专利名称：口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的its引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的特异性引物及其应用。
背景技术：
扁平苔藓(lichen planus, LP)是一种伴有慢性浅表性炎症的皮肤黏膜角化异常性疾病，其病因复杂，至今尚不明确，并且病程长，有一定的癌变率(0.4 5%)，对患者造成很大的困扰。口腔扁平苔藓(OLP)的典型病理表现为上皮过度不全角化、基底层液化变性以及固有层有密集的淋巴细胞呈带状浸润。在口腔扁平苔藓的病因学的研究中，念珠菌与扁平苔藓的关系很早就得到国内外学者的关注，但至今尚不能给念珠菌是共生菌还是始动致病菌下结论。对口腔扁平苔藓的念珠菌进行明确的研究，从而有效地预防和治疗口腔粘膜病，首先需要准确的菌种鉴定分类的方法，特别是菌株间关系的分析判断。传统的表型分型虽具有一定的研究价值，但存在鉴别能力弱、重复性差、不稳定等局限性。随着现代生物分子技术的快速发展，从基因水平对念珠菌进行分型已成为可能和必然。基因分型的目的在于追踪口腔扁平苔藓中念珠菌的感染是来自患者自身、还是外源性的感染；明确是否存在特定菌株与扁平苔藓之间的相关性；了解念珠菌的感染除了与宿主全身及局部易感因素有关外，其本身的遗传型是否与感染有关，是否存在易感菌株或易感基因，从而探求口腔扁平苔藓的发病和进展机理。ITS 指核糖体 DNA(rDNA)的内转录间隔区(internal transcribedspacer region, ITS)。念珠菌的rDNA是一个串联排列的重复序列，包括18S、5. 8S和26S。而分隔这些基因亚单位的是ITS，称为非编码区。ITS1-ITS2部分进化较快，具有种间特异性和种内保守性，可以将菌株鉴定到种或亚种。
发明内容
本发明目的是基于PCR ITS1-ITS2基因分型方法，提供一种用于扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的ITS引物及其应用。本发明采用的技术方案是用于扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的ITS引物，其特征在于所述引物为IT S-I :5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3‘ITS-2 :5， -GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3，。本发明还涉及所述的引物在扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列中的应用，使用本发明引物扩增出来的特征序列，可进一步作为基因分型的研究对象。具体的，所述应用为以口腔扁平苔藓病人含漱液DNA为模板，以ITS-l、ITS-2为引物进行PCR扩增，得到口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列，可根据所得到的特征序列，进一步对待测样品进行基因分型。
根据扩增出的特征序列，可判断其是否属于II型、IIIa型或Inb型中的一种。各基因型特征序列如下II 型5' -TGGAAGTAAAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACA GTATTCTTTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTT GGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTG AATTAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'；IIIa 型5‘ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTG ATTTGCTTAATTGCACCACATGTGTTTTTCTTTGAAACAAACTTGCTTTGGCGGTGGGCCCAGCCTGCCGCCAGAGG TCTAAACTTACAACCAATTTTTTATCAACTTGTCACACCAGATTATTACTTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGAT CTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCCA-3‘；IIIb 型5' -TGGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGAC TATTAGTAATAATCTGGTGTGACAAGTTGATAAAAAATTGGTTGTAAGTTTAGACCTCTGGCGGCAGGCTGGGCCCA CCGCCAAAGCAAGTTTGTTTCAAAGAAAAACACATGTGGTGCAATTAAGCAAATCAGTAATGATCCTTCCGCAGGTT CACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCCA-3‘。若通过基因诊断确定基因型为上述之一，采用特定药物针对性干预白念的局部治疗，可缩短疗程至1周左右(通常一般疗程为2 3周)，为临床诊断提供了基础。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了用于扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的ITS引物，为口腔扁平苔藓白色念珠菌基因分型提供了基础，可真正从基因水平来为临床上制定及时有效的防治措施提供可靠依据，以及为念珠菌分子流行病学的深入研究奠定基础。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 1材料与方法1. 1研究对象病例组白色念珠菌分离株来源于2010. 2. 16 2010. 6. 1就诊于浙江大学第二附属医院口腔科及黏膜病专科并确诊为OLP的患者。OLP患者的诊断依据其典型的临床表现以及实验室检查确诊，主要的病损表现为大多左右对称，由粟粒大小的白色或灰白色丘疹组成的线条构成网状、环状、树枝状、斑块状病损，病变区域与正常粘膜之间无清晰的界限， 白色线条间及四周可为正常粘膜或有充血、糜烂，甚或溃疡。健康对照组均无口腔粘膜疾病，无任何口腔粘膜病的临床症状、体征及病史。研究对象的排除条件为①全口义齿配戴者；②长期或近期(3月内)使用广谱抗菌药物者；③近期(3月内)使用抗真菌药物者；④长期使用肾上腺皮质激素或其他免疫抑制剂者；⑤患有糖尿病、甲状腺功能低下、免疫缺陷等系统性疾病者。本实验所有参加对象均签署知情同意书。1. 2实验设备1.2. 1隔水式恒温培养箱(GNP-9050型，上海，中国)
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1.2.2API 20C AUX 念珠菌鉴定系统(Biomerieux，France)1. 2. 3 冰箱(-4°C，-20"C ) (SIEMENS,中国)1. 2. 4 移液枪(Gilson，France)1. 2. 5 紫外分光光度计(Parmacia biotech, USA)1. 2. 6PCR 仪(BIOMETRA，GERMANY)1. 2. 7 紫外成像仪(KAISER，GERMANY)1. 3实验试剂1. 3. 1真菌基因组DNA提取试剂盒(biof lux，China)1. 3. 2Primer ITS-I (5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，)Primer ITS-2 :(5， -GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3，)(Invitrogen, China)1.3. 3Primer STAR HS DNA Polymerase (TaKaRa, China)1.3.4100bp DNA ladder Marker(TaKaRa，China)1. 3. 5Taq 酶、dNTP Mixture、10*PCR Buffer, MgCl2 (TaKaRa, China)1. 3. 6PBS液(吉诺生物医药技术有限公司，中国)1. 3. 7沙保劳氏琼脂(杭州天和，中国)1. 3. 8Agrarose B, Low EEO琼脂糖(BBI，生工生物工程(上海)有限公司供应)1. 3. 9Red-gel (BI0TIUM, USA)1. 3. 10 无菌棉签(3M，USA)2实验步骤2. 1标本采集2. 1. 1健康对照组采用含漱浓缩法采集菌株，即嘱健康志愿者用PBS液含漱口腔 Imin，收集含漱液。2. 1. 2非糜烂组和糜烂组采用无菌棉捻拭子法，即用生理盐水湿润的无菌棉捻反复涂擦口腔粘膜扁平苔藓病变处。2. 2白色念珠菌菌株分离及纯化3. 2. 1健康对照组收集的含漱液立即送于实验室，用4000r/min离心5min，取沉淀 Iml均勻涂布于沙保劳氏琼脂平板上，37°C培养M 48h，待菌落出现后.挑取典型菌落形接种于沙保劳氏琼脂平板。反复3次，以达到分离纯化的目的。3. 2. 2从非糜烂组和糜烂组将收集的棉捻涂布于沙保劳氏琼脂平板上，37°C培养 24 48h，待菌落出现后.挑取典型菌落形接种于沙保劳氏琼脂平板，反复3次，以达到分离纯化的目的。2. 3白色念珠菌的鉴定及保存分离株在沙堡葡萄糖琼脂(SDA)上生长4 后，菌落形态呈乳白色奶酪状圆形；用改良革兰染色法染色后，光镜下呈革兰阳性、细胞体积较大、菌体为圆形或卵圆形职层环状结构；在米粉吐温琼脂培养基上37°C孵育4 他后可形成芽管；在SDA上45°C孵育48h，仍然生长良好；应用API 20C AUX念珠菌鉴定系统(购自法国BioMerieUX S. A.公司)进行鉴定的读数均符合BioMerieux提供的数据库中的白色念珠菌读数。最后菌株保存于-20°C 冰箱中。
2.4 白色念珠菌 DNA 的提取(根据 Biospin Fungus Genomic DNAExtraction Kit 说明)2. 4. IBiospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit使用前准备向Wash Buffer 中加入37. 8ml乙醇(无水)并混合均勻；向E BindingBuffer中加入^ml乙醇(无水) 并混合均勻。2. 4. 2DNA提取操作步骤2. 4. 2. 1保存菌种接种于沙保罗固体培养基中，在37°C条件下培养4 活化；2. 4. 2. 2取活化的真菌组织，在冰浴中将真菌组织研磨粉碎；2. 4. 2. 3取不多于50mg磨碎的真菌组织，放入1. 5ml微量离心管中；2. 4. 2. 4 加 400ul LE Buffer,并混合均勻；2. 4. 2. 5于65°C环境中温浴15 30mins (温浴过程中可间或振荡离心管2-3次)， 然后移出；2. 4. 2. 6加入130ul DABuffer，混合均勻后于冰浴中放置5mins ；2.4.2.714，000咜离心311^118;2. 4. 2. 8上清液转移到一个新的1. 5ml的离心管；2. 4. 2. 9 加 750ul 的 E Binding Buffer,并混合均勻；2. 4. 2. 10将混合液转移至spin column。6，000*g离心lmin，并弃去接液管中液体。由于混合液体积大于750ul，分2次离心过柱；2. 4. 2. 11 向 spin column 中加入 500ul 的 G Binding Buffer。10，000 离心 30s，并弃去接液管中液体；2. 4. 2. 12 向 spin column 中加入 600ul 的 Wash Buffer。10，000*g 离心 30s,并弃去接液管中液体；2. 4. 2. 13 重复步骤 12 一次；2. 4. 2. 14 再次将 Spin column 10，000*g 离心 lmin,并将 Spin column 转移至一个新的1. 5ml离心管；2. 4. 2. 15 向 Spin column 中加入 IOOul 至 200ul Elution Buffer,并于室温温育 Imin ；2. 4. 2. 16 于 12，000*g 离心 lmin,并弃去 Spin column。1. 5ml 离心管中液体含有 DNA，于-20°C冰箱保存。2. 5紫外线分光光度计DNA吸光度测定2. 5. 1用双蒸水稀释待测DNA50倍；2. 5. 2以双蒸水作对照，在波长^Onm处，将紫外分光光度计读数调到零；2. 5. 3将稀释DNA加入到厚度为Icm的比色杯中，测定DNA在^Onm处的光吸收值；2. 5. 4DNA 浓度(μ g/mL) = (A260nm/0. 02) X 稀释倍数。2. 6PCR ITS1-ITS2区域DNA碱基序列测定2. 6. IPCR 扩增 ITS1-ITS2 区域PCR 反应体系总体积为 50ul，包括 10*PCR Buffer 5ul,200um dNTP, 25mM MgCl2,高保真 Taq 酶 2U，IOOng DNA 模板，引物 ITSl 和 ITS2 各 2ul，ITSl (5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，)，ITS2 (5，-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3，)。在 PCR扩增仪中，按一下步骤进行反应95°C变性30s ；50°C退火30s ；72°C延伸30s，40个循环，而后 72°C延伸lOmin。PCR产物在2% (w/v)琼脂糖TAE凝胶中电泳，以IOObp梯度的Marker为 DNA分子量标记电泳结果在紫外灯下观察并照相记录。
2. 6. 2DNA碱基序列测定ITS1-ITS2区域PCR扩增产物进行纯化及DNA碱基序列测定(TaKaRa宝生物工程有限公司，大连)。3测定结果及处理方法经鉴定确认有148例患者口腔扁平苔藓白色念珠菌基因型为II型、IIIa型或 IIIb型之一，均按照下述方式进行治疗用药维生素A油丸的油剂25000单位/粒，氟康唑胶囊的粉剂50mg/粒，各取1 粒混合，局部涂布于每2cm2的口内扁平苔藓病变处；用药方式qn (每晚一次)用药一周；临床治疗结果总病例数为148例，治愈117例，显效134例，治愈率为79. 05%, 显效率为90. 54%。传统药物治疗的显效时间为2 3周，而经本发明确认基因型后采取针对性治疗方法，显效时间缩短为1周，能使疗程明显缩短，治疗速度提高。说明本发明可真正从基因水平来为临床上制定及时有效的防治措施提供可靠依据。
权利要求
1.用于扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的ITS引物，其特征在于所述引物为 IT S-I :5’ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3‘ITS-2 :5’ -GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’。
2.如权利要求1所述的引物在扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述引用为以口腔扁平苔藓病人含漱液DNA 为模板，以ITS-1、ITS-2为引物进行PCR扩增，得到口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列。
全文摘要
本发明提供了用于扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的ITS引物，其特征在于所述引物为IT S-15′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′ITS-25′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了用于扩增口腔扁平苔藓白色念珠菌特征序列的ITS引物，为口腔扁平苔藓白色念珠菌基因分型提供了基础，可真正从基因水平来为临床上制定及时有效的防治措施提供可靠依据，以及为念珠菌分子流行病学的深入研究奠定基础。
文档编号C12R1/725GK102229929SQ20111013329
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月23日 优先权日2011年5月23日
发明者何虹, 杨海萍, 范艳, 董研, 赵丹萍, 黄剑奇 申请人:浙江大学