性对照，阳性对照模板制备的各步骤与溶血性弧菌模板制备相同；
(4)、待测样品、标准品，阴、阳性对照模板各取2μl分别加入测定定时荧光测量PCR反应液中，加盖后4000转/分钟，离心1分钟；
(5)、预变性94℃，60秒，1个循环，扩增94℃，5秒，60℃，30秒共40个循环。
(6)、结果判断标准曲线的相关系数(r)≧0.985或≦-0.985；Ct值<38时为阴性结果，38≦Ct<40时需重新测定，Ct值＝0或Ct值＝40为阴性结果。
全文摘要
本发明涉及一种副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒及检测方法，副溶血性弧菌的实时FQ-PCR检测试剂盒包括PCR反应液管、样本处理液管、阳性对照管、阴性对照管、标准品管、去离子水管，其2×PCR反应液浓度为两倍稀释，上游引物浓度为10μM，下游引物浓度为10μM，TaqMan探针浓度为3μM，双蒸水各试剂的体积比为2×PCR反应液∶上游引物∶下游引物∶TaqMan探针＝100∶4∶4∶4∶68；检测方法为快速检测所有副溶性弧菌，先采集和处理待测标本再进行加样，PCR反应液配制、溶血性弧菌模板制备、标准品与阴性对照、阳性对照模板制备、待测样品标准品、预变性、聚合酶链反应和结果判断，本发明具有定量定性，实时快速简便，特异度好，重复性好，适宜质量控制，防止FQ-PCR产物污染的效果。
文档编号C12Q1/68GK101381765SQ200710070688
公开日2009年3月11日 申请日期2007年9月6日 优先权日2007年9月6日
发明者王志铮, 王忠发, 阳 杨, 王虹玲 申请人:浙江海洋学院, 舟山市疾病预防控制中心