专利名称：一种基于配位作用的固相介质提取dna的方法
技术领域：
本发明属于生物技术的技术领域，具体涉及一种利用可与DNA分子产生配位作用 的固相介质在生物样品中提取DNA的方法。
背景技术：
DNA提取是分子生物学研究和生物工程中的一项关键技术，是DNA分析的基础和 前提。DNA提取的质量直接关系到PCR扩增、基因测序的后续步骤的成功与否。随着DNA分 析技术在分子生物学研究、临床疾病诊断、进出口检验检疫、法医学检验、血液质量控制等 领域应用的逐渐深入，对开发高效、快速、简便、低成本的DNA提取技术的需求也与日俱增。目前常用的几种DNA提取方法包括苯酚-氯仿法、Chelex-IOO法和固相提取法 等。它们均有各自的特点和适用体系苯酚-氯仿法适用范围广，但操作时间长，提取效率较低且因人而异，所用试剂毒 性较大，对环境有污染。Chelex-IOO法操作简便，提取的DNA可直接用于PCR扩增；但其提取效率低，且对 体系有一定选择性。固相提取法是目前发展较快的一种方法，它采用玻璃珠、氧化硅微粒或氧化硅包 覆的磁性微粒为固相提取介质，这些介质表面都有可部分解离的硅羟基，在高盐浓度溶液 中，DNA带有负电的磷酸根可以通过盐桥的媒介作用吸附在Si02粒子表面。该方法提取纯 度高，操作简便，尤其是采用氧化硅复合磁性粒子为介质，可实现对样品的快速、高通量的 自动化提取。但由于这种提取方法依赖的是氧化硅粒子表面和DNA磷酸根之间的较弱的间 接静电相互作用，因此DNA的吸附效率很难进一步提高，通常最高只能达到80%左右。要想进一步提高固相提取法对DNA的吸附效率，需要对吸附介质表面进行修饰， 增强其与DNA分子之间的相互作用。从DNA分子结构看，其链上的磷酸根具有很强的配位能 力，可以和多种金属离子发生很强的配位作用。因此，我们可以通过对吸附介质进行表面修 饰，使DNA分子和介质表面产生很强的配位作用，从而实现对DNA的吸附和提取。由于配位 作用的强度要远大于静电相互作用，这样的设计将有助于进一步提高对DNA的吸附效率。
发明内容
本发明的目的就是提供一种利用DNA分子与固相介质间的配位相互作用实现对 生物样品中DNA的高效提取的方法，将DNA吸附效率提高到90%以上，以克服现有提取技术 提取效率偏低的缺陷。本发明的方法包括如下步骤(1)将利用硅烷偶联试剂在表面修饰可吸附金属离子基团的固相提取介质和浓度 为10 25mmol/mL的金属离子溶液混合，每毫升金属离子溶液加入0. 4 0. 5毫克固相提 取介质，吸附1 2小时后，采取离心或磁吸方式将固相介质和溶液分离，用高纯水清洗所 得固相；
(2)将吸附了金属离子的固相介质和含DNA的溶液样品混合，DNA样品与吸附了 金属离子的固相介质的质量比在0. 009 0. 01范围；用NaCl调节混合溶液的离子强度在 0. 01 0. 5mmol/mL范围，在pH值2. 5 4. 5下将混合溶液静置15分钟以完成DNA分子在 固相提取介质表面的吸附；根据所用不同的固相提取介质，采取离心或磁吸等分离方式，将 吸附了 DNA分子的固相介质和溶液分离。本发明步骤(1)中所述的固相提取介质包括玻璃珠(尺寸在毫米区间)，无定形氧 化硅微粒(形状为球形或无定形，尺寸范围在50μπι lOOnm)，介孔氧化硅微粒(尺寸范 围在50 μ m IOOnm)，无定形氧化硅包覆磁性微粒(尺寸范围在50 μ m lOOnm，磁性内核 为狗，Co, Ni, Fe2O3' Fe3O4或其混合物)和介孔氧化硅包覆磁性微粒(尺寸范围在50 μ m lOOnm，磁性内核为Fe，Co，Ni，Fe2O3, Fe3O4或其混合物)。本发明步骤(1)中所述的表面修饰改性是指利用硅烷偶联试剂在上述固相介质 表面修饰可吸附金属离子的基团，如羧基等。所用硅烷偶联剂为3-环氧基丙基三甲氧 基硅烷和氨羧类螯合物反应制得，所用氨羧类螯合物包括亚胺基二乙酸(IDA)、三乙酸胺 (NTA)、羧甲基天冬氨酸(CM-ASP)、三羧甲基乙二胺(TED)、羧甲基四聚天冬氨酸(CM-TEPA)
等。分子结构式分别如下
权利要求
1.一种基于配位作用的固相介质提取DNA的方法，有如下步骤(1)将利用硅烷偶联试剂在表面修饰可吸附金属离子基团的固相提取介质和浓度为 10 25mmol/mL的金属离子溶液混合，每毫升金属离子溶液加入0. 4 0. 5毫克固相提取 介质，吸附1 2小时后，采取离心或磁吸方式将固相介质和溶液分离，用高纯水清洗所得 固相；(2)将吸附了金属离子的固相介质和含DNA的溶液样品混合，DNA样品与吸附了金属离 子的固相介质的质量比在0. 009 0. 01范围；用NaCl调节混合溶液的离子强度在0. 01 0. 5mmol/mL范围，在pH值2. 5 4. 5下将混合溶液静置15分钟以完成DNA分子在固相提 取介质表面的吸附；采取离心或磁吸方式，将吸附了 DNA分子的固相介质和溶液分离。
2.如权利要求1所述的基于配位作用的固相介质提取DNA的方法，其特征是，所述的利 用硅烷偶联试剂在表面修饰可吸附金属离子基团的固相提取介质，是用3-环氧基丙基三 甲氧基硅烷作硅烷偶联剂，和氨羧类螯合物反应制得；所述的氨羧类螯合物，是亚胺基二乙 酸、三乙酸胺、羧甲基天冬氨酸、三羧甲基乙二胺或羧甲基四聚天冬氨酸。
3.如权利要求1或2所述的基于配位作用的固相介质提取DNA的方法，其特征是，所述 的固相提取介质，是玻璃珠、无定形氧化硅微粒、介孔氧化硅微粒、无定形氧化硅包覆磁性 微粒或介孔氧化硅包覆磁性微粒。
4.如权利要求1或2所述的基于配位作用的固相介质提取DNA的方法，其特征是，所述 的金属离子是 Si2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+ 或 Ce4+。
全文摘要
本发明的一种基于配位作用的固相介质提取DNA的方法，属于生物技术的技术领域。包括如下步骤将利用硅烷偶联试剂在表面修饰可吸附金属离子基团的固相提取介质和金属离子溶液混合，吸附后采取离心或磁吸方式将固相介质和溶液分离，所述的金属离子是Zn2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+或Ce4+；将吸附了金属离子的固相介质和含DNA的溶液样品混合，调节混合溶液的离子强度在0.01～0.5mmol/mL、pH值2.5～4.5，静置15分钟以完成DNA分子的吸附，采取离心或磁吸将吸附了DNA分子的固相介质和溶液分离。本发明的优点在于对DNA的吸附率高于90％，操作快速便捷。
文档编号C12N15/10GK102146369SQ20101060400
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者姜珊, 庄家骐, 杨文胜 申请人:吉林大学