专利名称：一种具有防腐功能的紫红曲菌的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体涉及一种紫红曲菌。
背景技术：
在肉制品加工领域，亚硝酸钠是应用最为广泛的食品添加剂，其具有防腐剂及增 色剂的作用，广泛用于熟肉类、灌肠类及罐头等动物性食品。但是亚硝酸钠具有毒性，它能 将血液中的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，使其失去运输氧的能力而引起组织缺氧性 损害，人体摄入0. 2 0. 5g即可引起食物中毒，3g即可致死。并且，亚硝酸钠在一定条件下 会生成亚硝酸胺，而亚硝酸胺则是致癌物质。因此，食品加工过程中亚硝酸钠的用量及残留 量受到严格控制。为了提高肉制品的品质，人们还会添加一些辅料及其它添加剂，这些都可 能影响产品的颜色。随着人们健康意识的不断提高，人们寻求天然、安全与高效的防腐剂及 增色剂的愿望也越来越强烈，同时这也是食品添加剂领域所面临的十分重要和急待解决的 问题。紫红曲菌(Monascus purpureas)早在《本草纲目》中对其药用保健作用就有记 载。在现代食品加工领域中，国内外对红曲菌的研究与应用大多集中在传统的酿酒、制醋与 着色剂领域。红曲菌是目前世界上唯一生产食用色素的微生物，红曲色素即是红曲菌在生 长代谢过程中产生的红色天然色素。利用紫红曲菌(Monascus purpureas)经液态深层发 酵提取精致而成的红曲是一种纯天然、安全性高、有益于人体健康的食品添加剂，红曲中含 有糖化酶、蛋白酶，最常用于生产红豆腐乳、含有少量降胆固醇的红曲米粉及其他保健食品 等。目前，将紫红曲菌用于食品着色已经得到了广泛认可，也是其主要应用方向。但其抑菌 防腐作用却少有报道，这主要是因为紫红曲菌虽有抑菌功能，但抑菌效果较弱。由此可见， 如果能够获得一株抑菌效果好的紫红曲菌，应用到传统肉制品等相关食品加工中，进而在 减少亚硝酸钠的用量的同时，起到着色剂和防腐剂双重作用，将成为食品添加剂领域的一 项重大突破。
发明内容
本发明的目的是提供一种紫红曲菌菌株，其在保持了原有着色功能的同时，具有 良好的抑菌防腐功能，对食品中常见的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及酵母菌均有抑制效果，同 时具有纯天然、安全性高、对人体没有危害的优点。本发明为生物防腐剂在食品防腐领域中 的应用奠定了基础。本发明具有防腐功能的紫红曲菌为紫红曲菌W5S7 (Monascus purpureus W5S7)， 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 4174。本发明紫红曲菌W5S7 (Monascus purpureus W5S7)属于子囊菌门(Ascomycota) 真子囊菌纲(Euascomecetes)散子囊菌目(Eurotiales)红曲菌科(Monascaceae)红曲菌 属(Monascus)，通过对食品中常见的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及酵母菌进行抑菌性试验，结 果表明紫红曲菌W5S7对上述几种菌均有明显的抑制作用。
本发明紫红曲菌W5S7是从克东腐乳中分离、纯化后，经微波辐照诱变技术进行诱 变筛选得到。本发明紫红曲菌W5S7在麦芽汁琼脂培养基(MEA)上菌落生长较慢，25°C紫外 照射黑暗培养7天菌落直径18 20mm，黄褐色，有皱褶，表面丛卷毛状，气生菌丝少量菌 落背面黄褐色，无水溶性色素。菌丝光滑，多分枝，具分隔，宽2. 5 5.0 μ m，有脂滴。无性 孢子大量生产，近球形，基部平截，壁光滑或略粗糙，5. 5 9. 0 μ m，生于非特化的侧生小梗 或菌丝顶端。闭囊壳大量形成，白色至黄褐色，单生于类似菌丝的短柄上，直径22 50 μ m, 子囊早期消解，子囊孢子卵圆形、近球形，壁光滑，4. 4-5. 8X4. 2-4. 7 μ m。本发明紫红曲菌 W5S7可在PDA培养基和查氏合成培养基上可以很好的生长和产孢子，其中最适培养基为 PDA培养基。将本发明紫红曲菌W5S7的发酵液以5000r/min的速度离心20min，保留发酵上清 液，将沉淀与95%乙醇混合，在超声波振荡器频率为IOkHz时提取60min，再将提取液离心 分离，重复三次；将乙醇提取液与发酵上清液合并，置于旋转蒸发器中，在转数80r/min、蒸 发温度60°C的条件下浓缩至原体积1/4，将浓缩液置于80°C鼓风干燥箱中，干燥至恒重，研 磨成粉末，即制得紫红曲菌W5S7粉剂。本发明制成的紫红曲菌W5S7粉剂具有制作简单、性 质稳定、易于保存、成本低廉的优点。本发明的紫红曲菌W5S7 (Monascus purpureus W5S7)属于红曲菌属(Monascus)， 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰 西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏日期为2010年9月16日，保藏号为CGMCC No.4174。
图1为本发明紫红曲菌W5S7 (Monascus purpureus W5S7)菌株在固体培养基上的 菌落形态图。图2为本发明紫红曲菌W5S7 (Monascuspurpureus W5S7)菌株的分生孢子形态图。图3为本发明紫红曲菌W5S7 (Monascus purpureus W5S7)菌株的菌丝与分生孢子 形态图。图4为具体实施方式
一中紫红曲菌W5S7防腐剂对枯草芽胞杆菌的抑菌实验结果 图。图5为具体实施方式
一中紫红曲菌W5S7防腐剂对酵母菌的抑菌实验结果图。图6为具体实施方式
一中紫红曲菌W5S7防腐剂对大肠杆菌的抑菌实验结果图。图7为具体实施方式
一中紫红曲菌W5S7防腐剂对白色葡萄球菌的抑菌实验结果 图。图8为用不同浓度紫红曲菌W5S7防腐剂水溶液处理后的熟五花肉。图9为具体实施方式
一中紫红曲霉菌W5S7与Genbank中收录的相近菌株所构建 的系统发育树。图10为具体实施方式
一中紫红曲霉菌W5S7与现有相近似菌株的基因比对结果。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式的具有防腐功能的紫红曲菌为紫红曲菌W5S7 (Monascuspurpureus W5S7)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏号为CGMCC No. 4174。本实施方式的紫红曲菌W5S7是从克东腐乳中分离、纯化后，经微波辐照诱变技术 进行诱变筛选得到。具体步骤如下(一)菌种的分离纯化用接种针挑取小块腐乳外皮， 在查氏合成培养基上进行多次划线分离，28 30°C恒温培养5 6d，观察菌落生长，将红色 或紫色的菌落作为初筛菌落；将初筛菌落接种到PDA固体培养基上，在28 30°C恒温纯化 培养；(二)菌种的微波诱变及选育将纯化后的菌种接种到PDA斜面培养基上，30°C恒温 培养7d，用无菌生理盐水将孢子洗涤下来，倒入装有已灭菌玻璃珠的三角瓶中，震荡将孢子 打散，滤去菌丝体，得到的孢子悬液，并用无菌水调整孢子浓度IO5个/mL ；将IOmL孢子悬液 移入无菌试管内，并将试管置于微波装置中，微波频率2450MHz，辐照功率100 800W (间隔 100W)；辐照时间10 150S(间隔IOs)的条件下对孢子悬液进行辐照。对辐照后孢子悬液 进行倍比稀释，涂布于PDA培养基上，于30°C恒温培养3d，记录总菌落数和存活菌落数，计 算致死率和突变率，确定最佳诱变条件为微波功率500W，辐照时间70s ；(三)初筛将辐 照后孢子悬液涂布于PDA培养基上，30°C恒温培养，7 IOd后观察菌落形态差异，选取颜 色变化较大的菌落接种于PDA斜面培养基上，30°C恒温培养7d,用无菌水洗涤孢子，分别制 得孢子悬液，进行复筛备用；(四)复筛分别将初筛到的红曲霉菌孢子悬液吸取10mL，接 种于150mL液体发酵培养基中，以培养温度30°C、摇床转数200r/min的条件培养14d，根据 《GB4926-2008食品添加剂红曲米粉》国标中色价的测定方法一分光光度法对发酵液进行 检测，在波长为505nm处，测得发酵液吸光度值最大的即为抑菌物质产量最高菌株，选定为 紫红曲菌W5S7菌株。所述液体发酵培养基(g/L):玉米粉60，黄豆粉5，葡萄糖3，NaN034， 酵母粉 5，ZnSO4O. 2，MgSO4I, K2HP035。将本发明紫红曲菌W5S7的孢子浓度为IO5的菌悬液按体积比5%接种于液体发 酵培养基中，培养温度28 30°C，摇床转数180r/min，培养基初始pH4. 5，培养14d后得到 液态发酵液。将发酵液在5000r/min的条件下离心20min，保留上清液，将沉淀与95%乙醇 混合，在超声波振荡器频率为IOkHz提取60min，再将提取液离心分离，重复三次。将发酵 上清液与乙醇提取液合并，在旋转蒸发器中转数80r/min，蒸发温度60°C时，浓缩至原体积 1/4，将浓缩液置于80°C鼓风干燥箱中，干燥至恒重，研磨成粉末，即制成紫红曲菌W5S7防 腐剂粉剂。所述液体发酵培养基(g/L):玉米粉60，黄豆粉5，葡萄糖3，NaN034，酵母粉5， ZnSO4O. 2，MgSO4I, K2HP035。本发明对紫红曲菌W5S7防腐剂粉剂进行了抑菌性试验，试验选取大肠杆菌、白 色葡萄球菌、枯草芽孢、霉菌、酵母菌作为指示菌。用移液管分别吸取预先培养的浓度均 为IO5 IO6CfuAiL的大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、白色葡萄球菌、酵母菌及青霉菌的菌液各 0. 5mL，分别均勻涂布的在平板培养基上，将已灭菌的中性滤纸片(直径为6mm)贴在涂布菌 液的平板培养基上。其中，大肠杆菌、枯草芽胞杆菌及白色葡萄球菌采用营养琼脂培养基； 青霉菌采用PDA培养基；酵母菌采用麦芽汁培养基。取紫红曲菌W5S7防腐剂粉剂2g溶于 IOOmL 95%乙醇溶液中，用微量进样器取紫红曲菌W5S7防腐剂乙醇溶液10 μ L滴加到滤纸 片上，同时以滴加95%乙醇的中性滤纸片做空白对照，细菌37°C培养24h，酵母菌28°C培养 24h，青霉菌28°C培养48h，测量抑菌圈直径大小并计算抑菌率，试验结果如表1所示。其中 抑菌率的计算公式为
抑菌率=(抑菌圈直径-滤纸片直径)/滤纸片直径X 100%表1紫红曲菌W5S7防腐剂对指示菌的抑菌效果
权利要求
一种具有防腐功能的紫红曲菌，其为紫红曲菌W5S7(Monascus purpureus W5S7)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4174。
全文摘要
一种具有防腐功能的紫红曲菌。属于微生物领域。本发明的目的是提供一种紫红曲菌菌株，其在保持了原有着色功能的同时，具有良好的抑菌防腐功能，对食品中常见的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及酵母菌均有抑制效果。本发明具有防腐功能的紫红曲菌为紫红曲菌W5S7(MonascuspurpureusW5S7)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.4174。本发明为生物防腐剂在食品防腐领域中的应用奠定了基础。
文档编号C12N1/14GK101988037SQ20101052997
公开日2011年3月23日 申请日期2010年11月3日 优先权日2010年11月3日
发明者徐伟 申请人:哈尔滨商业大学