专利名称：一种毛细管整体柱及在固定化胰酶中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及功能材料及蛋白质高通量酶解，具体地说是一种毛细管整体柱及在固定化胰酶中的应用。
背景技术：
在研究蛋白质组学的各种方法中，大部分都需要对蛋白质进行高效的酶解以便将蛋白质切割成适合CID[文献 1. Jolene K. Diedrich and Ryan R. Julian. Anal. Chem. 2010， 82,4006-4014.,文 M 2. Kumaran Kandasamy, AkhileshPandey. Anal. Chem. 2008,80, 4825-4835. ]，MALDI [文献 3. Michel Salzet, and Isabelle Fournier. Anal. Chem. 2009, 81,8193-8202.], ETD[ JC ^ 4. JackSimons. Chemical Physics Letters. 2010,484, 81-95.]，等具有不同裂解方式的质谱分析和鉴定的肽段。因此，蛋白质酶解流程的优化成为一个热点领域，其中如何提高酶解流程的通量从而提高酶解的重复性，准确性以及实现在线化是这个领域的关键问题。最常用的方法就是将胰酶固定在各种材料上。纳米离子 [文献 5. Hubert H. Girault, and Baohong Liu. Molecular&Cellular Proteomics. 2007, 6，1似8-1436·]、膜[文献 6.Yan Li ,and Cheng S. Lee. Anal. Chem. 2003，75，1067-1074·]、 整体柱[文献 7. Gabriele Caccialanza，and Gabriella Massolin. Anal. Chem. 2007, 79, 355-363.]等材料都可以用来实现胰酶的固定化。目前，各种基质的整体柱被合成并用于胰酶的固定化。但是，酶解底物和产物在整体柱基质上的残留成为一个严重的问题，极大的干扰了整个分析流程的准确性和重复性。 现行的方法是在整体柱基质的表面通过光聚合的方法涂上一层亲水的分子，例如，PEG[文献 8. Timothy C. Logan andDouglas S. Clark. Anal. Chem. 2007,79,6592-6598. ；Nathan A. Lacher, andFrantisek Svec. Anal. Chem. 2009，81，2004-2016.]，从而减少非特异性吸附的发生。聚(丙烯酰胺，N, N-双甲基丙烯酰胺)基质是一种亲水性、生物相容性较好的聚合物材料。在这里，通过热聚合方法和选择合适的单体聚合比例和致孔剂系统，在毛细管内发展一种制备聚(丙烯酰胺，N, N-双甲基丙烯酰胺)基质整体柱的新方法，并成功用于胰酶固定化从而实现酶解的高通量。
发明内容
本发明的目的在于在毛细管内制备一种以亲水性为特征的用于胰酶固定化的毛细管整体柱。本发明借由以下技术措施实现一种毛细管整体柱，采用丙烯酰胺和N，N-双甲基丙烯酰胺两种功能单体，通过热聚合在刻蚀处理过的石英毛细管内通过原位共聚合制备成具有特定孔径范围的具有亲水表面的整体材料，整体材料孔表面经过转酰胺化处理后，得毛细管整体柱，其可以连接上胰蛋白酶，并作为微酶反应器使用。所述的毛细管整体柱的制备是，将丙烯酰胺，N, N-双甲基丙烯酰胺，1,4- 丁二醇，二甲基亚砜，十二醇和偶氮二异丁腈按照适当比例混合。随后将一部分溶液导入经过氢氟酸刻蚀的毛细管内。两端用硅胶封口并在水浴锅内反应一段时间。通过转酰胺化反应实现表面胺基活化。胰酶的固定化通过戊二醛耦联实现。具体制备过程如下，(1)预聚溶液的配置20-40mg丙烯酰胺，20_60mg N，N-双甲基丙烯酰胺， 100-400mg 1,4- 丁二醇，100_500mg 二甲基亚砜，100_250mg 十二醇和 0. 5_3mg 偶氮二异丁腈；(2)整体材料的制备将预聚溶液超声后，通氮气去除溶液中的溶解氧；导入经过氢氟酸刻蚀的毛细管内，封口，并在60°C下，引发聚合，聚合时间2小时后用纯乙腈或甲醇和纯水分别冲出致孔剂；(3)整体材料的修饰首先通过转酰胺化反应将惰性的酰胺键活化将整体柱内充满98%的乙二胺， 90°C反应3小时，最后用纯水和50mM碳酸氢铵缓冲液将剩余的乙二胺从整体柱内冲洗干净；其次，在活化后的整体柱内通入25%戊二醛，在室温下反应6小时，随后用纯水和 50mM碳酸氢铵缓冲液将剩余的乙二胺从整体柱内冲洗干净；得毛细管整体柱。功能单体丙烯酰胺与N，N-双甲基丙烯酰胺的质量比为1 1;为了完成反应，也需要加入占预聚溶液的总质量约90%的制孔剂和占单体溶液的总质量约的引发剂。多孔材料的孔径范围为IOOnm lOOOnm。所述的毛细管整体柱可在固定化胰酶中的应用；胰酶固定过程在整体柱内持续通入1 ang/mL的胰酶，50mM苯甲眯和3 5mg/ mL腈基硼氰化钠的混合溶液，在4°C下反应M小时，从而实现胰酶的固定化。本发明的优点如下本发明的材料借助了丙烯酰胺和N，N-双甲基丙烯酰胺的亲水性，降低了毛细管整体柱材料对于底物的非特异性吸附，并首次在这种整体柱上实现了胰酶的固定化。
图1 聚(丙烯酰胺，N, N-双甲基丙烯酰胺)毛细管整体柱电镜图.放大倍数 (A)X2000， (B)X5000。图2 流速对反压的影响.条件流动相，乙醇.其它条件在表1中描述。图3 =BSA MALDI-T0F质谱图，分别通过制备的固定化酶反应器㈧和自由溶液酶解。图 4:0.1mg/mL BSA MALDI-T0F 质谱图· Oh 和酶解 6h 后。5cm，250 μ m. i. d 固定化酶反应器；室温；500nL/min。图5 大肠杆菌蛋白酶解质谱图。
具体实施方式
通过实验发现当丙烯酰胺的量大于或远小于N，N-双甲基丙烯酰胺的量时，制备而成的整体柱没有良好的通透性。实施例11.预聚溶液的配置35mg丙烯酰胺，40mg N, N-双甲基丙烯酰胺，150mg 1,4- 丁二醇，330mg 二甲基亚砜，185mg十二醇和0. 8mg偶氮二异丁腈。2.整体材料的制备将预聚溶液超声后，通氮气去除溶液中的溶解氧。将一部分溶液导入经过氢氟酸刻蚀的毛细管内。两端用硅胶封口，并在60°C下，引发聚合。聚合时间2小时后用纯乙腈和水冲出致孔剂。3.胰酶固定首先通过转酰胺化反应将惰性的酰胺键活化将整体柱内充满98%的乙二胺， 90°C反应三小时，最后用纯水和50mM碳酸氢铵缓冲液将剩余的乙二胺从整体柱内冲洗干净。其次，在活化后的整体柱内通入25%戊二醛，在室温下反应6小时，随后用纯水和50mM 碳酸氢铵缓冲液将剩余的乙二胺从整体柱内冲洗干净。最后，在整体柱内持续通入ang/mL 的胰酶，50mM苯甲眯和5mg/mL腈基硼氰化钠的混合溶液，在4°C下反应M小时，从而实现胰酶的固定化。实验条件表1 实验温度M 25°C ；聚丙烯酰胺整体柱39cm，250 μ m. i. d表1.聚丙烯酰胺基质渗透性考察
权利要求
1.一种毛细管整体柱，其特征在于采用丙烯酰胺和N，N-双甲基丙烯酰胺两种功能单体，通过热聚合在刻蚀处理过的石英毛细管内通过原位共聚合制备成具有特定孔径范围的具有亲水表面的整体材料，整体材料孔表面经过转酰胺化处理后，得毛细管整体柱，其可以连接上胰蛋白酶，并作为微酶反应器使用。
2.根据权利要求1所述的毛细管整体柱，其特征在于具体制备过程如下，(1)预聚溶液的配置20-40mg丙烯酰胺，20-60mgN, N-双甲基丙烯酰胺，100_400mg 1,4- 丁二醇，100-500mg 二甲基亚砜，100-250mg 十二醇和 0. 5_3mg 偶氮二异丁腈；(2)整体材料的制备将预聚溶液超声后，通氮气去除溶液中的溶解氧；导入经过氢氟酸刻蚀的毛细管内，封口，并在60°C下，引发聚合，聚合时间2小时后用纯乙腈或甲醇和纯水分别冲出致孔剂；(3)整体材料的修饰首先通过转酰胺化反应将惰性的酰胺键活化将整体柱内充满98%的乙二胺，90°C反应3小时，最后用纯水和50mM碳酸氢铵缓冲液将剩余的乙二胺从整体柱内冲洗干净；其次，在活化后的整体柱内通入25%戊二醛，在室温下反应6小时，随后用纯水和50mM 碳酸氢铵缓冲液将剩余的乙二胺从整体柱内冲洗干净；得毛细管整体柱。
3.根据权利要求2所述的毛细管整体柱，其特征在于功能单体丙烯酰胺与N，N-双甲基丙烯酰胺的质量比为1:1;为了完成反应，也需要加入占预聚溶液的总质量90%的制孔剂和占单体溶液的总质量约的引发剂。
4.根据权利要求1所述的毛细管整体柱，其特征在于多孔材料的孔径为IOOnm IOOOnm0
5.一种权利要求1所述的毛细管整体柱在固定化胰酶中的应用。
6.按照权利要求5所述毛细管整体柱的应用，其特征在于胰酶固定过程在整体柱内持续通入1 2mg/mL的胰酶，50mM苯甲眯和3 5mg/mL腈基硼氰化钠的混合溶液，在4°C下反应M小时，从而实现胰酶的固定化。
全文摘要
一种毛细管整体柱及在固定化胰酶中的应用公开了一种毛细管整体柱及其在固定化胰酶中的应用，将丙烯酰胺，N，N-双甲基丙烯酰胺，1，4-丁二醇，二甲基亚砜，十二醇和偶氮二异丁腈按照适当比例混合。随后将一部分溶液导入经过氢氟酸刻蚀的毛细管内。两端用硅胶封口并在水浴锅内反应一段时间。通过转酰胺化反应实现表面胺基活化。胰酶的固定化通过戊二醛耦联实现。本发明的材料借助了丙烯酰胺和N，N-双甲基丙烯酰胺的亲水性，降低了毛细管整体柱材料对于底物的非特异性吸附，并首次在这种整体柱上实现了胰酶的固定化。
文档编号C12N11/08GK102453706SQ20101052295
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者吴帅宾, 张丽华, 张玉奎, 张维冰, 梁振, 王婷婷 申请人:中国科学院大连化学物理研究所