专利名称：一株富钼酿酒酵母及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株富钼酿酒酵母及其应用。
背景技术：
钼是动植物及人体必需的微量元素。钼是生物体内多种酶的重要组成成分；参与 并影响机体内的多种代谢过程；能抑制乳腺癌的生长，控制食道癌及其他癌症的死亡率； 能保护心肌，预防心脑血管疾病和肝脏疾病；对克山病、龋齿、小细胞低色素性贫血以及区 域性脱发等地方病有很好的防治作用。此外，钼能增加机体抵抗病菌的能力，提高机体免疫 能力，对动物的生长有明显的促进作用。人体内钼缺乏会引起心血管疾病、高血压、糖尿病、 克山病、肾结石、大骨节病等，儿童和青少年钼缺乏会导致生长发育不良、神经异常、智力发 育迟缓，骨骼生长缓慢、异常。无机态的钼元素不易被人体吸收，并有一定的毒性。由于酵母菌能够富集培养基 中的无机钼并将其转变为毒性低的有机钼，提高了钼的生物利用率和安全性；同时，酵母本 身的生物活性物质对生物体也有保健作用，因此富钼酵母作为生物体钼源的补充，尤其是 作为预防和治疗癌症、心脑血管疾病和肝脏疾病的药物的重要功效成分引起了人们极大重 视。
发明内容
本发明的目的在于提供一株富钼酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。本发明提供的富钼酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株HG-7是通过自然 筛选、单倍体分离、诱变和原生质体融合技术获得的，已于2010年7月19日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No 4014。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) HG-7 CGMCC No. 4014 为椭圆形，菌落凸 起、光滑、乳白色、边缘整齐。最适生长温度为30°C，最适生长pH值为6.0。本发明的另一目的在于提供酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7 CGMCCNo. 4014 的发酵培养方法，是将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCCNo. 4014接种于发酵培养基中，在如下的发酵培养条件下培养25-35°C，180_250rpm 培养 35-45h ；所述发酵培养基的组成为40-100g/L碳源、1000-2000mg/L可溶性钼盐、5_20g/L 酵母粉，其余为水。进一步，上述发酵培养基的组成为80g/L碳源、1750mg/L可溶性钼盐、10g/L酵母 粉，其余为水。上述可溶性钼盐为钼酸钠或钼酸铵，优选为钼酸钠；所述碳源为蔗糖或麦芽糖。上述发酵培养基的pH值为4. 5-6. 5，优选为5. 5。进一步，上述发酵培养的条件为30°C，200rpm培养40h。
本发明的又一目的在于提供一种制备含有机钼的产品的方法。本发明提供的制备含有机钼的产品的方法是将酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014在含无机钼培养基中发酵培养，收集所 述酿酒酵母，得到所述产品。上述含无机钼培养基与上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7 CGMCCNo. 4014的发酵培养方法中的发酵培养基相同；所述发酵培养的条件25_35 °C、 180-250rpm培养35_45h、通空气的量为1. 1-1. 5L/min/升培养基，优选条件30°C、200rpm 培养40h、通空气的量为1. 3L/min/升培养基。上述制备含有机钼的产品的方法还包括在收集所述酿酒酵母步骤之后，将收集的 所述酿酒酵母进行干燥、粉碎和包装。任一上述方法制备得到的含有机钼的产品也属于本发明的保护范围之内。本发明通过自然筛选、单倍体分离、诱变和原生质体融合技术获得了一株遗传性 状稳定的高生物量酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7 CGMCC No. 4014。该菌株具 有生物量高和细胞有机钼含量高的优点，在其生长繁殖过程中能够将培养液中无机态的钼 富集到细胞内转化成有机态的钼，发酵培养该酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014，每升培养液的细胞干重可达llg，每克干细胞含钼量可达3500 iig。本发明 的培养方法实用性强、操作简便、成本低廉，对发酵设备及生产条件没有特殊要求，利用一 般发酵厂的设备和生产条件即可生产，投资少、见效快、效益高，不但适合于大规模的生产 还适合于小批量的生产，具有广阔的应用前景。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。所有原料均能够从商业途径获得。实施例1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 的获得1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 的选育1)根据酵母菌对钼离子的抗性测定结果进行初筛取20 株不同的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2. 1190、 CGMCCNo. 2. 1407,CGMCC No. 2. 1416,CGMCC No. 2. 1419,CGMCC No. 2. 1420,CGMCCNo. 2. 1422、 CGMCC No.2. 1423、CGMCC No.2. 1428、CGMCC No.2. 1435、CGMCCNo.2. 1436、CGMCC No. 2. 1445,CGMCC No. 2. 1453,CGMCC NO. 2. 1525,CGMCCNo. 2. 1538,CGMCC No. 2. 1542,CGMCC No. 2. 1546,CGMCC No. 2. 1643,CGMCCNo. 2. 1793,CGMCC No. 2. 1951,CGMCC No. 2. 2079 (由中 科院微生物研究所菌种保藏中心提供)，重新编号分别为ZB-1 ZB-20。将它们分别培养 在含有 1. 5mg/mL、2mg/mL、2. 5mg/mL、3mg/mL、3. 5mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL 禾口 8mg/mL钼离子浓度的YEPD固体培养基(YEPD固体培养基的组成为酵母粉10g/L、蛋白胨 20g/L、葡萄糖20g/L、琼脂粉10g/L)上，从中选出8株在含有6mg/mL钼离子浓度的YEPD固 体培养基上能够生长的菌株。2)测定步骤1)初筛得到的8株菌在含有lmg/mL钼离子浓度的YEPD液体培养基 中的细胞生物量和细胞中钼的含量。通过筛选，获得4株细胞生物量较高的菌株(每升培 养液的细胞干重在10g以上，但每克干细胞的含钼量在1000 P g以下)和4株细胞中钼含量
4较高的菌株(每克干细胞的含钼量在2000 u g以上，但每升培养液的细胞干重在6g以下)。 细胞生物量和细胞中钼含量的测定方法如下细胞生物量的测定方法将培养有酵母菌的培养液于SOOOrpm离心5min，收集菌 体沉淀，用去离子水洗涤三次，将菌体沉淀放置在60°C烘箱中烘至恒重，称量菌体的重量。 细胞生物量为每升培养液中的细胞干重。钼标准曲线的制备分别配制钼离子浓度为4iig/ml、10iig/ml、20iig/ml、 40 u g/ml和60ii g/ml的标准溶液，原子吸收测定460nm处的吸光度值，分别为0. 0942、 0. 2221,0. 4219,0. 7707和1. 1052。根据钼离子浓度和吸光度值得到钼离子浓度的计算公 式:OD460 = 0. 0179X 钼离子浓度(i! g/ml)+0.042，相关系数 r = 0.9984。细胞中钼含量的测定在装有1. 0g上述筛选得到的酵母湿菌体的100mL磨口圆底 烧瓶中加入20mL消化液(硝酸高氯酸的体积比为4 1)，烧瓶口放置小漏斗，以防止消 化液自圆底烧瓶口进溅出来，并将产生的气体导流出圆底烧瓶，将烧瓶置于电炉上加热消 化，直至烧瓶中的液体变为无色透明为止；在烧瓶中加5mL水，加热以除去多余的硝酸；待 烧瓶中的液体接近2-3mL时，取下冷却，用蒸馏水稀释至合适的浓度，原子吸收法测定细胞 中钼的含量，即每克干细胞中钼离子的微克数。3)通过生孢实验，从上述步骤2)筛选的菌株中挑选出一株生物量较高、生孢好 的二倍体酿酒酵母菌ZB-5和一株细胞含钼量较高、生孢好的二倍体酿酒酵母菌ZB-12， 按常规方法对这两株菌进行生孢培养和单倍体分离。分别测定单倍体菌株的细胞生物量 和细胞含钼量，从中选出生物量较高的单倍体ZB-5-21 (a)和细胞含钼量较高的单倍体 ZB-12-36(a)。4)用硫酸二乙酯分别对上述步骤3)获得的单倍体ZB-5-21 (a)和ZB_12_36 (a) 进行诱变，获得营养缺陷突变株；从获得的营养缺陷突变株中筛选出带有赖氨酸营养缺陷 标记的突变株ZB-5-21-17 (a, lys_)和带有缬氨酸营养缺陷标记的突变株ZB-12_36_69 (a, vaD作为融合亲株。5)将 ZB-5-21-17(a，lys_)和 ZB-12-36-69 (a，val—)进行原生质体融合，在酵母菌 基本培养基上筛选融合子。酵母菌基本培养基的组成为10g/L葡萄糖、10g/L琼脂、6.7g/ L无氨基酵母氮源YNB (无氨基酵母氮源YNB的组成为硫酸铵5g、磷酸二氢钾0. 85g、磷酸 氢二钾0. 15g、硫酸镁0. 5g、氯化钠0. lg、氯化钙0. lg、硼酸500 u g、硫酸铜40 u g、碘化钾 lOOP g、氯化铁200ii g、硫酸锰400ii g、钼酸钠200ii g、硫酸锌400ii g、生长素2ii g、泛酸钙 400 u g、肌醇2000 u g、烟酸400 u g、对氨基苯甲酸200 u g、硫胺素400 u g、核黄素200 u g、 吡哆醇400 u g)。6)测定步骤5)获得的融合子在含有lmg/mL钼离子浓度的YEPD培养基中培养的 细胞生物量和细胞中钼含量，从中筛选出细胞生物量和细胞钼含量高的融合菌株，将其命 名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7，并于2010年7月19日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No. 4014。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) HG-7 CGMCC No. 4014 为椭圆形，菌落凸 起、光滑、乳白色、边缘整齐。最适生长温度为30°C，最适生长pH值为6.0。该融合菌株HG-7每升培养液的细胞干重在llg以上，每克干细胞的含钼量在3500 y g以上，是一株优良的富钼酵母菌株。2、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7 CGMCC No. 4014 的遗传稳定性分 析将上述步骤1 获得的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 在YEPD固体培养基上传代培养30次，随机挑取100个单菌落接种于无菌水中，室温条件下 饥饿培养4-6小时。取饥饿培养后的菌液分别接种于含有6mg/mL钼离子的YEPD培养基中， 培养结果证明，挑取的100个单菌落在含有6mg/mL钼离子的YEPD培养基上均能够生长。随 机挑取其中的10个单菌落接种在含有lmg/mL钼离子的YEPD培养基中培养，测定细胞生物 量和细胞钼含量，结果表明，细胞生物量和细胞钼含量均无明显变化。上述结果证明，酿酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 具有良好的遗传稳定性。实施例2、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 发酵条件 的优化采用单因子发酵实验进行酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7 CGMCCNo. 4014的培养条件优化(包括培养基组分、糖浓度、钼盐种类、钼盐浓度、培养基的 PH值、发酵液体积及发酵时间等)，确定了最优的培养条件。发酵培养基的溶剂是水，溶质组成为麦芽汁糖含量为80g/L、钼酸钠1750 y g/ ml、酵母粉10g/L。发酵培养基的pH值为5. 5。发酵培养条件为30°C、200rpm培养40h。250ml三角瓶中装50ml发酵培养基(装 液量为 50ml/250ml)。先将筛选得到的菌株在5ml YEPD培养基(葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉 10g/L)中培养16hr，然后以10%的接种量接种于上述发酵培养基中。在上述优化的培养条件下，按照实施例1提供的方法测定干重以及含钼量每升 发酵液的细胞干重可以达llg，每克干细胞的含钼量达3500 y g。实施例3、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 产品的制 备富钼酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 产品的生产工 艺包括以下步骤斜面菌种一液体菌种一一级液体种子培养一二级液体种子培养一三级液 体种子培养一发酵罐发酵培养一收集酵母细胞及干燥一粉碎一得到富钼酿酒酵母产品。下 面对生产工艺中的各个步骤做进一步的说明(1)斜面菌种将上述实施例1筛选得到的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) HG-7 CGMCC似.4014接种于￥￡ 0固体斜面培养基(葡萄糖2(^/1、蛋白胨2(^/1、酵母粉 10g/L、琼脂粉10g/L)上，30°C培养48小时后，放入4°C冰箱保存。(2)液体菌种将上述步骤(1)保存的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7CGMCC No. 4014活化后，接一环细胞于装有150毫升YEPD培养基(葡萄糖20g/L、蛋白 胨20g/L、酵母粉10g/L)的500ml三角瓶中，30°C振荡培养36小时，得到液体菌种。(3) 一级液体种子培养按10%的接种量将上述步骤(2)的液体菌种接入装有 1. 5升YEPD培养基的5L三角瓶中，30°C振荡培养28小时，得到一级液体种子培养物。(4) 二级液体种子培养按10%的接种量将上述步骤(3)的一级种子培养物接入 装有45升YEPD培养基的小卡氏发酵罐中，在25-35°C的条件下，搅拌培养28小时，得到二
6级液体种子培养物。(5)三级液体种子培养按10%的接种量将上述步骤(4)的二级种子培养物接入 装有450升YEPD培养基的700L大卡氏发酵罐中，30°C搅拌培养28小时，得到三级液体种 子培养物。(6)发酵罐发酵培养按20%的接种量将上述步骤(5)的三级种子培养物接入装 有2250升发酵培养基(发酵培养基的组成同实施例2的最优发酵培养基)的3500L发酵 罐中，30°C搅拌，搅拌转速200rpm培养40小时，通空气的量为1. 3L/min/升培养液。(7)收集酵母细胞及干燥采用板框压榨法或离心收集上述步骤(6)获得的酿酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7 CGMCC No. 4014 细胞，将收获的菌体细胞在 45 85°C的条件下风干，使酵母细胞的含水量小于5%。结果表明，在上述培养条件下，每升发酵 培养基获得的细胞干重为llg，每克干细胞的含钼量为3500 y g。(8)粉碎及包装用粉碎机将上述步骤(7)干燥后的酿酒酵母细胞粉碎。然后用 不透气的包装袋包装，得到成品。2、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 细胞内钼离子的 有机转化率分别测定酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014 细胞中总 钼的含量和无机钼的含量，总钼含量测定方法见实施例1中步骤1的2)中细胞中钼含量的 测定方法；无机钼的测定即取适量菌体，超声波破碎细胞，8000rpm离心5min，取上清液不 消化直接稀释至合适浓度，原子吸收测无机钼含量。实验设三次重复，结果表明，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCCNo. 4014细胞中总钼的平均含量为3560 y g/g，无机钼的平均含量296y g/g，二者的 差值3264 y g/g即为细胞中有机钼的平均含量，细胞中钼离子的有机转化率为91. 7%。以 上结果说明，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014对钼的有机转化 能力比较强。
权利要求
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG 7，保藏号为CGMCC No.4014。
2.酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)HG-7CGMCC No. 4014 的发酵培养方法，是将 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HG-7CGMCC No. 4014接种于发酵培养基中，在如下 的发酵培养条件下培养25-35°C，180-250rpm培养35_45h ；所述发酵培养基的组成为40-100g/L碳源、1000-2000mg/L可溶性钼盐、5_20g/L酵母 粉，其余为水。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵培养基的组成为80g/L碳源、 1750mg/L可溶性钼盐、10g/L酵母粉，其余为水。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述可溶性钼盐为钼酸钠或钼酸铵， 优选为钼酸钠；所述碳源为蔗糖或麦芽糖。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述发酵培养基的pH值为 4. 5-6. 5，优选为 5. 5。
6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于所述发酵培养的条件为30°C， 200rpm 培养 40h。
7.一种制备含有机钼的产品的方法，是将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No. 4014在含无机钼培养基中发酵培养，收集所述酿酒酵母，得到所述产品。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述含无机钼培养基与权利要求2-5 中任一所述方法中的发酵培养基相同；所述发酵培养的条件25-35°C、180-250rpm培养 35-45h、通空气的量为1. 1-1. 5L/min/升培养基，优选条件30°C、200rpm培养40h、通空气 的量为1.3L/min/升培养基。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述方法还包括在收集所述酿酒酵 母步骤之后，将收集的所述酿酒酵母进行干燥、粉碎和包装。
10.权利要求7-9中任一所述方法制备得到的含有机钼的产品。
全文摘要
本发明公开了一株富钼酿酒酵母及其应用。本发明提供的富钼酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7，保藏号为CGMCC No.4014。本发明还提供了一种制备含有机钼的产品的方法。该方法是将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HG-7 CGMCC No.4014在含无机钼培养基中发酵培养，收集所述酿酒酵母，得到所述产品。本发明的培养方法实用性强、操作简便、成本低廉，对发酵设备及生产条件没有特殊要求，利用一般发酵厂的设备和生产条件即可生产，投资少、见效快、效益高，不但适合于大规模的生产还适合于小批量的生产，具有广阔的应用前景。
文档编号C12R1/865GK101942399SQ20101027758
公开日2011年1月12日 申请日期2010年9月8日 优先权日2010年9月8日
发明者何秀萍, 奥杰, 张博润, 郭雪娜 申请人:中国科学院微生物研究所