专利名称：一种用卤虫孵化液生产卤虫孵化酶的方法
技术领域：
本发明属海洋生物技术领域，涉及一种用卤虫孵化液生产卤虫孵化酶的方法。
背景技术：
卤虫初孵无节幼体是水产苗种生产中极为重要的动物性活饵料，卤虫成虫体内内含有较高的蛋白质(50％～60％)、一定量的脂肪和高级不饱和脂肪酸、矿物质和维生素等，是许多水产动物苗种后期幼体和水族宠物的适口饵料，投喂卤虫后期幼体对提高河蟹育苗成活率、改善水族宠物的体色十分有利。目前，国际上85％的海产经济动物以卤虫作为鲜活开口饵料。据有关专家对卤虫、鲑、对虾、扇贝等24种主要的水产养殖品种的生长特性、养殖方法、市场价格和市场潜力等14项指标的综合测评，卤虫增养殖的可行性评价仅次于鲑鱼位居第二。
但是其在水产育苗和水产养殖中的应用还远远不能够满足要求。这主要是由于成虫质量不稳定，某些卤虫品系的孵化率太低而影响了其应用价值。目前在中国和前苏联一些国家，低孵化率卤虫卵(某些品系卤虫的孵化率只有30-50％)的储量相当可观。如果能将这一资源利用在某些品种的水产育苗上，部分或全部替代价格昂贵的高质量卤虫卵，将在一定程度上缓解卤虫卵紧张的矛盾，降低育苗成本，避免资源的浪费。但是目前还没有相关技术能够解决卤虫孵化率低这个问题。而卤虫孵化酶将有助于提高卤虫的孵化率，解决低孵化率卤虫卵的品质问题。另外，孵化酶的研究对控制动物的孵化率和孵化进程、进而控制其种苗养成率也具有十分重要的指导价值。进而，孵化率的控制又可为濒危物种的保护、有益动物的增养殖以及有害动物的数量控制等研究提供一条有广阔应用前景的技术路线。
发明内容
本发明目的是为克服现有卤虫孵化技术的不足，提供一种用卤虫孵化液生产卤虫孵化酶的方法。
本发明的提取卤虫孵化酶的方法或工艺先将卤虫卵培养于海水中，待90％以上的卤虫完成孵化时，经滤网收集滤液-孵化液；然后将硫酸铵加入其内，并搅拌使硫酸铵的饱和度为50-70％；再放入4℃冰箱中过夜沉淀，进而离心沉淀，并用缓冲液将沉淀完全溶解后，再在4℃下以蒸馏水在透析袋中进行透析脱盐，将上述透析液进行冷冻干燥，至样品达到恒重，将干粉取出后密封包装即的得到卤虫孵化酶粗品。
在此基础上，为了对卤虫孵化酶进行更深入的研究，本发明对卤虫孵化酶粗品作了进一步纯化将上述卤虫孵化酶粗品用缓冲液溶解后上样于阴离子交换柱层析，进行梯度洗脱，洗脱出的样品用样品自动收样器收集，选取酶活性值最高的洗脱样品作为阴离子交换柱层析样品；再将上述阴离子交换柱层析样品用浓缩离心管进行浓缩，经凝胶过滤柱进行进一步纯化。选取酶活性值最高的洗脱样品即为卤虫孵化酶纯品。为了长期保存卤虫孵化酶纯品，将上述的溶液状态的卤虫孵化酶纯品进行冷冻干燥，最将取出密封包装即获得卤虫孵化酶纯品。
本发明是以高孵化率品系卤虫为材料进行孵化酶的提取与纯化，其方法及详细步骤如下1.卤虫卵的培养和孵化液的收集为了简化操作流程，在工厂化运作中卤虫卵通常培养于自然海水中。考虑到天然海水中含有一定量的钙镁离子，容易与后续的硫酸铵产生难溶性沉淀，所以在本发明中采用人工海水培养卤虫卵。人工海水的配方为30g氯化钠溶解在1000ml的蒸馏水中。将人工配制的海水在室温下用充气泵充气半小时后加入卤虫卵，在31℃、光照的条件下培养卤虫卵。培养至90％以上的胚胎完成孵化时(约培养24h)，用滤网将人工海水过滤，得到的滤液即为孵化液。
2.卤虫孵化酶粗品的制备将上述孵化液中加入固体硫酸铵，使硫酸铵的饱和度为50-70％，在加入硫酸铵的同时搅拌溶液以避免溶液中局部硫酸铵的浓度升高而导致蛋白质变性。然后，将此液体放在4℃冰箱中过夜沉淀，再用冷冻离心机以5000g离心30min(4℃)。将离心管中的上清液轻轻倾掉，离心管底部的沉淀用缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH7.5)完全溶解后，在4℃下以蒸馏水在透析袋中透析12h以脱盐；将得到的透析液首先在-20℃冷冻后再用冷冻干燥仪冷冻干燥，冷冻条件为真空度达到80Pa，进行冻干，至样品达到恒重。将干粉取出后密封包装即为卤虫孵化酶粗品。卤虫孵化酶粗品即可以应用于养殖业以提高低孵化率品系卤虫的孵化率。
但是，卤虫孵化酶粗品不能满足氨基酸序列分析研究内容的要求。因此，本发明对卤虫孵化酶的粗品进行了进一步的纯化，以便进一步为卤虫孵化酶的深入研究提供基础。以下步骤在粗酶的基础上进行了纯化。
3.阴离子交换柱层析将卤虫孵化酶粗品用缓冲液溶解后上样于阴离子交换柱层析，分别用含有0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl的缓冲液(pH7.5)进行梯度洗脱，洗脱出的样品用样品自动收样器收集，用紫外分光光度计测定在波长280nm处的各洗脱样品的酶活性，该酶活性的大小用酶裂解酪蛋白而引起的光吸收(简称0D280)的大小来表示。具体操作步骤为取20μl酪蛋白溶液(5mg/ml)于1ml离心管中，加入20μl洗脱样品，于35℃水浴中反应30min后，加入500μl三氯乙酸以终止反应。4℃静置30min后，用冷冻离心机于4℃、5000g离心30min。吸出上清液用紫外分光光度计测定各洗脱样品的0D280值，该值为此洗脱样品的实验值；对照组仅将上述的各洗脱样品用50μl上述缓冲液替代，再测定对照组的0D280值，该值为对照值。将每个洗脱样品的酶活性用“实验值-对照值”表示；以洗脱样品的顺序为横坐标，以每个洗脱样品的酶活性值为纵坐标绘制酶活性曲线，选取酶活性曲线上酶活性值最高的洗脱样品作为阴离子交换柱层析样品。
4.凝胶过滤柱层析再将上述阴离子交换柱层析样品用浓缩离心管进行浓缩，经凝胶过滤柱进行进一步纯化。将浓缩的阴离子交换柱层析样品上柱后，用20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.5)进行洗脱，洗脱出的组分用样品自动收样器收集，再用紫外分光光度计测定在280nm处各洗脱样品的酶活性。具体操作与阴离子交换柱层析中所描述的步骤相同。选取酶活性曲线上酶活性值最高的洗脱样品即为卤虫孵化酶纯品。
为了将卤虫孵化酶纯品长期保存，将上述的溶液状态的卤虫孵化酶纯品进行冷冻干燥，冷冻干燥条件温度下降到-54℃、真空度达到80Pa，进行冷冻干燥，至样品达到恒重，取出密封包装即为卤虫孵化酶纯品。
上述所选用的卤虫品系，要求其孵化率在70％-90％的范围；卤虫品系的孵化率越高，卤虫孵化酶的得率越高。
为了进一步说明以上方法，以产地渤海湾的卤虫品系(孵化率90％以上)作为实施例将人工配制的海水在室温下用充气泵充气半小时后加入50g产地渤海湾的卤虫卵，在31℃、光照的条件下培养卤虫卵。培养至90％以上的胚胎完成孵化时，用滤网过滤人工海水，得到的滤液即为孵化液；上述孵化液中加入固体硫酸铵，使硫酸铵的终饱和度为67％，然后，将此液体放在4℃冰箱中过夜沉淀，再用冷冻离心机以5000g离心30min(4℃)，收集沉淀；用缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH7.5)完全溶解沉淀后，在4℃下以蒸馏水在透析袋中透析12h以脱盐，将得到的透析液首先在-20℃冷冻后再用冷冻干燥仪冷冻干燥，冷冻条件为真空度达到80Pa，进行冻干，至样品达到恒重。将干粉取出后密封包装即为卤虫孵化酶粗品。
将卤虫孵化酶粗品用pH7.5的20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解后上样于DEAE-sepharose Fast Flow(1cm×20cm)阴离子交换柱层析，用含有0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L NaCl的20mmol/L的缓冲液(pH7.5)进行梯度洗脱，洗脱速度20ml/h，每个洗脱样品的收集体积为2ml。用紫外分光光度计测定在280nm处各洗脱样品的酶活性。最后绘制酶活性曲线，选取酶活性曲线上酶活性值最高的洗脱样品作为阴离子交换柱层析样品。
离子交换柱样品经过浓缩后上样于Sephacryl凝胶过滤柱(1cm×50cm)进行进一步纯化；用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)进行洗脱，流速为15ml/h，每个洗脱样品的收集体积为2ml。用紫外分光光度计测定在280nm处的酶活性。绘制酶活性曲线后选取酶活性曲线上酶活性值最高的洗脱样品作为凝胶过滤柱层析样品。凝胶过滤柱样品冷冻干燥，冷冻干燥条件真空度达到80Pa时，进行冷冻干燥，至样品达到恒重，取出密封包装即为卤虫孵化酶纯品。
由于本发明采用了孵化率较高的卤虫品系制备孵化酶，提高了酶的产量，而不同品系卤虫间孵化酶的同源性很高，从高孵化率卤虫品系制备的孵化酶完全可以应用于低孵化率卤虫品系。方法中又以人工海水培养卤虫，避免了天然海水中钙镁等重金属离子与硫酸盐产生的沉淀，同时也排除了天然海水中其他不明组分对孵化酶活性的影响。在此基础上获得的孵化液中其他蛋白质的种类与含量均极少，因此简化了孵化酶的提取过程。本方法又采用了冷冻干燥工艺，使本发明的整个提取工艺简单规范，可操作性强，得率高，而且能够长期保存；通过本发明获得的卤虫孵化酶可以大大提高低品质卤虫的孵化率，充分利用卤虫资源，大幅度降低海水养殖业的育苗成本，缓解生产需求中卤虫供应的紧张局面。
权利要求
1.一种用卤虫孵化液生产卤虫孵化酶的方法，其特征是先将卤虫卵培养于海水中，待90％以上的卤虫完成孵化时，经滤网收集滤液--孵化液；然后将硫酸铵加入其内，并搅拌使硫酸铵的饱和度为50-70％；再放入4℃冰箱中过夜沉淀，进而离心沉淀，并用缓冲液将沉淀完全溶解后，再在4℃下以蒸馏水在透析袋中进行透析脱盐，将上述透析液进行冷冻干燥，至样品达到恒重，将干粉取出后密封包装即为卤虫孵化酶粗品。
2.如权利1要求所述的一种用卤虫孵化液生产卤虫孵化酶的方法，其特征是将上述卤虫孵化酶粗品用缓冲液溶解后上样于阴离子交换柱层析，进行梯度洗脱，洗脱出的样品用样品自动收样器收集，选取酶活性值最高的洗脱样品作为阴离子交换柱层析样品，再将上述阴离子交换柱层析样品用浓缩离心管进行浓缩，经凝胶过滤柱进行进一步纯化，选取酶活性值最高的洗脱样品即为卤虫孵化酶纯品。
3.如权利2要求所述的一种用卤虫孵化液生产卤虫孵化酶的方法，其特征是将上述的卤虫孵化酶纯品进行冷冻干燥，取出密封包装得到能够长期保存的卤虫孵化酶纯品。
4.如权利1要求所述的一种用卤虫孵化液生产卤虫孵化酶的方法，其特征是所述海水为人工海水，其NaCl浓度为30‰。
5.如权利要求1所述的一种用卤虫孵化液生产卤虫孵化酶的方法，其特征是所采用的缓冲液为20mmol/L Tris-HCl，pH7.5。
6.如权利3要求所述的一种用卤虫孵化液生产卤虫孵化酶的方法，其特征是冷冻干燥条件温度下降到-54℃、真空度达到80Pa，进行冷冻干燥至样品达到恒重。
全文摘要
一种用卤虫孵化液生产卤虫孵化酶的方法。先将卤虫卵培养于人工海水中，待90％以上的卤虫完成孵化时，经滤网收集滤液一孵化液；然后将硫酸铵加入其内，并搅拌使硫酸铵的饱和度为50－70％；再放入4℃冰箱中过夜沉淀，进而离心沉淀，并用缓冲液将沉淀完全溶解后，再在4℃下以蒸馏水在透析袋中进行透析脱盐，将上述透析液进行冷冻干燥，至样品达到恒重，即为卤虫孵化酶粗品。再经过阴离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析纯化得到卤虫孵化酶纯品。该发明采用冷冻干燥技术，工艺简单合理，且能充分利用废弃的卤虫孵化液为原材料，制成的卤虫孵化酶可溶性好，成本低，且能够长期保存，可应用于提高低孵化率卤虫品系的孵化率，降低海水养殖业的育苗成本。
文档编号C12N9/00GK1699561SQ20051004346
公开日2005年11月23日 申请日期2005年5月5日 优先权日2005年5月5日
发明者史振平, 丛日山, 樊廷俊 申请人:中国海洋大学