专利名称：悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制造兽用狂犬灭活疫苗的方法，具体来讲，涉及悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺。
背景技术：
中国狂犬病病人约93%由家犬引起，6%由猫引起，另外还有为数不多的由猪和老鼠引起，因此实现兽用狂犬灭活疫苗的国产化和家养动物定期注射狂犬灭活疫苗是我国控制与消灭狂犬病的重要途径。中国目前兽用狂犬灭活疫苗的生产使用传统转瓶工艺，工艺繁琐、抗原含量低，不能满足质量需求，目前市场还没有供应，所有兽用狂犬灭活疫苗完全依赖进口，价格高、费用大，农村和经济落后地区难以推广使用，不利于动物狂犬病的预防与控制，所以研发安全、高效的兽用狂犬灭活疫苗，尽早实现兽用狂犬灭活疫苗的国产化， 降低疫苗成本，才能控制和根除狂犬病。目前，中国国内BHK21-C13细胞生产兽用狂犬疫苗仍使用传统的转瓶培养工艺， 批量小、效率低、劳动强度大、占用场地多，即将狂犬病毒株(Flury毒株等)接种单层生长的BHK21-C13细胞，维持培养4 5日，一次性收获、冻融，制备成疫苗。因每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，而且操作劳动强度大，导致中国国产狂犬疫苗批间差大，隐性污染引起高内毒素等缺点。反应器悬浮培养BHK21-C13细胞生产狂犬病毒工艺是解决上述问题的一个途径， 但是目前还没有利用BHK21-C13细胞悬浮工艺制造兽用狂犬灭活疫苗的成熟方法，具体的工艺条件有待优化，以达到生产优质兽用狂犬灭活疫苗的目的。
发明内容
本发明的目的就是提供一种悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，以满足规模化生产优质兽用狂犬灭活疫苗的目的。本发明提供的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，利用细胞悬浮工艺培养狂犬病毒，将收获的狂犬病毒液灭活纯化后制备兽用灭活狂犬疫苗。其中，所述细胞通过以下培养方法而制得反应器按照0. 2 0. 5 X IO6细胞/ml接种BHK21-C13细胞，设定细胞培养温度36. 5士0. 5°C, pH 7. 20士0. 1，D0(dissolved oxygen,即溶氧):20% 60%，转速60 IlOrpm;利用BHK21-C13细胞悬浮工艺培养狂犬病毒的方法为使所述反应器内的BHK21-C13细胞培养密度大于2X IO6细胞/ml，更换培养液以终培养体积的 0. 5 1. 0%接入狂犬病毒生产种毒进行培养。设定狂犬病毒培养温度34. 0士 1°C，pH 7. 40-7. 60，DO :20% 60%，转速60 llOrpm，累计培养 96 120h，收获病毒液，-20°C 保存备用，每0. 03ml中病毒含量> 105 5。较佳地，反应器接种的0. 2 0. 5X IO6细胞/ml的BHK21-C13悬浮细胞通过以下方法获得从液氮中取出一支冻存的BHK21-C13悬浮细胞株，贴壁培养1-3代，将贴壁培养 BHK21-C13细胞消化，更换悬浮培养基，使接种密度在0. 2 0. 5X IO6细胞/ml，悬浮培养1-3代，扩增至反应器所需体积和密度。较佳地，所述狂犬病毒生产种毒利用BHK21-C13细胞悬浮培养狂犬贴壁生产种毒并连续传1 3代而得。具体地讲，取长势良好的悬浮BHK21-C13细胞，更换培养液以终培养体积的 0. 5-1%接入狂犬贴壁生产种毒，设定病毒培养的pH值为7. 40-7. 60，DO :20% 60%，转速60 llOrpm，温度34.0±1°C ；累计悬浮培养96_120h，待细胞密度< IX IO6细胞/ml 时收获病毒液，取样检测LD5tl，连续传1-3代做为生产种毒，_20°C保存备用，每0. 03ml中病
毒含量彡IO5 50较佳地，所述狂犬种毒为Flury-LEP毒株。较佳地，灭活纯化狂犬病毒液包括澄清、超滤浓缩、灭活、纯化和除菌步骤。所述超滤浓缩可以通过750K的中空纤维超滤系统进行。所述灭活纯化的方法为按病毒液总量(总体积)的1/4000加入β-丙内酯，混合均勻；用kpharose 4FF柱层析系统纯化，用0. 2um的除菌滤器过滤。较佳地，该方法中用到的培养基为低血清培养基或无血清培养基。利用本发明提供的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，作为狂犬病毒宿主细胞的BHK21-C13细胞悬浮培养非常成功，培养体积已达1000L ；细胞密度达4_8X IO6 细胞/ml。本发明能够实现病毒大量增殖，大大提高病毒滴度与抗原产量，实现工艺自动化， 提高疫苗的质量。解决了传统转瓶培养BHK21-C13细胞生产狂犬病毒产量和滴度都非常低，疫苗效力低，免疫剂量大等技术难题。本发明不仅能提高BHK21-C13细胞密度，自动监控细胞生长或病毒繁殖的最适生化条件，提高病毒滴度，而且工艺规模放大相对容易，疫苗质量稳定、批间差小。该发明将改变目前国产兽用狂犬疫苗价廉质低的形象。
图1为本发明的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺的技术流程示意图。
具体实施例方式如图1所示，主要技术流程包括以下6个步骤1、实验室摇瓶细胞培养，2、5L、50L、 500L反应器BHK21-C13细胞悬浮培养，3、生产规模狂犬病毒培养，5、浓缩、灭活、纯化，6分
装、冻干。实施例一实验室摇瓶培养BHK21-C13细胞1、种细胞复苏从液氮中取出一支冻存的BHK21-C13悬浮细胞株，37°C快速融化，IOOOrpm离心5 分钟。弃上清液，加入适量MEM营养液(含10%新生牛血清)重悬，转至75cm2细胞培养瓶中补MEM营养液液至30ml，37°C静置贴壁培养。2、细胞传代细胞培养48-72小时后弃去营养液，加入IOml消化液(0. 02% EDTA-0. 25%胰蛋白酶溶液)，消化约2分钟后，弃去消化液，静置3-5分钟，补加MEM营养液90ml，分装至3 个新的培养瓶中，每瓶装量约30ml，37°C静置培养。
3、细胞摇瓶培养细胞贴壁培养48-72小时后弃去营养液，加入IOml消化液，(0. 02% EDTA-0. 25% 胰蛋白酶溶液)，消化约2分钟后，弃去消化液，静置3-5分钟，加入约IOOml悬浮营养液，调节接种密度在0. 2-0. 5 X IO6细胞/ml，将细胞液转移至250ml或500ml摇瓶中，将摇瓶放在 37°C摇床中，80-120rpm培养。培养4 后取样计数，若细胞密度彡2. OX IO6细胞/ml时进行细胞传代，否则继续培养。取需要传代的细胞，加入悬浮营养液约900ml，将细胞液稀释至0. 2-0. 5X IO6细胞/ml，将稀释好的细胞液分装至8_10个摇瓶中悬浮培养1_3代，扩增至反应器所需体积和密度。实施例二 5L及生产规模反应器BHK21-C13细胞悬浮培养1、5L反应器BHK21-C13细胞悬浮培养将培养好的摇瓶细胞(细胞密度彡？^父^^细胞/！^，活率大于卯1^^。。-^^。!^ 混合在专用接种瓶内，取样计数、无菌检验。将接种瓶内的细胞转移至5L反应器中，加入悬浮营养液约4000ml，稀释至0. 2-0. 5X IO6细胞/ml，设定细胞培养温度36. 5士0. 5°C，pH 7. 20士0. 1，DO 20% -60%，转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在 60-1 IOrpm0细胞培养4 后取样计数，当细胞密度> 2. OX IO6细胞/ml时将细胞液转至 50L反应器内培养，否则继续培养至所需细胞密度。2、50L反应器BHK21-C13细胞悬浮培养加入悬浮营养液约45L，将细胞液稀释至0. 2-0. 5 X IO6细胞/ml，设定细胞培养温度36. 5 士 0. 5°C、pH :7. 20 士 0. 1、DO :20% -60%、转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在110-140rpm。细胞培养4 后取样计数，当细胞密度> 2. OX IO6细胞/ml时将细胞液转至500L反应器内培养，否则继续培养至所需细胞密度。3、500L反应器BHK21-C13细胞悬浮培养加入悬浮营养液约450L，将细胞液稀释至0. 2-0. 5X IO6细胞/ml，设定细胞培养温度36. 5士0. 5°C、pH 7. 20士0. 1、DO 20% -60%、转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在110-140rpm。细胞培养4 后取样计数，当细胞密度> 2. OX IO6 细胞/ml时进行病毒培养，否则继续培养至所需细胞密度。表一 5L反应器细胞培养的密度和活率
权利要求
1.悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，该方法利用悬浮培养的高密度细胞，接种狂犬病毒，将收获的狂犬病毒液灭活纯化后制备兽用悬浮狂犬灭活疫苗。其特征在于，所述高密度悬浮细胞通过以下培养方法而制得反应器按照0. 2 0. 5 X IO6细胞/ml接种 BHK21-C13 细胞，设定细胞培养温度:36. 5士0. 5°C，pH :7. 20士0. 1，D0:20% 60%，转速60 IlOrpm ；利用BHK21-C13细胞悬浮工艺培养狂犬病毒的方法为使所述反应器内的BHK21-C13细胞培养密度大于2X IO6细胞/ml，更换培养液以终培养体积的0. 5 1. 0% 接入狂犬病毒生产种毒进行培养，设定狂犬病毒培养温度34. 0士 1°C，pH 7. 40-7. 60, DO 20% 60%，转速60 llOrpm，累计培养96 120h，收获病毒液，_20°C保存备用，每 0. 03ml中病毒含量> IO5 50
2.根据权利要求1所述的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，其特征在于，反应器接种的0. 2 0. 5X IO6细胞/ml的BHK21-C13悬浮细胞通过以下方法获得从液氮中取出一支冻存的BHK21-C13悬浮细胞株，贴壁培养1-3代，将贴壁培养BHK21-C13细胞消化，更换悬浮培养基，使接种密度在0. 2 0. 5 X IO6细胞/ml，悬浮培养1_3代，扩增至反应器所需体积和密度。
3.根据权利要求1所述的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，其特征在于，所述狂犬种毒为Flury-LEP毒株。
4.根据权利要求1所述的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，其特征在于，所述狂犬病毒生产种毒利用BHK21-C13细胞悬浮培养狂犬贴壁生产种毒并连续传1 3代而得。
5.根据权利要求4所述的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，其特征在于，所述狂犬病毒生产种毒的制备方法为取长势良好的悬浮BHK21-C13细胞，更换培养液以终培养体积的0. 5-1 %接入狂犬贴壁生产种毒，设定病毒培养的pH值为7. 40-7. 60， DO :20% 60%，转速60 llOrpm，温度34. O士 1°C ；累计悬浮培养96_120h，待细胞密度 < IXlO6细胞/ml时收获病毒液，取样检测LD5tl，连续传1_3代做为生产种毒，_20°C保存备用，每0. 03ml中病毒含量彡IO5 50
6.根据权利要求1所述的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，其特征在于，灭活纯化狂犬病毒液包括澄清、超滤浓缩、灭活、纯化和除菌步骤。
7.根据权利要求6所述的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，其特征在于，所述超滤浓缩通过750K的中空纤维超滤系统进行。
8.根据权利要求6所述的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，其特征在于，所述灭活纯化的方法为按病毒液总量的1/4000加入β-丙内酯，混合均勻；用 Sepharose 4FF柱层析系统纯化，用0. 2um的除菌滤器过滤。
9.根据权利要求1所述的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，其特征在于，该方法中用到的培养基为低血清培养基或无血清培养基。
全文摘要
本发明涉及一种制造兽用狂犬灭活疫苗的新型工艺，具体为，悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺。该方法的核心是利用生物反应器大规模悬浮培养BHK21-C13细胞并接种狂犬种毒，通过流加、灌流技术使狂犬病毒大量繁殖，从而获得高浓度及高滴度的狂犬抗原，经浓缩灭活纯化后制备兽用狂犬灭活疫苗，克服了目前工艺繁琐、抗原含量低，效力低，剂量大、批间差大等技术难题。
文档编号C12N7/00GK102228686SQ20111018212
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者刘国英, 薛清, 谯晓燕, 赵丽霞, 郝鹏 申请人:金宇保灵生物药品有限公司