专利名称：一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗的制备方法，尤其涉及一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方 法。
背景技术：
利用猪睾丸(ST)传代细胞系生产猪细小病毒灭活疫苗是一种常用猪细小病毒灭 活疫苗的生产工艺。目前，该生产工艺是采用传统的转瓶培养ST细胞工艺，即采用种毒接 种已形成单层的转瓶ST细胞或采用细胞传代时同时接入种毒来生产猪细小病毒灭活疫 苗，因各个转瓶都是独立的细胞元，所以每瓶的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，直接导 致产生疫苗批间差大和隐性污染引起高内毒素等缺点，同时劳动强度大。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种猪细小病毒灭 活疫苗的制备方法，以实现制备出的猪细小病毒灭活疫苗质量均一。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤(1) ST细胞或IBRS-2细胞的复苏培养；用方瓶培养从液氮中复苏的ST细胞或IBRS-2细胞，培养条件包括pH值7. 0 7. 3、温度35 37°C，培养基为DMEM ；培养48 72h，培养至细胞浓度为3 6 X IO5Cells/ ml，即可；(2) ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器微载体培养；细胞接种密度为1 2X105cellS/ml，微载体浓度为3 5g/L，溶氧为30 % 60%，pH值7. 0 7. 3，温度35 37°C，转速40 60r/min，培养基为DMEM ；培养至细胞浓 度为3 5X 106cells/ml ；其中，微载体为球状载体Cytodexl或片状载体；(3) ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器微载体的连续培养；以一定速度向生物反应器中连续添加新鲜的DMEM培养基，同时用相同的速度向 外排出培养好的ST细胞或IBRS-2细胞，保证ST细胞或IBRS-2细胞在反应器中停留时间 内扩增至浓度为3 5X106cells/ml，即可；(4)接种猪细小病毒培养；将猪细小病毒接种于连续培养ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器中进行培养， 接种MOI为0.01，培养条件包括溶氧30-60%, PH值7. 1-7. 4、温度35_37°C，使病毒含量 达到彡 106 0TCID50/ml ；(5)收集病毒液，灭活病毒，制成猪细小病毒灭活疫苗。步骤(1)中，在所述的DMEM培养基中，添加有体积浓度为5 10%的血清(BVDV 抗体阴性)。步骤(3)中，所述的一定速度为2 3个生物反应器体积/天。
步骤(4)中，在培养过程中，监控葡萄糖的消耗、乳酸的产生和氨的产生，并对微 载体上细胞进行计数。所述的球状载体Cytodexl上细胞计数，先用PBS漂洗2次，经0. 1% 结晶紫的柠檬酸溶液染色，用血球计数板计数细胞核。上述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法所制得的疫苗产品。本发明的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，利用ST细胞专用培血清(BVDV抗体阴 性)培养，血清浓度可降低至5%，首先从液氮中复苏ST细胞，接着用三角瓶培养扩增种子 细胞，然后接种5L反应器进行微载体培养，待ST细胞生长合适 密度，接种猪细小病毒种毒， 收获病毒上清，按照常规的灭活疫苗制备工艺制备猪细小病毒灭活疫苗即可。有益效果本发明的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，为采用反应器微载体培养 ST细胞的猪细小病毒工艺，微载体提供了更大的表面积，不仅能提高ST细胞密度，提高病 毒滴度，而且反应器能自动监控细胞生长或病毒繁殖时的最适生化条件，每批反应器生产 上清的病毒滴度均一批间小、质量稳定。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。本发明使用的猪细小病毒来源于金宇保灵生物药品有限公司，命名为Porcine parvovirus isolate/Bei jing/BJ-2/04,简称猪细小病毒BJ-2株；猪睾丸细胞(ST细胞)， 来源于中国兽药监察所；猪肾细胞(IBRS-2)，来源于上海交通大学药学院。实施例1筛选适宜细胞系将猪细小病毒BJ-2株接种于ST或者IBRS-2传代细胞，在DMEM培养基中，控制培 养条件为PH值7. 0 7. 3，温度35 37°C，不断传代培养，使病毒适应细胞，测定病毒繁殖 滴度，至达到所需病毒含量要求彡106_°TCID5(l/ml，筛选出适宜的细胞系。适宜的细胞系应该具有形态良好，状态稳定、一致，产毒高等特点。具体细胞标准 为细胞形态用含10%胎牛血清的DMEM培养液，置5% CO2培养箱中37°C培养观察 6h即可贴壁，40h可长成单层。显微镜下观察，细胞呈不规则形状。外源病毒检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源性病毒污染。胞核学检查对不同传代水平的细胞，取50个处于有丝分裂中期的细胞进行检 查。在基础细胞库细胞中存在的染色体标志，在最高代次细胞中也应存在，与基础细胞库的 细胞相比，所有细胞的染色体模式差异数不得超过15 %，核型必须相同。无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。细胞代次基础细胞代次为2 10代，工作细胞代次为11 20代，生产用细胞代 次不超过30代。细胞保存液氮保存，保存期24个月。毒种继代应不超过3代。毒种种子批的建立将分离纯化后的BJ-2株病毒在ST细胞上连传20代，测定病 毒含量及对豚鼠红细胞HA效价，并选取E1、E5、E10、E15、E20代毒进行特异性、免疫原性及 纯净性鉴定，结果表明各代次病毒含量稳定，均在106_° 107_°TCID5(l/ml，其免疫原性、特异性、纯净性均符合种毒标准，且未发生明显改变。为保证生产用毒种良好的免疫原性和安 全性，原始种子批代次定位El E5代种毒，基础种子批代次为E6 ElO代种毒，生产种子 为Ell E13代种毒。实施例2病毒鉴定使BJ-2株病毒在实施例1筛选出的合适的细胞系上，在添加有5 10%血清浓度 的在DMEM培养基中，控制培养条件为PH值7. 0 7. 3，温度35 37°C，不断传代培养，同 时鉴定病毒的特异性、免疫原性、毒力等病毒特性，并作基因序列分析，保证病毒在培养过 程中与原分离株在特异性、毒力、免疫原性等方面没有发生明显改变。(1)病毒的特异性鉴定理化特性检测结果表明，该分离株对脂溶剂、酸、碱均不敏感，对热稳定性强。这 些特点符合PPV的一般特性。荧光抑制试验猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(HCV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪繁殖 与呼吸综合征(PRRSV)均为可引起怀孕母猪相似症状的病毒。根据试验可知(见表1)，分 离的毒株培养物不能被PRV荧光抗体、PRRSV间接荧光抗体特异性染色，所以该毒株排除了 PRV和PRRSV的可能性；三价荧光抗体对分离的毒株培养物和猪瘟病毒培养物均敏感，而且 该分离毒株可被PPV抗血清特异结合而抑制三价荧光抗体特异性染色，初步判定该分离毒 株不是猪瘟病毒(HCV)而是猪细小病毒(PPV)表1荧光抑制试验
权利要求
一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)ST细胞或IBRS 2细胞的复苏培养；用方瓶培养从液氮中复苏的ST细胞或IBRS 2细胞，培养条件包括pH值7.0～7.3、温度35～37℃，培养基为DMEM；培养48～72h，培养至细胞浓度为3～6×105cells/ml，即可；(2)ST细胞或IBRS 2细胞的生物反应器微载体培养；细胞接种密度为1～2×105cells/ml，微载体浓度为3～5g/L，溶氧为30％～60％，pH值7.0～7.3，温度35～37℃，转速40～60r/min，培养基为DMEM；培养至细胞浓度为3～5×106cells/ml；其中，微载体为球状载体Cytodex1或片状载体；(3)ST细胞或IBRS 2细胞的生物反应器微载体的连续培养；以一定速度向生物反应器中连续添加新鲜的DMEM培养基，同时用相同的速度向外排出培养好的ST细胞或IBRS 2细胞，保证ST细胞或IBRS 2细胞在反应器中停留时间内扩增至浓度为3～5×106cells/ml，即可；(4)接种猪细小病毒培养；将猪细小病毒接种于连续培养ST细胞或IBRS 2细胞的生物反应器中进行培养，接种MOI为0.01，培养条件包括溶氧30 60％、PH值7.1 7.4、温度35 37℃，使病毒含量达到≥106.0TCID50/ml；(5)收集病毒液，灭活病毒，制成猪细小病毒灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于在步骤(1) 中，在所述的DMEM培养基中，添加有体积浓度为5 10%的血清。
3.根据权利要求1所述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤(3)中， 所述的一定速度为2 3个生物反应器体积/天。
4.根据权利要求1所述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤(4)中， 在培养过程中，监控葡萄糖的消耗、乳酸的产生和氨的产生，并对球状载体Cytodexl上细 胞进行计数。
5.根据权利要求4所述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的球状 载体Cytodexl上细胞计数，先用PBS漂洗2次，经0. 1 %结晶紫的柠檬酸溶液染色，用血球 计数板计数细胞核。
6.根据权利要求1所述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法所制得的疫苗产品。
全文摘要
本发明公开了一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法。该制备方法包括ST细胞或IBRS-2细胞的复苏培养；ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器微载体培养；ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器微载体的连续培养；接种猪细小病毒培养；收集病毒液，灭活病毒，制成猪细小病毒灭活疫苗。本发明的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，为采用反应器微载体培养ST细胞的猪细小病毒工艺，微载体提供了更大的表面积，不仅能提高ST细胞密度，提高病毒滴度，而且反应器能自动监控细胞生长或病毒繁殖时的最适生化条件，每批反应器生产上清的病毒滴度均一批间小、质量稳定。
文档编号C12N7/00GK101947318SQ20101027750
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者傅元华, 刁文华, 史春云, 李玉和, 潘杰 申请人:扬州优邦生物制药有限公司;扬州威克生物工程有限公司