专利名称：木糖渣或糠醛渣预处理菌剂及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于农业微生物技术领域，特别涉及一种木糖渣或糠醛渣预处理菌剂及其制备方法及其用途。
背景技术：
随着我国经济快速发展，能源需求逐年增长，能源短缺问题也日益突出。目前我国大力发展包括沼气在内的可再生能源以应对化石能源的短缺，实现我国经济的可持续发展。在沼气原料方面，除了畜禽粪便，最为人瞩目的是利用农作物秸秆生产沼气。然而秸秆本身难以充分降解，严重影响了其产气效率和使用范围，至今尚处于研究开发阶段。木糖渣是木糖醇生产过程中产生的副产品。近年来，随着我国食品及化学工业对木糖醇的需求量逐年增加，我国生产木糖醇的厂家和产量也在上升。通常生产1吨木糖醇会产生含水量70%-80%的木糖渣26-28吨。这些废渣占用大量场地存放，且在春夏季节对周边环境的植物生长造成严重影响，对环境造成严重污染。目前生产木糖醇的原料为玉米芯、棉籽壳及甘蔗渣等，故木糖渣中纤维原料含量丰富，其含量通常在50%-60%，且经过酸处理后已经变成粉末状，便于微生物作用，不易结壳，是一种生产沼气的良好原料。我国是糠醛的主要生产国和出口国之一，在其生产过程中能够产生大量糠醛废渣。每吨糠醛产品伴随着10吨以上残渣排放。我国每年排放糠醛废渣近三千万吨。由于木糖渣或糠醛渣中纤维素、半纤维素和木质素含量较高，难以降解，故其产气效率受到一定影响。针对木糖渣及糠醛渣自身特性，开发相应的微生物处理菌剂，可以提高木糖渣或糠醛渣生产沼气的效率，并有利于保证在冬季低温条件下保证沼气工程正常运行。中国专利文件200510077792. 3公开了一种复合菌剂预处理秸秆的发酵方法，其菌剂组成为木霉菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。秸秆经粉碎、润湿后加入复合菌剂和碳酸氢铵进行堆怄后进行沼气发酵。经预处理后的秸秆发酵速度和产气速度均有提高，且产气时间缩短。其所开发的菌剂可用于玉米秸秆、稻草、麦秆等农业废弃物预处理，使用范围广泛。中国专利文件200810140400. 7公开了一种沼气池用复合微生物菌剂及其制备方法。 该发明提出了一种沼气池用复合微生物菌剂，是由荧光假单胞菌、蜡质芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和环状芽孢杆菌四种微生物组成。该菌剂不仅能够促进冬季沼气池正常产气，且可以利用秸秆作为主要原料制取沼气。万楚筠等.微生物预处理油菜秸秆堆提高沼气产量的影响[J].农业工程学报，2010，26: 267-271.)利用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、变色栓菌、黄孢原毛平革菌制备了油菜秸秆的降解混合菌剂。上述三个文件均只针对秸秆开发了相应的微生物菌剂并用于沼气发酵预处理过程，对其他工业纤维质原料(如木糖渣、糠醛渣)则无涉及。较之秸秆，木糖渣或糠醛渣酸度较高，且含有少量糠醛，对多种微生物(尤其是酵母和细菌)活性均有较强抑制作用。因此，针对性的开发相应的预处理菌剂对于提高其发酵速度和产气效率极为重要。
发明内容
本发明目的是提供一种用于木糖渣或糠醛渣预处理的菌剂，该菌剂针对木糖渣或糠醛渣的自身特点，可以大幅提高木糖渣或糠醛渣发酵速度，保证低温条件下木糖渣或糠醛渣生产沼气。此外，该菌剂在秸秆预处理方面也有良好的效果。本发明技术方案如下一种木糖渣或糠醛渣预处理菌剂，是由绿色木霉、黄孢原毛平革菌、黑曲霉、米曲霉、变色栓菌五种菌经液态发酵后得到的菌液混合制成，其按重量份如下绿色木霉菌液0. 20-0. 40，黄孢原毛平革菌菌液0. 10-0. 15，黑曲霉菌液0. 05-0. 10， 米曲霉菌液0. 08-0. 16，变色栓菌菌液0. 05-0. 10 ；上述发酵菌丝重量(干重)为20g/L以上。木糖渣或糠醛渣预处理菌剂及其制备方法，它包括如下步骤①将绿色木霉、黄孢原毛平革菌、黑曲霉、米曲霉和变色栓菌这五种菌分别按照斜面菌种活化、摇瓶发酵、种子罐液态发酵、生产发酵罐液态发酵生产五个步骤进行分别得到绿色木霉菌液、黄孢原毛平革菌菌液、黑曲霉菌液、米曲霉菌液、变色栓菌菌液；
②菌液复配，将上述五种菌菌液按上述比例进行混合制成液体剂型。木糖渣或糠醛渣预处理菌剂及其制备方法，其特征是将绿色木霉菌液、黄孢原毛平革菌菌液、黑曲霉菌液、米曲霉菌液、变色栓菌菌液按比例混合后的菌液中加入固体填料制成固体剂型。所述固体填料为木糖渣、糠醛渣、草炭、硅藻土中的一种或几种混合，其总用量为混合后菌液总重量的4-10倍。木糖渣或糠醛渣预处理菌剂的用途，其特征是将所述的木糖渣或糠醛渣预处理菌剂用于木糖渣或糠醛渣在进行沼气发酵前的预处理。为了方便实现本发明，本发明记载下述培养基及培养方法，但菌种培养基及培养方法不限于此，采用其它常规方法对所用菌种进行发酵也可以得到本发明提及的绿色木霉菌液、黄孢原毛平革菌菌液、黑曲霉菌液、米曲霉菌液、变色栓菌菌液。所述绿色木霉、黄孢原毛平革菌、黑曲霉、米曲霉和变色栓菌的菌种活化培养基包括土豆提取液200克，葡萄糖20克，自来水1000毫升，琼脂20克，PH 5.0。其中土豆提取液是指，土豆200克，切块煮沸30分钟后用细纱布(80-150目)过滤后所得澄清提取液。1)所述绿色木霉的液态发酵培养条件是酵母膏15克，葡萄糖20克，微晶纤维素Mg，玉米浆10克，麸皮20克，磷酸二氢钾1. 8克，硫酸镁0. 9克，硫酸铵6克，硫酸亚铁 0. 05克，氯化钴0. 4克，氯化钙0. 5克，消泡剂0. 1毫升，自来水1000毫升，ρΗ5· 0。绿色木霉孢子悬液(IO7个/毫升)接种量5%_10% (ν/ν)，培养温度^_32°C，转速 200转/分钟，通气量1:1 (通气体积比，以发酵罐装液量为基准)培养1-3天到对数生长期获得液体种子。2)黄孢原毛平革菌菌液的液态发酵培养条件葡萄糖15克，磷酸二氢钾3. 6克，硫酸铵2. 4克，玉米浆10克，麸皮5克，硫酸镁0. 3克，氯化钙0. 6克，硫酸亚铁5. 2毫克，硫酸锰1. 8毫克，硫酸锌2. 2毫克，硫酸铜0. 8毫克，自来水1000毫升，消泡剂0. lml，pH6. 0。黄孢原毛平革菌孢子悬液(IO6个/毫升)接种量5%_10%( v/v)，培养温度25-28°C， 转速150转/分，通气量1:1 (通气体积比，以装液量为基准)培养时间2-5天到对数生长期获得液体种子。3)变色栓菌菌液液态发酵培养条件葡萄糖15克，磷酸二氢钾3. 8克，硫酸铵2. 2克，玉米浆12克，麸皮10克，硫酸镁0. 3克，氯化钙0. 6克，硫酸亚铁4. 6毫克，硫酸锰2. 2 毫克，硫酸锌2. 6毫克，硫酸铜1. 3毫克，自来水1000毫升，消泡剂0. Iml, ρΗ6· 0。孢子悬液(IO6个/毫升)接种量5%-10%(ν/ν)，培养温度25_28°C，转速150转/分， 通气量1 1 (通气体积比，以装液量为基准)培养时间2-5天到对数生长期获得液体种子。4)黑曲霉的液态发酵培养条件，葡萄糖20克，豆粕30克，麸皮20克，磷酸二氢钾1. 8克，硫酸镁0. 9克，硝酸铵1. 5克，消泡剂0. 1毫升，自来水1000毫升，pH 5. 0。黑曲霉菌孢子悬液(IO7个/毫升)接种量5%_10% (ν/ν)，培养温度28-32°C，转速 200转/分钟，通气量1:1 (通气体积比，以发酵罐装液量为基准)培养1-3天到对数生长期获得液体种子 。5)米曲霉的液态发酵培养条件，葡萄糖10克，淀粉40，豆粕30克，麸皮20克， 磷酸二氢钾1. 5克，硫酸镁0. 2克，硫酸铵0. 4克，氯化钙0. 6g，氯化钾0. 4g，消泡剂0. 1毫升，自来水1000毫升，pH 5.0。米曲霉孢子悬液(IO7个/毫升)接种量5%-10% (v/v)，培养温度28-32°C，转速200转/分钟，通气量1:1 (通气体积比，以发酵罐装液量为基准)培养 1-3天到对数生长期获得液体种子。上述说明中所述及的孢子悬液是指，利用无菌水(自来水在121°C下灭菌30分钟， 含体积分数为0. 1%吐温80)对绿色木霉菌、黑曲霉菌、米曲霉菌、变色栓菌和黄孢原毛平革菌斜面冲洗后稀释一定倍数所得的含有一定孢子数量的悬浮溶液。上述微生物菌剂的指标方法中未明确限定的均可依照现有技术进行。本发明所述复合微生物菌剂使用温度在15°C以上，发酵原料为木糖渣、糠醛渣二者或二者之一与碳酸氢铵、氨水二者或其中之一的混合物。本发明采用五种真菌进行复配，其中的黄孢原毛平革菌和变色栓菌可以降解木糖渣或糠醛渣中的糠醛组分，以及其中的纤维素、木质素和半纤维素；木霉、黑曲霉和米曲霉可以在酸性条件下(PH3-6)降解木糖渣或糠醛渣中的纤维素和半纤维素。此外，该真菌菌剂还可以通过菌丝的机械穿透力破坏木糖渣或糠醛渣的物理结构，使其变得更容易降解。通过该复合真菌菌剂处理的木糖渣或糠醛渣用于沼气发酵中，可以加快沼气启动时间，比未处理的木糖渣或糠醛渣，其启动时间通常可以提前3-10天，且产气效率提高30%-60%。尤其在冬季，经复合真菌菌剂处理的木糖渣或糠醛渣作为沼气发酵主要原料可以保证在低温 (15°C _18°C)条件下持续产气，而对照组采用未经处理的木糖渣或糠醛渣几乎不产沼气。
具体实施例方式以下实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不只限于此。如无特殊说明，原料用量为重量份。各实施例中木糖渣、糠醛渣、草炭、硅藻土可以通过购买获得。原料需过60 目筛，含水量10%以下。实施例1
M^y^M (Trichoderma Firiofe )、黄抱原毛平革菌{Phanerochae te chrysosporium ) > 黑曲 M ^Aspergillus niger)、米曲毒(Aspergillus oryzae)> 变色栓鬼、Trametes versicolor)均可在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)获得，绿色木霉为CGMCC 3. 5455，3. 3711，3. 4005，3. 4264，3. 2941，3. 2942,3. 2876,3. 1913 其中之一；黄孢原毛平革菌CGMCC编号为5. 776，变色栓菌CGMCC编号为5. 48或5. 161，黑曲霉菌CGMCC编号为 3. 6479，3. 6478，3. 6477，3. 6476，3. 6475，3. 6329 其中之一；米曲霉为 3. 5232，3. 4437， 3. 4383，3. 4382，3. 4259，3. 2140其中之一。经常规液态纯种发酵后获得五种菌液。其菌体干重均达到20克/升。具体实施方法如下
1)将上述五种微生物采用各自活化斜面培养基进行活化，在30°C条件下培养8天。2)将上述活化好的菌种孢子悬液接种到各自液态培养基。绿色木霉培养酵母膏15克，葡萄糖20克，玉米浆10克，麸皮20克，磷酸二氢钾
1.8克，硫酸镁0. 9克，硫酸铵6克，硫酸亚铁0. 05克，氯化钴0. 4克，氯化钙0. 5克，消泡剂0. 1毫升，自来水1000毫升，pH5.0。孢子悬液(IO7个/毫升)接种量5% (v/v)，培养温度^°C，转速200转/分钟，培养2天到对数生长期获得液体种子。黄孢原毛平革菌培养葡萄糖15克，磷酸二氢钾3. 6克，硫酸铵2. 4克，玉米浆10 克，麸皮5克，硫酸镁0. 3克，氯化钙0. 6克，硫酸亚铁5. 2毫克，硫酸锰1. 8毫克，硫酸锌
2.2毫克，硫酸铜0.8毫克，自来水1000毫升，pH 6.0。孢子悬液(106个/毫升)接种量 5% (v/v)，培养温度^°C，转速150转/分，培养3天到对数生长期获得液体种子。变色栓菌培养葡萄糖15克，磷酸二氢钾3. 8克，硫酸铵2. 2克，玉米浆12克，麸皮10克，硫酸镁0. 3克，氯化钙0. 6克，硫酸亚铁4. 6毫克，硫酸锰2. 2毫克，硫酸锌2. 6毫克，硫酸铜1.3毫克，自来水1000毫升，消泡剂0. lml，pH6.0。孢子悬液(106个/毫升)， 接种量5% (v/v)，培养温度28°C，转速200转/分钟，通气量1:1 (通气体积比，以发酵罐装液量为基准)培养2天到对数生长期获得液体种子。米曲霉培养葡萄糖10克，淀粉40，豆粕30克，麸皮20克，磷酸二氢钾1. 5克，硫酸镁0. 2克，硫酸铵0. 4克，氯化钙0. 6g，氯化钾0. 4g，消泡剂0. 1毫升，自来水1000毫升， PH 5.0。孢子悬液(107个/毫升)接种量10% (v/v)，培养温度30°C，转速200转/分钟， 通气量1 1 (通气体积比，以发酵罐装液量为基准)培养2天到对数生长期获得液体种子。3)种子罐300L，装液量200L，按照上述五种微生物培养基配方分别投料，并按比例加入前文所述消泡剂，灭菌后按照5%接种量接入摇瓶液体种子液，绿色木霉菌、黑曲霉菌及米曲霉菌培养时间36小时，培养温度32°C，转速均为250转/分；变色栓菌和黄孢原毛平革菌培养温度，转速200转/分，培养时间3天，培养温度，转速200转/分。 上述发酵过程中通气量均为1:1 (体积比)。4)生产发酵罐2000升，装液量1400升，按照上述五种微生物培养基配方分别投料，按比例加入消泡剂灭菌后按照10%接种量接入达到对数生长期液体种子。绿色木霉菌、 黑曲霉菌和米曲霉菌培养时间32小时，培养温度32°C，转速均为300转/分；黄孢原毛平革菌和变色栓菌培养时间3天，培养温度，转速200转/分。上述发酵过程中通气量均为1:1 (体积比)。发酵完毕后获得菌液。上述菌液按照如下比例进行混合绿色木霉菌液0.40，黄孢原毛平革菌菌液 0. 15，黑曲霉菌液0. 05，米曲霉菌液0. 08，变色栓菌菌液0. 10，即得微生物菌剂。实施例2
五种菌的菌液制备方法如实施例1所述。木糖渣3份，硅藻土 1份，草炭1份。将木糖渣、硅藻土和草炭灭菌后混合均勻后加入微生物菌剂(绿色木霉菌液0. 30，黄孢原毛平革菌菌液0. 10，黑曲霉菌液0. 06，米曲霉菌液0. 16，变色栓菌菌液0. 05。)，混合均勻后即得复合固体菌剂。
实施例3
五种菌的菌液制备如实施例1所述。糠醛渣1份，草炭2份，硅藻土 2份，灭菌后加入混合器加入微生物菌剂(绿色木霉菌液0. 20，黄孢原毛平革菌菌液0. 15，黑曲霉菌液0. 05，米曲霉菌液0. 10，变色栓菌菌液 0.10。)，混合均勻后即得复合固体菌剂。实施例4
将实施例1中所获得的液体菌剂接种到木糖渣中(PH 3，含水量50%)，接种量按重量份计9份木糖渣接入1份液体菌剂，混勻后于25°C条件下处理15天后作为主要原料进行厌氧发酵产沼气实验(预处理的木糖渣100份，尿素0. 1份)，对照组为未处理的木糖渣100份， 尿素0. 1份。在35°C培养条件下，沼气发酵启动时间比对照组缩短6天，产气率提高45%。实施例5
将实施例2中所获得的固体菌剂接入糠醛渣中(pH 4，含水量20%)并调节含水量为70% (w/w)，于18°C条件下处理20天后作为主要原料进行沼气发酵实验(预处理的糠醛渣100 份，尿素0. 1份)，对照组为未处理的糠醛渣100份，尿素0. 1份。在20°C培养条件下，沼气发酵启动时间比对照组缩短10天，产气率提高60%。
权利要求
1.一种木糖渣或糠醛渣预处理菌剂，是由绿色木霉、黄孢原毛平革菌、黑曲霉、米曲霉、变色栓菌五种菌经液态发酵后得到的菌液混合制成，其按重量份如下绿色木霉菌液0. 20-0. 40，黄孢原毛平革菌菌液0. 10-0. 15，黑曲霉菌液0. 05-0. 10，米曲霉菌液 0. 08-0. 16，变色栓菌菌液0. 05-0. 10 ；上述发酵菌丝重量干重为20g/L以上。
2.根据权利要求1所述的木糖渣或糠醛渣预处理菌剂，其特征是所述五种菌的菌液的重量份为绿色木霉菌液0. 40，黄孢原毛平革菌菌液0. 15，黑曲霉菌液0. 05，米曲霉菌液 0. 08，变色栓菌菌液0. 10。
3.—种如权利要求1所述的木糖渣或糠醛渣预处理菌剂的制备方法，它包括如下步骤①将绿色木霉、黄孢原毛平革菌、黑曲霉、米曲霉和变色栓菌这五种菌分别按照斜面菌种活化、摇瓶发酵、种子罐液态发酵、大罐液态发酵生产五个步骤进行分别得到绿色木霉菌液、黄孢原毛平革菌菌液、黑曲霉菌液、米曲霉菌液、变色栓菌菌液；②菌液复配，将上述五种菌菌液按比例进行混合制成液体剂型。
4.一种根据权利要求3所述的木糖渣或糠醛渣预处理菌剂的制备方法，其特征是将绿色木霉菌液、黄孢原毛平革菌菌液、黑曲霉菌液、米曲霉菌液、变色栓菌菌液按比例混合后的菌液中加入固体填料制成固体剂型。
5.根据权利要求4所述的木糖渣或糠醛渣预处理菌剂的制备方法，其特征是所述固体填料为木糖渣、糠醛渣、草炭、硅藻土中的一种或几种混合，其总用量为混合后菌液总重量的4-10倍。
6.一种木糖渣或糠醛渣预处理菌剂的用途，其特征是将权利要求1所述的木糖渣或糠醛渣预处理菌剂用于木糖渣或糠醛渣在进行沼气发酵前的预处理。
全文摘要
一种木糖渣或糠醛渣预处理菌剂及其制备方法和用途，属于农业微生物技术领域，涉及到一种特别用于促进木糖渣或糠醛渣降解、提高沼气生产效率的微生物复合菌剂。本发明首先采用液体发酵工艺对微生物菌剂各组分进行纯种发酵后进行复配而成。该菌剂配制方法为绿色木霉菌液0.20-0.40重量份，黄孢原毛平革菌菌液0.10-0.15重量份，黑曲霉菌液0.05-0.10重量份，米曲霉菌液0.08-0.16重量份，变色栓菌菌液0.05-0.10重量份。上述发酵菌丝重量干重为20g/L以上。该复合菌剂可以提高木糖渣或糠醛渣的降解速度及其产沼气效率，产气率提高30%-60%，缩短发酵时间，启动期缩短3-10天；对粉碎后秸秆预处理及产沼气也收到良好的效果。
文档编号C12R1/69GK102154108SQ20111002121
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月19日 优先权日2011年1月19日
发明者华栋梁, 张晓东, 张 杰, 李岩, 梁晓辉, 许海朋 申请人:山东省科学院能源研究所