专利名称：一种酸性淀粉酶amya4及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性淀粉酶AMYA4及其基因 和应用。
背景技术：
α-淀粉酶(α-amylase)是目前最重要的工业酶制剂之一，广泛地存在于动植物 和微生物中，它是一种内切葡萄糖苷酶，按照国际酶委会(Enzyme Commission)的标准为 EC3.2. 1. 1。α-淀粉酶作用于淀粉时，从淀粉分子内部任意切开α-1，4键，使淀粉分子迅 速降解，生成糊精和还原糖。α-淀粉酶作用于淀粉通常使淀粉失去碘的成色反应。在水解 直链淀粉时，α-淀粉酶随机切开α _1，4键，使淀粉水解成低聚麦芽糖和寡糖，然后再水解 成麦芽糖和葡萄糖。在以支链淀粉为底物时，α-淀粉酶可以随机切开α-1，4键，但是不 能切开α-1，6键和紧靠的α _1，4键，因此水解产物中除麦芽糖和葡萄糖外，还含有一部分 极限糊精(Penayanez et al.，1963 ；尤新，1997)。α -淀粉酶水解淀粉的产物末端葡萄糖 残基Cl碳原子的光学性质呈为α _构型，故称α -淀粉酶(尤新，1997)。α -淀粉酶是目 前最重要的工业酶制剂之一，在味精、饴糖、麦芽糖醇、糊精、葡萄糖、酒精、啤酒、乳酸、柠檬 酸等工业中发挥着巨大作用。由于一些细菌α-淀粉酶具有耐高温、耐酸、耐碱等特性，更 符合工业生产中的各种极端条件，因此当今广泛使用的α-淀粉酶多数是来源于细菌(解 淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)的淀粉酶，尤其是在需高温的发酵等工业中使用最为广泛 的是细菌高温α-淀粉酶。α _淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，是食品工业中用量最大的酶类之一。α _淀 粉酶以其优良的性能大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、造纸、纺织品工业和医药 行业等，它曾经占了整个酶制剂市场份额的半壁河山。在传统的淀粉制糖工艺中，以精制淀粉或大米等为原料，通常应用酸水解法制葡 萄糖，由于需要高温、高压和酸催化剂，因此在生产葡萄糖的同时，必定伴有葡萄糖的复合 分解反应，产生一些不可发酵性糖及其一系列有色物质，这不仅降低淀粉转化率，而且由于 生产的糖液质量差，对后续的精制带来不利影响，同时大量酸的使用也对环境带来了很大 的污染。利用双酶法制糖是以作用专一的酶制剂作为催化剂，反应条件温和，复合分解反应 较少，因此采用双酶法生产葡萄糖，提高了淀粉或大米等原料的转化率及糖液浓度，改善了 糖液质量，是目前最为理想的制糖方法。酶液化和酶糖化工艺称为双酶法(尤新，1997)。双酶法制糖淀粉转化率高，吨糖成本低，糖的浓度高，糖液质量高，因此，在味精等 发酵工业中被广泛采用。然而目前工业上应用的是高温淀粉酶和中温糖化酶。高温淀粉酶 的最适作用温度为95°C，而中温糖化酶的最适作用温度为60°C，同时他们的最适ρΗ值也不 相同。高温淀粉酶的最适PH值通常在6. 0-6. 5，而糖化酶的最适pH值通常在4. 0-4. 5。在 双酶法制糖工艺中，淀粉溶解后PH通常在4-5左右，因此需要反复调整pH值和温度，造成 了生产的复杂性和环境问题(Liu and Xu，2008)。α -淀粉酶已经成为工业应用中最为重 要的酶之一，但是酶的大规模商业化生产仍然局限于几种特定的真菌和细菌中。对于高效的α-淀粉酶的需求越来越多。目前来源于脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)属的多个α-淀粉酶基因已经 被纯化，克隆和表达了。比如来源于Alicyclobacillus acidocaldarius的α -淀粉酶 (Matzke etal.，1997 ；Schwermann et al.，1994 ；Yuan et al. ,2005) 它们的性质都属于 酸性，耐热α-淀粉酶。目前对于可以降解生淀粉的淀粉酶的研究也越来越多，已经分离和纯化了多个降 解生淀粉的淀粉酶。Hayashida等(1986)从Aspergillus f icum中纯了得到一个生淀粉淀 粉酶；Hayashida等(1988)随后又从Bacillus subtilis中纯了得到一个生淀粉淀粉酶， 后来陆续的生淀粉水解淀粉酶被分离，纯化或克隆出来(Gangadharan et al.，2009 Jeang et al. ,2002 ；Jeang et al. ,1995 ；Kim et al. ,1990 ；Kim et al. ,1989 ；Saha et al., 1988)。然而报导的来源于脂环酸芽孢杆菌属的淀粉酶并没有降解生淀粉的能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用的酸性淀粉酶。本发明的再一目的是提供编码上述酸性淀粉酶的基因。本发明的另一目的提供上述酸性淀粉酶的应用。本发明从CN200910235943. 1 (
公开日2010. 05. 05)所公开的脂环酸芽孢杆 菌Alicyclobacillus hesperidum A4，(保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为 CGMCCNo. 3147，保藏日期2009年6月29号)中分离得到一种新的酸性淀粉酶AMYA4。根据本发明的酸性淀粉酶AMYA4，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。SEQ ID NO. 1 MNDAMFICLSQLCKRLHRQTTLFTPLHTRIDACGKTTQRGIFVGQIKKTTIAALIALSAALPTAGSVKPVLADANDSTPSIQITSGNDAKAGVASDTLTVAVSGMDIVGTTPDVTLAGADGSTRNLTTDTTVADNSTLHVELPMGDSGLGAGTYTLTVSAGGASASATLTIEPYTSASTIQffDGIYTDDSATYVSIPNPSPGQNVTIRLRAYSGNLTKVVLKAYDTAQSKSFDVEMAPTSTFGPYQLWSATVPASNGGTIYYRFDLYDDNDFACLSGDGLHTSDDTNQNFPLPVGAVTLSTTDANP⑶TVTASDPVGDFSGSGQSQTTVNFLDQSGNVVATTTGSNASWSSVDFTVPKDVPNGLYTVDLDTTAKDADGVTNVSLDRQVP
LLVGPEPAWMQSFYHDSYSSFYRSPFGAVATGTPVILRLRGPVDLKSALLRLWGANGNGSELDLPMQPLAMSATEIEQATGTPDATQYSWWTVTIPASDVTTAGTMWYQFAGQLASGQTVYYDDNGNQLEGPGQPSFSAGGPSYQLSVYNQGFTTPDWLKHAVIYEIMPDRFYNGDIANDENPKTQKGIYTDAVGQETLGPIQFHQDWNSQPYDPNIPASSDPAIQALRGNGQWNIDFFG⑶LKGIQDKLDYLKSLGVNTLYLMPVFEAESNHKYDTADYMKIDPGFGTAQDWLNLAKAAHADGFHILLDGVFEDTGSDSVYFNKFS匪GSLGAWQAYMQNQPNLSPYYSWYEffTNNPANPYNGffffNNDTLPQTDTNNPSFQQFIYGGKDAVAKHWLALGADGWRLDSADNSNYNVTWWSNFRNAVKSIDPNAAIVGEIWNTATNDNGTDWLTGSTFDSVMNYSFRNAVIDFFRGTYNDGSVQHHAVDAAGFNQELMRLYSEYPLQSFYAMMNLVDSQDTMRILTVLENAPEPGSMSALQQATY
QPTATDQQLGIKRLELVSDLQFGFPGDPTIWY⑶EAGVSGYSDPLSRDTYPWGHENEALLNHYRLLGAIRAANPVLQTGTFTPVYAQGEVYAFARTIQGGQDVFGKPAADASAIVALNNQNQTQTVNLPVAGVIANGTKLLDELNDQWYTVENGAVQLTLAPYEGAILVTPTANPVAYLQTINGQTSIAWTPVAGANGYLLLRHQ⑶VWVPVGRPLSANTLSSPVTQGATAVDYAIAALPPVAPGVGLSSGQPLQAVTVPAASLGQPQVQVDVQHSGVSLHITPVPNATQYVVYLQQPDGSYQAVATVAAHGDVHLRLPVAPGTQSISVRVAAQNEDGQAVTDPMVITVNPSAKAQR该酶包括1290个氨基酸，因此淀粉酶AMYA4的理论分子量为138kDa。本发明的淀粉酶AMYA4在酸性范围内均具有较高活性，纯化后其最适pH值为4. 2， 在pH 2. 8 4. 2的范围内维持80%以上的酶活性；在pHl. 2 7. 8的范围内37°C保温60 分钟，能够保持80%以上的酶活性。最适温度为75°C，在55°C -80°C间均具有50%以上的 酶活力；在75°C保温60分钟，剩余酶活达到80%以上。另外，该酶还具有水解生淀粉的能 力。这种性质的淀粉酶还未曾有过报道。本发明提供了编码上述酸性淀粉酶AMYA4的基因。具体地，该基因的基因序列如 SEQ IDNO. 2 所示SEQ ID NO. 2 ATGAATGATGCAATGTTCATATGCCTCAGTCAGTTGTGCAAACGATTGCACAGACAAACCACTCTCTTCACACCATTGCACACCCGCATCGACGCTTGTGGCAAAACAACACAAAGGGGGATTTTTGTGGGCCAAATCAAGAAAACGACCATCGCAGCACTCATCGCCCTGTCCGCGGCTCTGCCAACAGCCGGTTCCGTAAAGCCAGTGCTCGCGGATGCAAACGATTCGACACCATCCATCCAAATTACGTCGGGAAACGACGCTAAGGCTGGCGTGGCGAGTGACACCCTCACCGTCGCCGTGAGTGGTATGGACATTGTCGGAACCACCCCAGACGTCACCTTGGCAGGCGCAGACGGCTCGACGCGCAATCTCACGACCGACACGACCGTCGCGGACAATTCGACACTGCATGTCGAATTGCCCATGGGGGACAGTGGTTTAGGGGCGGGCACGTATACCCTGACGGTCTCT
GCTGGTGGCGCCAGCGCATCCGCGACGCTCACCATTGAGCCGTACACCAGCGCAAGCACCATTCAGTGGGACGGTATCTACACGGACGATTCTGCAACCTACGTTTCGATCCCCAATCCAAGCCCGGGGCAAAACGTCACCATTCGCCTTCGCGCCTACAGCGGCAATTTGACCAAAGTCGTGCTGAAGGCGTACGACACTGCACAGAGCAAATCGTTTGACGTCGAAATGGCGCCGACGTCGACGTTTGGCCCTTATCAGTTGTGGTCGGCGACTGTGCCGGCGTCGAATGGAGGTACCATCTATTATCGGTTTGACCTGTATGATGACAATGACTTCGCTTGTCTTTCCGGCGATGGTCTGCACACAAGCGACGACACGAATCAAAACTTCCCCCTCCCTGTAGGCGCTGTGACGCTGTCCACAACCGACGCAAATCCAGGAGACACGGTGACGGCCTCCGATCCCGTAGGGGATTTCTCGGGCAGCGGCCAGAGCCAAACGACCGTCAACTTCCTTGACCAAAGCGGGAACGTCGTCGCAACGACGACCGGATCAAACGCAAGCTGGTCGAGTGTCGATTTCACAGTGCCAAAAGATGTACCCAACGGACTCTACACGGTCGATCTCGATACCACCGCGAAAGACGCGGATGGTGTGACAAACGTCTCGCTGGATCGGCAGGTGCCACTTTTGGTCGGTCCGGAACCAGCCTGGATGCAGAGCTTTTACCACGACTCGTACA
GTTCGTTTTATCGCAGTCCGTTTGGTGCTGTGGCCACCGGCACACCCGTGATCCTGCGCCTGCGTGGACCTGTAGATTTAAAATCGGCGCTCCTTCGGCTATGGGGTGCAAACGGAAACGGGTCTGAACTCGACTTGCCGATGCAGCCACTCGCGATGTCCGCTACGGAGATCGAACAGGCAACAGGCACGCCCGATGCTACACAATACAGTTGGTGGACCGTGACCATCCCCGCCTCCGATGTGACCACTGCGGGAACCATGTGGTATCAGTTCGCAGGACAACTGGCAAGCGGCCAAACCGTGTACTACGACGACAACGGAAACCAGCTGGAGGGCCCTGGCCAACCGAGCTTTTCTGCCGGCGGGCCCAGCTATCAGTTATCTGTCTATAACCAAGGATTTACGACACCCGACTGGTTGAAACATGCGGTCATCTACGAGATTATGCCGGATCGATTCTACAACGGCGACATAGCGAACGACGAAAATCCAAAGACGCAAAAGGGTATCTACACCGATGCCGTTGGTCAGGAAACGCTGGGTCCTATTCAATTTCATCAGGATTGGAATAGTCAACCATATGATCCAAACATCCCAGCTTCCAGCGATCCAGCCATCCAGGCCCTGCGTGGCAACGGTCAATGGAACATCGACTTTTTCGGTGGCGACCTGAAGGGAATTCAGGATAAGCTCGATTACCTAAAAAGCCTTGGCGTCAATACCCTTTATCTCATGCCTGTGTTTGAGGCCGAGTCCAATCATAAATACGACACGGCCGATTACATGAAGATCGATCCGGGGTTTGGCACCGCCCAGGACTGGCTGAACCTCGCAAAGGCTGCCCATGCAGACGG
ATTTCACATCCTCCTGGACGGCGTGTTTGAAGACACCGGATCGGACAGCGTGTATTTCAACAAATTCAGCAACATGGGTAGCCTTGGCGCCTGGCAGGCCTATATGCAGAATCAACCGAATCTCTCGCCCTACTATAGCTGGTACGAGTGGACCAACAACCCAGCGAATCCGTACAACGGCTGGTGGAACAACGACACGTTGCCGCAGACAGATACGAATAACCCGTCATTTCAGCAATTTATTTACGGCGGCAAAGACGCCGTCGCGAAACACTGGTTGGCGCTTGGCGCCGATGGCTGGCGCCTCGATTCGGCGGACAACAGCAACTATAACGTCACTTGGTGGAGCAATTTCCGCAACGCCGTAAAATCTATTGAT0C CTAACGCAGCAATCGTCGGGGAAATATGGAACACTGCGACAAACGACAACGGCACGGACTGGCTCACCGGATCGACCTTCGACAGCGTCATGAATTACTCATTTCGCAACGCCGTGATCGACTTTTTCCGTGGAACGTACAACGACGGAAGCGTCCAACATCACGCGGTCGACGCGGCGGGATTCAACCAGGAACTGATGCGCCTGTACAGCGAGTATCCTTTGCAGTCGTTCTACGCGATGATGAACCTCGTCGACTCCCAAGATACGATGCGGATTTTGACGGTTCTCGAAAACGCGCCCGAGCCAGGCTCCATGAGCGCCTTGCAACAGGCCACCTACCAGCCCACGGCAACCGATCAACAACTGGGTATCAAGCGCTTAGAGCTCGTGTCTGACCTGCAGTTTGGCTTCCCGGGCGACCCGACCATCTGGTATGGTGACGAAGCGGGCGTTTCGGGTTACAGTGATCCGTTGTCCCGTGACACGTACCCATGGGGCCATGAAAATGAGGCCCTGCTCAACCACTATCGCTTGCTTGGCGCGATTCGCGCGGCCAACCCCGTGCTGCAAACCGGCACGTTTACGCCCGTTTACGCCCAAGGCGAGGTCTATGCGTTCGCACGCACCATCCAAGGTGGCCAGGACGTATTTGGCAAACCCGCAGCCGATGCGTCGGCGATTGTGGCATTGAACAACCAAAACCAAACGCAAACCGTGAACCTTCCGGTTGCGGGCGTGATCGCCAATGGAACGAAGCTTCTGGACGAACTCAACGACCAATGGTACACCGTGGAGAACGGGGCTGTGCAGTTGACGCTGGCGCCATACGAAGGTGCTATTCTGGTCA
CGCCCACAGCGAATCCTGTCGCATACCTGCAGACAATCAATGGGCAAACCTCGATTGCCTGGACGCCGGTTGCTGGGGCGAACGGATACTTGTTGCTGCGACACCAAGGCGATGTATGGGTACCCGTAGGCCGCCCGCTTTCGGCGAACACGCTGTCTTCGCCGGTAACCCAAGGTGCAACCGCCGTCGACTATGCGATTGCGGCCCTGCCACCCGTGGCACCAGGCGTCGGCCTTAGCTCGGGCCAACCGCTACAGGCGGTTACGGTGCCGGCCGCATCCCTCGGTCAGCCCCAAGTGCAAGTGGATGTACAGCATAGCGGGGTCAGTCTGCACATCACACCGGTGCCAAACGCGACACAATATGTCGTCTATCTACAACAGCCCGATGGATCTTATCAGGCCGTCGCAACCGTGGCGGCACATGGCGATGTCCACCTCAGGTTGCCTGTGGCGCCTGGAACACAGTCCATATCCGTCCGCGTGGCGGCGCAAAATGAAGACGGCCAGGCTGTGACCGATCCGATGGTGATTACGGTAAATCCATCCGCCAAAGCACAGCGCTAA本发明通过PCR的方法分离克隆了淀粉酶基因AMYA4，DNA全序列分析结果表明， 淀粉酶AMYA4结构基因AMYA4全长3873bp，含有一个终止子TAA。淀粉酶AMYA4的成熟蛋 白理论分子量为138kDa。将淀粉酶基因AMYA4序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进 行 BLAST 比对。该基因与来源于 Alicyclobacillusacidocaldarius 的淀粉酶(CAA44638 |) 氨基酸序列最高一致性为63%，说明AMYA4是一种新的淀粉酶。本发明还提供了上述酸性淀粉酶AMYA4的应用。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、 适合于在食品，特别是双酶法制糖工艺中应用的新淀粉酶。本发明的淀粉酶最适PH为4. 2， 在PH2.8 4.2的范围内都有较高的酶活性(80%以上)；酸性条件下pH稳定性好，具有 很强的生淀粉降解能力。最适pH为4. 2与目前工业上应用的中温糖化酶相近，因此可以不 用反复调整淀粉醪的PH，降低糖化过程中酸碱的使用量，其最适作用温度为75°C，与中温 糖化酶的最适作用温度相近，可以不用反复调整淀粉醪的的糖化温度，因此可以降低能耗， 其在55-75°C范围内都具有很高的活性，同时具有很强的生淀粉降解能力，可以使淀粉醪不 用经过前期的糊化和液化过程，使工艺流程更简单，能耗消耗更低。在模拟双酶法制糖工艺 中，无论是以糊化淀粉为底物还是以生淀粉为底物，在配合商业化糖化酶的作用下，都可以 达到很好的水解率，这预示着AmyA4巨大的应用潜力。
图1原酶纯化的淀粉酶的SDS-PAGE分析，其中，1 低分子量蛋白质Marker ；2:纯化的重组淀粉酶。图2纯化淀粉酶的最适pH。图3纯化淀粉酶的pH稳定性。图4纯化淀粉酶的最适温度。图5纯化淀粉酶的热稳定性。
具体实施例方式试验材料和试剂1、菌株及载体脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研 究所，100101)，其保藏号为CGMCCNo. 3147。2、酶类及其它生化试剂内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。 可溶性淀粉购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基脂环酸芽孢杆菌AlicyclobacillushesperidumA4CGMCC3147产酶培养基组成为0. 2%蛋白胨、0. 酵母提取物、0. 5%可溶性淀粉，pH3. 0.说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》(第三版)J-萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。实施例1 脂环酸芽孢杆菌 AlicyclobacillushesperidumA4(CGMCCNo. 3147)淀粉 酶编码基因AMYA4的克隆基因序列的获得根据脂环酸芽孢杆菌属已经报导的淀粉酶基因序列，参照上述纯化淀粉酶的质谱 序列(GNGQWNIDFFGGDLK，HWLALGADGW)，直接设计特异性引物AF和AR，以脂环酸芽孢杆菌 Alicyclobacillus hesperidum A4 (CGMCC No. 3147)总 DNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反 应参数为94°C变性5min，60°C退火30sec，72°C延伸1. 5min。最后72°C保温lOmin。得到 一约480bp片段，将该片段回收后与PEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性嵌套引物 设计方向为需要扩增的未知区域方向，并将它们分别命名为uspl，usp2, usp3(上游特异性 引物)，dspl，dsp2, dsp3(下游特异性引物)见表1。表1.淀粉酶AMYA4TAIL-PCR特异性引物 通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后测序。通过比较淀粉酶的基因组序列后发现该基因全长3873bp，编码1290个氨基酸和 一个终止密码子。所推测出的基因AMYA4的氨基酸序列与GeneBank上的淀粉酶基因序列 进行同源比较，最高一致性为63%，说明AMYA4是一种新的淀粉酶，表明从Alicyclobacill ushesperidumA4(CGMCCNo. 3147)中分离克隆得到的编码淀粉酶的基因为新基因。提取脂环酸芽孢杆菌AlicyclobacillushesperidumA4(CGMCCNo. 3147)基因组 DNA 将液体培养2天的菌液离心取菌体，加入ImL溶菌酶，37°C处理60min，再加入裂 解液，65°C水浴锅裂解30min，每隔IOmin混勻一次，在4°C下IOOOOrpm离心5min。取上 清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4°C下 IOOOOrpm离心lOmin。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解， 置于-20°C备用。实施例2纯化淀粉酶的活性分析从Alicyclobacillus hesperidum A4中分离纯化酸性淀粉酶AMYA4的方法，包括 以下步骤1)在种子培养基55°C摇振培养48小时后，的接种量至产酶培养基，55°C、 200rpm振培养48小时后，将菌液离心，取上清用于纯化；2)培养物离心取上清大约101，然后冰浴下通过6K的中空纤维超滤膜到大约 600ml，再用5K的超滤膜包进一步浓缩至200ml ；3)去上述浓缩液IOml在缓冲液A (20mmol/L柠檬酸_Na2HP04pH 3. 5)中过夜透 析，阳离子交换层析取2. OmL浓缩液上预先用缓冲液A平衡的HiTrap SP XL阳离子柱， 然后用含有1. Omol/L NaCl缓冲液B和缓冲液A进行梯度洗脱，洗脱条件为8个柱长体积
9(0-100% )，流速2. OmL/min。每管1. OmL进行分部收集。DNS法具体方法如下在pH 4. 2 (0. IM磷酸二氢钠-柠檬酸)，75 °C条件下， ImL的反应体系包括100 μ L适当的稀释酶液和900 μ L(1 %，w/v)底物，反应lOmin，加入 1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给 定的条件下每分钟释放出Iymol还原糖的酶量。纯化后的淀粉酶进行了胰蛋白酶的酶解 反应，通过MALDI-TOF-MS分析，获得了 3段内肽的氨基酸序列，序列分别为=NH2-G-N-G-Q-W -N-1-D-F-F-G-G-D-L-K, NH2-H-W-L-A-L-G-A-D-G-W 和 NH2-N-A-V-I-D-F_F-R。利用软件查 询AlicyclobacillushesperidumAA基因组序列、蛋白质库获得了基因序列，证明纯化后的 淀粉酶为本发明酸性淀粉酶AMYA4。实施例3纯化淀粉酶AMYA4的性质测定1、纯化淀粉酶AMYA4的最适pH和pH稳定性的测定方法如下将实施例2纯化的淀粉酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物可 溶性淀粉用不同PH的缓冲液(0. lmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠pH 3. 0-7. 4 ；0. IMTris-HCl PH 7. 8-8. 6 ;0. IM甘氨酸-氢氧化钠pH 9. 0-11. O ；)、在75°C下进行淀粉酶活力测定。结 果(图2)表明其最适作用pH为4.2，在pH 3. 8 5. 8保持70%以上的相对酶活性。该酶 最稳定的pH范围为3. O 10. 0，37°C作用2h，酶活力保持在85%以上。淀粉酶的最适作用 温度及热稳定性的实验结果见图3。2、淀粉酶的最适温度及热稳定性测定方法如下淀粉酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4. 2)缓冲液体系及 不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为淀粉酶在不同温度下处理不同时间，再在75°C下 进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)淀粉酶的最适作用温度为75°C。该酶 能在75°C保持很好的稳定性，在75°C下作用Ih后有90%以上的剩余活性，该酶在80°C下 作用lOmin，酶活性还能保留50%以上。3、不同金属离子化学试剂对AmyA4酶活的影响测定如下在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性 的影响，各种物质终浓度为1和lOmmol/L。在75°C、pH4. 2条件下测定酶活性。结果(表 1)表明，大多数的金属离子对淀粉酶的活性影响较小，Hg2+、Fe2+、Cu2+和SDS对该酶活性抑 制较严重。值得注意的是，与已报道的淀粉酶的活性都有Ca2+依赖性不同，Ca2+对AmyA4并 没有明显的促进作用。甚至在IOmM浓度时还有一定的抑制作用。表1各种化学试剂对淀粉酶AMYA4活力的影响
实施例4纯化淀粉酶在模拟双酶法制糖工艺中的水解实验对以AmyA4和商业化淀粉酶，糖化酶为研究对象，测试了熟化淀粉和生淀粉的转化 率，实验结果如表2.表2模拟双酶法制糖工艺结果
样品1 先添加商业a-amylase在90°C，pH 6. 0作用2个小时，然后调节pH值至Ij
4. 2后然后添加入商业化糖化酶在60°C作用不同的时间；样品2 首先添加AmyA4在60°C作用2个小时，然后添加入商业化糖化酶在60°C作用不同的时间；样品3 同时添加AmyA4和 商业化糖化酶在一起，PH 4. 2，60°C作用不同的时间；样品4 同时添加AmyA4和商业化糖化 酶在一起，PH 4. 2，60°C作用不同的时间。 结果表明，以AmyA4配合商业化糖化酶，以生淀粉为底物，可以达到96 %的转化率。
权利要求
一种酸性淀粉酶AMYA4，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.—种酸性淀粉酶基因AMYA4，其特征在于，编码权利要求1所述的酸性淀粉酶AMYA4。
3.如权利要求2所述的酸性淀粉酶基因AMYA4，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO. 2 所示。
4.包含权利要求2所述的酸性淀粉酶基因AMYA4的重组载体。
5.包含权利要求2所述的酸性淀粉酶基因AMYA4的重组菌株。
6.如权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为酵母菌、大肠杆菌、曲霉、芽 孢杆菌或乳酸杆菌。
7.权利要求1所述酸性淀粉酶AMYA4的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性淀粉酶AMYA4及其基因和应用。根据本发明的酸性淀粉酶AMYA4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。AmyA4其最适pH值为4.2，最适温度为75℃，在55-75℃范围内都具有很高的活性，同时具有很强的生淀粉降解能力。这些酶学性质非常符合双酶法制糖的工艺要求，因此具有很大的应用潜力。在模拟双酶法制糖工艺中，无论是以糊化淀粉为底物还是以生淀粉为底物，在配合商业化糖化酶的作用下，都可以达到很好的水解率，这预示着AmyA4巨大的应用潜力。
文档编号C12P19/14GK101886064SQ201010219720
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月28日 优先权日2010年6月28日
发明者姚斌, 孟昆, 杨培龙, 柏映国, 王亚茹, 石鹏君, 罗会颖, 袁铁铮, 黄火清 申请人:中国农业科学院饲料研究所