专利名称：一种猪细小病毒基因工程疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种猪细小病毒基因工程疫苗的制备方法。
背景技术：
猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是一种自主复制型病毒，是引起母猪产畸形胎的主要因素之一，通常初产母猪感染PPV之后可引起繁殖障碍，主要表现为流产、不孕、产死胎和木乃伊胎等，给养猪业带来重大的经济损失。PPV、猪圆环病毒(PCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) —直是猪病研究的热点，最近研究发现PPV在猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)中扮演着重要角色。PPV基因组为单链线状DNA分子，大小约为5000个核苷酸，成熟的病毒粒子仅含有负链DNA基因组。研究发现，PPV同细小病毒属的其他细小病毒的基因组有很高的同源性。此外，PPV的基因组结构与其他细小病毒相似，两端有发夹结构，3'端有一个102 bp 的回文序列折叠形成的“Y”字型发夹结构；5'端有一个127 bp的回文序列、中间被一个24 bp的短回文序列中断并折叠形成的“U”字形发夹结构，这种末端结构对其复制是非常重要的。基因组有2个开放阅读框架(0RF)，5'端的ORFl编码非结构蛋白(即调节蛋白)， 3'端的0RF2编码结构蛋白，结构蛋白是PPV的主要免疫原性抗原。由启动子P4开始转录的NS基因编码3种非结构蛋白NS1、NS2和NS3 ；由启动子P40开始转录翻译3种结构蛋白 VPU VP2和VP3，它们的分子质量分别约为83、64、60ku。目前市场上防制PPV的疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗。在临床应用中发现灭活疫苗有如下缺点(1)需要大剂量接种或应用浓缩抗原，免疫期短，常需强化接种；(2)不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；(3)产生完全免疫力需要2-3周，不利于紧急预防接种与降低疫苗费用；(4)存在灭活不彻底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返强、重组及潜在感染的危险，很难在实践中推广应用。故传统疫苗在防制PPV中暴露出越来越多的问题，一种新型既安全又可靠的基因工程疫苗迫在眉睫。VP2是构成PPV衣壳蛋白的主要成分，也是中和抗体作用的靶蛋白，含有病毒的主要抗原决定簇，还具有血凝活性。VP2基因编码的多肽能自我装配成类病毒粒子(VLPs)，能诱导很强的免疫应答。赵俊龙等研究发现PPV VP2在60-68，81-88，266-275，351-357和 398-404氨基酸处存在抗原位点的优势区域。梁秀丽等发现VP2蛋白较有可能成为B细胞表位的区段位于 N 端第 10-18,34- 39、94-103、121-126、137-144、156-165 和 209-214 区段。Soren K等学者分析了 PPV的抗原结构，发现有9个线性表位均位于VP2中，只有VP2 N 端表位能诱导病毒中和抗体，用哺乳动物细胞系表达或用杆状病毒表达时VP2蛋白可形成 VLPs0从分离纯化的病毒粒子电镜图中可以找到两种形态的病毒粒子一种为完整病毒粒子，内含PPV ssDNA ；另一种为病毒空衣壳，内无DNA，病毒空衣壳中VP2含量最高，这种“空芯”病毒粒子仍具有很好的免疫原性。2007年，Yi G X等用重组乳酸菌表达了 VP2蛋白， 其表现出很好的免疫原性。基于上述特点，VP2成为PPV在诊断和免疫学研究方面的热点。
发明内容
本发明的目的在于根据巴斯德毕赤酵母中高效表达猪细小病毒主要结构蛋白VP2 基因，所以以此高表达量的结构蛋白为基础，提供了猪细小病毒基因工程疫苗。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
1.构建重组酵母表达载体在GenBank上面查找国际标准弱毒株猪细小病毒VP2 基因，序列号NC-001718，表达载体为pGAPZaA，宿主菌为酵母菌株SMD1168 (购自 Invitrogen公司)，构建pGAPZ a A-VP2重组酵母表达载体。PCR扩增出PPV VP2全基因序列，上游引物Pl如SEQ ID NO:1所示，下游引物P2如SEQ ID NO: 2所示，酶切位点为Xho I 和Not I，AAAAGA为Kex2蛋白酶切位点。2.构建重组酵母工程菌将其线性化电击转化巴斯德毕赤酵母，构建表达工程菌。将感受态A/^1Siori1S SMDl 168 100 μ L 与经 Avr II 线性化的 pGAPZ a A-VP2 10 yg 相混合，冰浴5π η，300ν、200Ω电击15ms，然后迅速加入Iml IM的山梨醇，将转化后的酵母细胞铺于新鲜制备的YPDS平板(含100 mg/ml Zeocin)上，将平板倒置，于30°C培养至单菌落出现，培养纩3 d。采用煮-冻-煮法制备PCR模板分析P.pastoris转化子。再经不同浓度Zeocin的YPDS平板筛选高拷贝转化子，用于高效表达目的蛋白。3.重组酵母工程菌的非诱导表达用灭菌枪头挑筛选到的具有Zeocin抗性的单菌落，于5mL的YPD液体培养基中进行一级培养，30°C，200 r/min振荡过夜，至 0D_=2-6，即细胞处于对数生长期。取ImL—级培养液，重悬于50mL的YPD中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，培养约72小时。4.表达蛋白的纯化培养约72小时的培养物低速离心收集上清，用膜系统等方法纯化蛋白。5. PPV基因工程疫苗的制备对上诉表达上清进行SDS-PAGE和Western Blot 分析，然后将青霉素、链霉素与分离纯化的蛋白混合，再加入进口的纳米佐剂同生理盐水或 PBS混合，将混合物PH值调至生理值，即PH7. 0-7. 5，即制备了猪细小病毒基因工程疫苗。由于PPV VP2蛋白对密码子的偏好性与巴斯德毕赤酵母表达系统对密码子的偏好性差异最小，故选择毕赤酵母表达系统，且其对表达外源蛋白十分有利，(1)高稳定该系统的表达载体不是以自主复制的质粒形式存在，而是整合到酵母染色体上，故构建的菌株十分稳定；(2)高分泌巴斯德毕赤酵母表达系统中的α-因子信号肽的分子生物学特性研究的十分清楚，加之它自身的生物学特性，其分泌表达可达lg/L，这在已知的分泌表达系统中十分少见；(3)成本低重组蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达比在昆虫和哺乳动物中表达成本要低，培养基不需要像牛血清白蛋白那样昂贵的添加物，也不需要二氧化碳培养箱和组织培养箱等昂贵的设备；(4)容易放大重组蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达已在 1000 L发酵罐中实现了工业化生产。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明重组酵母菌表达的目的蛋白很高，而且目的蛋白分泌到培养基中，而酵母菌自身表达的蛋白由于没有信号肽无法分泌到培养基中，故表达上清中几乎无杂蛋白(见附图1)，且酵母菌株SMD1168属于蛋白酶缺陷型菌株，防止了目的蛋白降解；由于表达载体 pGAPZ a A含有a -因子信号肽，易于表达产物分泌到培养基中，从而更容易分离纯化目的蛋白，避免了由于酵母细胞壁较牢固难破碎来获取并纯化蛋白的难题，且在PPV VP2蛋白N端引入Kex2蛋白酶，以保证其形成天然N端，从而保证了 VP2蛋白的生物学活性。PPV VP2的密码子与大肠杆菌、酵母菌、人的密码子偏爱性差异分析发现，VP2密码子与酵母密码子偏爱性的差异最小，故选择酵母表达系统优化表达以提高表达量，且国内未见VP2在酵母中表达相关报道，本发明VP2蛋白表达量高达595. 76mg/L (见实施例3)， 明显优于其他表达系统。本发明选择的酵母表达载体pGAPZ α A是一种非诱导组成型分泌表达载体，含有 3_磷酸甘油醛脱氢酶强启动子，优于其他启动子，表达量更高，重要的是不需要甲醇诱导， 防止了甲醇的危险及其对酵母细胞的毒副作用。本发明从碳源和氮源对发酵条件进行了初步探索，从成本和表达量两因素研究发现，以葡萄糖作为碳源优于甘油，以尿素作为氮源优于胰蛋白胨和硫酸铵，间歇性地流加以补充碳源和氮源更有利于酵母细胞的生长；且在发酵过程中发酵罐中的溶氧量对酵母生长以及表达量的提高起着举足轻重的作用，特别是发酵第三天，溶氧量要求更高，同时保证发酵液PH值在5. 5-6. 0之间。
图1是PPV VP2蛋白SDS-PAGE分析，1 未经浓缩pGAPZ α A-VP2表达上清；2 pGAPZ α A空载体表达上清；M 预染蛋白分子量Marker ；
图2是PPV VP2蛋白Western Blot分析，1，2 未经浓缩pGAPZ α A-VP2表达上清；M 预染蛋白分子量Marker ；3 :pGAPZ α A空载体表达上清。图3是实施例3中PPV VP2蛋白浓度测定制作的标准蛋白BSA浓度曲线。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1
1.构建重组酵母表达载体表达载体为pGAPZ α A，宿主菌为酵母菌株SMDl 168。PCR扩增出PPV VP2全基因序列，上游引物Pl如SEQ ID NO: 1所示，下游引物Ρ2如SEQ ID NO:2 所示，酶切位点为Xho I和Not I，AAAAGA为Kex2蛋白酶切位点。2.构建重组酵母工程菌以上述构建好的重组酵母表达载体线性化电击转化酵母菌株SMDl 168，线性化酶为Avr II。3.重组酵母工程菌的非诱导表达用灭菌枪头挑筛选到的具有Zeocin抗性的单菌落，于5mL的YPD液体培养基中进行一级培养，30°C，200 r/min振荡过夜，至0D6(1(1=2-6， 即细胞处于对数生长期。取ImL—级培养液，重悬于50mL的YPD中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，培养约72小时。4.表达蛋白的纯化培养约72小时的培养物低速离心收集上清，用膜系统等方法纯化蛋白。5. PPV基因工程疫苗的制备对上诉表达上清进行SDS-PAGE和Western Blot分析 (图广2)，然后将青霉素、链霉素与分离纯化的蛋白混合，再加入佐剂同生理盐水或PBS混合，将混合物PH值调至生理值，即PH7. 0-7. 5，即制备了猪细小病毒基因工程疫苗。佐剂选用进口纳米佐剂。
实施例2
动物实验将上述制备的PPV基因工程疫苗免疫体重基本无差异、精神状况良好PPV阴性的仔猪，同时设阳性对照、空载体对照、生理盐水对照、佐剂对照以及不做任何处理的空白对照，15天后加强免疫，经ELISA试剂盒检测产生抗体后，使用猪细小病毒强毒株进行攻毒实验(F组除外)，以检测所产生的抗体有没有保护力。实验如下
权利要求
1.猪细小病毒基因工程疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)根据猪细小病毒VP2基因序列，构建重组酵母载体pGAPZα A-VP2 ；(2)将线性化的重组酵母载体pGAPZα A-VP2电击转化酵母菌株SMD1168，筛选高拷贝的重组酵母工程菌，鉴定；(3)将鉴定的阳性重组酵母工程菌进行发酵培养，表达猪细小病毒主要结构蛋白VP2；(4)对表达的结构蛋白进行纯化，加佐剂，制得猪细小病毒基因工程疫苗。
2.根据权利要求1所述猪细小病毒基因工程疫苗的制备方法，其特征在于步骤(2)所述筛选高拷贝的重组酵母工程菌是将线性化的重组酵母载体PGAPZ α A-VP2电击转化酵母菌株 SMDl 168 后，分别涂布于含 100 μ L、150 μ L、200 μ L ZeocinC 100mg/ml)抗性的 YPDS 平板，于30°C恒温培养箱中倒置避光培养2 3天，待白色的单菌落长出，即筛选出不同Zeocin 抗性浓度下的高拷贝重组酵母工程菌。
3.根据权利要求1所述猪细小病毒基因工程疫苗的制备方法，其特征在于所述佐剂为纳米佐剂。
全文摘要
本发明公开了一种猪细小病毒基因工程疫苗的制备方法。本发明所述方法首先是构建重组酵母表达载体pGAPZαA-VP2，然后电击转化巴斯德毕赤酵母菌株SMD1168，使VP2蛋白在YPD培养基中高效分泌表达，形成不含病毒核酸的病毒样颗粒，然后纯化蛋白，经SDS-PAGE和WesternBlot及电镜检测，加相应的免疫佐剂即制成了猪细小病毒基因工程疫苗。本发明所述方法制得的猪细小病毒基因工程疫苗解决了当前猪细小病毒传统疫苗存在的缺陷，可用于预防和治疗猪细小病毒感染及其引起的相关疾病，也同样适用于制备检测猪细小病毒抗体ELISA试剂盒的包被抗原。
文档编号A61P31/20GK102319440SQ201110239759
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月19日 优先权日2011年8月19日
发明者刘德辉, 郭春和, 黄毓茂 申请人:华南农业大学