专利名称：丰加霉素在防治黄瓜立枯病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及生防放线菌一淀粉酶产色链霉菌 (Streptomyces diastatochromogenes)D的培养及其代谢产物的分离与应用。
背景技术：
放线菌(Actinomycetes)与人类的关系极为密切。据统计，在已发现的抗生素中， 有70%约为放线菌所产生。土壤是放线菌栖居的重要场所，从土壤中获得具有高效抗菌活 性的放线菌产生抗生素是目前世界范围内研制开发新医药和新农药必不可少的基础工作。
目前对植物病害的防治，主要采用化学农药防治的方法。化学农药虽然对多种病 害有较理想的防治效果，但长期使用会诱发病菌的抗药性。另外，农药的频繁使用不仅增加 了农产品的生产成本，农药残留问题也十分严重。利用放线菌产生的抗病原真菌的活性物 质进行植物真菌病害的生物防治，则具有周期短、易于研究、便于生产、无毒无害等优点。
本发明从杭州的土壤中分离到一株生防放线菌，经微生物分类学鉴定为淀粉酶产 色链霉菌(Sti^ptomyces diastatochromogenes)，并对此生防放线菌发酵代谢产物中的抗 菌成分进行分离，得到了活性成分，经四大光谱分析，证明为已知核苷类抗生素，丰加霉素 (Toyocamycin)。该发明为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株和生物 活性化合物。
以往对丰加霉素活性的报道主要集中在抗肿瘤方面，但由于其对人正常细胞的毒 性太大，无法应用于临床。在抗菌活性的报道方面，丰加霉素主要抑制白假丝酵母，新隐球 酵母，草分支杆菌和金黄色葡萄球菌等，几乎没有对植物病原菌(稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)除外)抑制作用的相关报道(陈伊，李舟，魏玉珍，等.根际放线菌106-03431产生 的核苷类抗生素；3431的研究.生物学杂志，2009, ) :17-20)。本研究通过对淀粉酶产 色链霉菌抗菌活性成分丰加霉素的研究发现，丰加霉素在低浓度就能强烈抑制黄瓜立枯病 病原菌即黄瓜立枯丝核菌(Miizoctonia solani)菌丝生长。本发明正是填补了这项空白， 拓宽了丰加霉素的应用。发明内容
本发明的目的是针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的不足，提供一种 从杭州土壤中分离筛选出的放线菌-淀粉酶产色链霉菌D ；本发明的另一目的是提供利用 该菌株通过发酵提取其代谢产物制备成防治部分植物真菌病害的微生物农药及其制备方法。
本发明淀粉酶产色链霉菌的分离、筛选与鉴定
是于2006年8月在浙江杭州临安天目山采集的土样中，经分离、培养、发酵、活性 测定以及对抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤获得并保存；经微生物分类学 鉴定为淀粉酶产色链霉菌(Sti^ptomyces diastatochromogenes)，定名为淀粉酶产色链霉 菌(Sti^ptomyces diastatochromogenes)D。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCC No. 2060。
淀粉酶产色链霉菌D显微形态特征孢子丝直、钩状、松散螺旋形，孢子长圆、椭圆 或卵圆形。
本发明所述的淀粉酶产色链霉菌D，经发酵提取可获得对部分植物真菌病害病原 菌具有抑制作用的活性化合物丰加霉素(Toyocamycin)。
本发明目的通过以下技术方案来实现
丰加霉素在防治黄瓜立枯病中的应用，按以下步骤进行
(1)菌种的活化培养将分离保存的淀粉酶产色链霉菌D菌种移至试管内高氏一 号斜面上，在士 rc条件下，培养至试管斜面长满孢子；
(2)发酵培养发酵培养液为每IOOOmL中含有玉米粉21. 5g，可溶性淀粉10g，麸 皮 5g，CaCO3 2. 5g，NH4NO3 1. 5g，FeSO4 0. 5g，KH2PO4 1. 5g，灭菌；待冷却至 40°C，在无菌条 件下接种淀粉酶产色链霉菌D至发酵培养液中，在士 1°C条件下，培养5天；
(3)发酵物提取发酵完毕，收集发酵液，按常规化学方法提取、层析，分离纯化获 得活性化合物Toyocamycin，该化合物分子式为C12H13N5O4，结构式见下式；
权利要求
1.丰加霉素在防治黄瓜立枯病中的应用。
2.权利要求1所述的应用，其中丰加霉素由以下方法获得淀粉酶产色链霉菌 (Streptomyces diastatochromogenes) D经斜面活化培养和发酵培养获得含有丰加霉素的 发酵液，向发酵液中加入等体积的正丁醇进行萃取，取上层，并在真空条件下浓缩至浸膏， 再以蒸馏水溶解，离心取上清液，而后上kphadex LH20柱层析，以体积比10% 90%的乙 醇和蒸馏水梯度洗脱，分离纯化得活性化合物丰加霉素，所述的淀粉酶产色链霉菌D已在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No. 2060。
全文摘要
本发明公开了丰加霉素在防治黄瓜立枯病中的应用，属于微生物技术领域。该方法利用一种从浙江杭州临安天目山采集的土样中分离筛选出的淀粉酶产色链霉菌D，经过菌种的活化培养；发酵培养；发酵物提取；分离纯化得活性化合物丰加霉素。盆栽试验表明丰加霉素对黄瓜立枯病有明显的治疗和保护效果，其防治效果比常规化学药剂好，且安全。
文档编号C12R1/465GK102027948SQ201010527650
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者于冰, 俞晓平, 申屠旭萍, 董胜张, 边亚琳, 郝培应 申请人:中国计量学院