专利名称：用于检测水稻白叶枯病菌的引物、方法以及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测水稻白叶枯病菌的引物、方法以及试剂盒，具体涉及一种用于检测水稻白叶枯病菌强毒菌株GD414的引物、方法以及试剂盒。
背景技术：
按照在一套水稻近等基因系上的反应型，可以将中国水稻白叶枯病菌划分成9个标准生理小种，其中GD414是R3号小种的典型代表，是我国发现的一株水稻白叶枯病菌强毒菌株。因为各水稻品种对各水稻白叶枯病菌小种的抗性不一样，因此鉴定各地区的流行小种对水稻种植品种的选择将具有指导意义。GD414作为一个典型小种的代表，在中国南方稻区经常作为优势小种出现，因此鉴定GD414将具有更重要的意义和作用。传统的鉴定方法是通过菌株在6个水稻近等基因系材料上的抗病反应模型来判断，这种方法需时较长，工作繁琐且精确度较低。分子水平鉴定方法比传统的寄主反应方法更简单、快速，并且节约空间和劳动力。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种用于检测水稻白叶枯病菌强毒菌株GD414的引物、方法以及试剂盒，利用所述引物、方法以及试剂盒能够准确、简便、迅速地将GD414与其它白叶枯病菌菌株区分开来，从而为水稻种植品种的选择提供必要的指导。用于实现上述目的的技术方案如下一种用于检测水稻白叶枯病菌菌株GD414的引物，该引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO :4，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO :3。一种用于检测水稻白叶枯病菌菌株⑶414的方法，该方法包括以下步骤(I)挑取待测菌株菌落或提取待测菌株基因组DNA作为PCR扩增模板，采用上述引物进行PCR扩增；(2)对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。在上述方法中，挑取待测菌株菌落作为PCR扩增模板时，PCR扩增的条件为94°C下变性5分钟；94°C下变性30秒，58 °C下退火30秒，72 °C下延伸I分钟，30-35个循环；72°C延伸10分钟。在上述方法中，提取待测菌株基因组DNA作为PCR扩增模板时，PCR扩增的条件为94°C下变性3分钟；94°C下变性30秒，58 °C下退火30秒，72 °C下延伸I分钟，30-35个循环；72°C延伸10分钟。PCR反应体系为20 μ I反应体系，包括10XPCR缓冲液2 μ L，dNTP(各2. 5mM)lyL，引物(10 μ Μ)各I μ L，Taq酶1U，待测菌株基因组DNA 10ng，补ddH20至反应总体积为20yL。其中10XPCR缓冲液成分如下200mMTris-HCl(pH 8. 4), 200mM KCl,IOOmM(NH4)2SO4,15mM MgCl20在上述方法中，琼脂糖凝胶的浓度为O. 8-2% (g/ml)，琼脂糖凝胶电泳的电压为4-6v/cm,水稻白叶枯病菌菌株⑶414的琼脂糖凝胶电泳特异性条带出现在985bp处。一种用于检测水稻白叶枯病菌菌株GD414的试剂盒，该试剂盒包含上述引物。优选地，所述试剂盒还包括Taq酶，dNTP，10XPCR缓冲液。其中10XPCR缓冲液成分如下200mM Tris-HCKpH 8. 4), 200mM KCl, IOOmM(NH4)2SO4,15mM MgCl20本发明利用生物信息和生物学知识，通过一系列实验筛选，发现了⑶414菌株基因组所具有的与其它白叶枯病菌菌株所不同的特异性位点，并利用这一特异位点设计并筛选出相应的引物、PCR检测方法以及相应的检测试剂盒，从而将GD414与其它白叶枯病菌菌株准确、简便、迅速地区分开来。实验结果表明，采用琼脂糖凝胶电泳分析时，水稻白叶枯病菌菌株GD414的特异性条带出现在985bp处，非常易于辨认区分，表明上述引物、方法以及试剂盒明显更有利于水稻白叶枯病菌菌株GD414鉴定。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图I显示实施例I中采用初始引物对水稻白叶枯病菌标准生理小种菌株多态性的检测结果；图2显示实施例I中采用⑶414(4)引物对水稻白叶枯病菌标准生理小种菌株检测的结果；图3显示实施例I中采用GD414(5)引物，即本发明的特异性引物对水稻白叶枯病菌标准生理小种菌株检测的结果；图4a_d显示实施例2中采用本发明的特异性引物对大批量水稻白叶枯病菌菌株(Xoo)检测的结果，其中菌株名分别如下
权利要求
1.一种用于检测水稻白叶枯病菌菌株GD414的引物，该引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO :4，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO :3。
2.一种用于检测水稻白叶枯病菌菌株GD414的方法，该方法包括以下步骤 (1)挑取待测菌株菌落或提取待测菌株基因组DNA作为PCR扩增模板，采用根据权利要求I所述的引物进行PCR扩增； (2)对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为20Ul反应体系，包括10XPCR 缓冲液 2iiL，dNTP(各 2. 5mM)liiL，引物(IOuM)各 I y L，Taq 酶 1U，待测菌株基因组DNA IOng,补ddH20至反应总体积为20 u L。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法挑取待测菌株菌落作为PCR扩增模板，PCR扩增的条件为94°C下变性5分钟；94°C下变性30秒，58°C下退火30秒，72°C下延伸I分钟，30-35个循环；72°C延伸10分钟。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法提取待测菌株基因组DNA作为PCR扩增模板，PCR扩增的条件为94°C下变性3分钟；94°C下变性30秒，58°C下退火30秒，72°C下延伸I分钟，30-35个循环；72°C延伸10分钟。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶的浓度为0.8-2% (g/mL)。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳的电压为 4_6v/cm0
8.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述水稻白叶枯病菌菌株⑶414的琼脂糖凝胶电泳特异性条带出现在985bp处。
9.一种用于检测水稻白叶枯病菌菌株GD414的试剂盒，该试剂盒包含根据权利要求I所述的引物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Taq酶、dNTP和10XPCR缓冲液。
全文摘要
本发明提供一种用于检测水稻白叶枯病菌菌株的引物、方法以及试剂盒，该引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO4，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO3。该方法包括以下步骤(1)挑取待测菌株菌落或提取待测菌株基因组DNA作为PCR扩增模板，采用上述引物进行PCR扩增；(2)对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。该试剂盒包含上述引物。利用所述引物、方法以及试剂盒能够准确、简便、迅速地将GD414与其它白叶枯病菌菌株区分开来，从而为水稻种植品种的选择提供必要的指导。
文档编号C12N15/11GK102618628SQ20111003541
公开日2012年8月1日 申请日期2011年2月1日 优先权日2011年2月1日
发明者何晨阳, 吴茂森, 李波, 陈华民 申请人:中国农业科学院植物保护研究所