专利名称：一种对重金属铜高度敏感的生物传感器的制备方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过分子生物学手段，利用代谢工程改造的细菌菌株，具体涉及一种对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法及其产品。
背景技术：
铜是动植物所必需的微量元素，人体缺铜会造成贫血、腹泻等疾病，但过量的铜对人和动、植物也可造成危害。研究发现过量的重金属铜对于所有的生命体都是有毒的，人体内铜的过量沉积参与了很多疾病的发生和发展，铜可蓄积于人体重要器官，如肝、肾、脑等， 特别是某些患有染色体隐性疾病的人，由于胆汁排泄铜的功能紊乱，铜蓄积于肝，引起肝脏损坏，出现慢性、活动性肝炎症状，如印度儿童肝硬化、Tyrolean婴儿慢性间质性肝炎和 Wilson病，当铜蓄积于脑部，可引起神经组织病变，出现小脑运动失常甚至出现帕金森综合症或阿尔茨海默病。当铜沉积在近侧肾小管时，则可引起氨基酸尿、糖尿、蛋白尿、磷酸盐尿和尿酸尿。当铜沉积在眼角膜周围时，在后弹力层上出现铁锈样环，影响眼睛的正常功能。 研究显示铜对原核细胞作用靶点主要是一些具有重要功能的铁硫蛋白的铁硫中心。随着工农业的发展，很多含有铜离子的污染物排放入江河湖泊中，污染土壤、水源甚至是日常食用的粮食蔬菜，其中在金属矿山开采、冶金、金属加工、机械制造、有机合成及其它工业所产生的废水中大多含有铜，其中以金属加工、电镀工厂所排废水中含铜最高，每升废水含铜几十至几百毫克。水体中含铜量达0.01mg/L时对水体自净有明显的抑制作用； 超过:3mg/L，会产生异味；超过15mg/L，就无法饮用。若用含铜废水灌溉农田，铜在土壤和农作物中积累，会对农作物，特别是对水稻和大麦生长不利，并会污染粮食。还有铜盐的广泛使用，如常见的波尔多液、硫酸铜、氧化铜、王铜、三氯化铜等作为农药会污染蔬菜。人们过多的暴露于高铜的环境以及高铜饮食都是很强的致病因素，最近研究还显示铜对于男性生殖具有不利影响，因此对环境以及食品中铜离子检测已不容忽视。现有的对铜的分析检测方法主要有极谱法、原子吸收分光光度法和电感耦合法，但这些方法，往往存在操作繁琐， 需要专用的仪器及实验室配备等弊端。利用模式生物对特定化学物质反应的生物检测技术克服了如上不足，因此有必要发展一种快速、特异、敏感的生物传感器来检测环境中铜离子的含量。生物检测技术的基本原理即是利用模式生物对特定化学物质的分子反应机理。对于生物检测技术而言需要三种必需的元件针对特定或具有相似性质的化学物质的感应器；由感应器控制的启动子；受此启动子控制的报告基因。在设计生物检测技术时，由于细菌具有在环境中大量存在、生长快速、低成本及易维护等优点而受到研究人员普遍亲睐。在过去的研究中利用生物检测法来检测环境中的特定污染物已经引起了极大的关注，至今已经研发了一系列针对特定有机物和无机化合物的生物传感器，如重金属、甲苯及其衍生物寸。现在对铜离子测定的生物检测技术也有所研发，其中比较清楚大肠杆菌针对铜离子的反应机理，大肠杆菌具有精细的调控系统使得细胞内铜离子保持在较低的水平，CopA 是一类P-型ATPase，作用是将细胞质内的铜离子向核周质泵出；CueO是一类氧化酶，作用是在核周质内将Cu+氧化为Cu2+，防止核周质内铜离子进入细胞质(铜离子只有一价形式可以穿过细胞膜)；当大肠杆菌处在低浓度的铜离子环境中，CopA和CueO会被大量的诱导表达，其受到CueR调节子的调节。高浓度的铜离子会激活Cus系统，使得铜离子从核周质向外环境泵出。这个机理提供了一个很好的检测模式，研究人员尝试利用COpAp::luX和 CueRCopA: LuxCDABE融合报告基因以野生型E. coli作为宿主菌来检测铜离子，这些方法特异性不错，但是敏感性不是很高，更重要的是野生型大肠杆菌长期处于高铜的环境会由于自身的保护机制而产生铜离子耐受，其作为检测铜的宿主菌会造成检测结果的不稳定， 所以必须采用新的方法提高生物学检测方法检测铜离子的敏感度。
发明内容
本发明的目的是通过基因敲除、基因融合技术构建一种对铜离子高度敏感的大肠杆菌生物传感器来快速、灵敏检测铜离子，以解决以野生型大肠杆菌作为宿主菌的生物检测法敏感性不高等问题，并可以克服物理化学等方法存在的操作繁琐、需要专用的仪器及实验室配备等弊端。本发明所述大肠杆菌报告菌株，名称为E. coli WMC-006，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，普通微生物中心，编号CGMCC No. 46M。实现上述目的，本发明的一种对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法的技术方案是包含以下步骤(1)利用条件复制质粒pKD46和pCP20，利用Red重组系统，敲除野生型大肠杆菌 E. coli MC4100 基因组中 copA、cueO 和 cusA 三个基因，构建 AcopA-AcueO-AcusAHS 因突变菌株；(2)利用交叉PCR反应构建含有报告基因gfpmut2与大肠杆菌copA基因启动子 PcopA及转录终止子SoxS相融合的融合报告基因PcopA: :gfpmut2 ；(3)将步骤2所得片段克隆到PMD18-T载体上，构建PcopA: :gfpmut2-T重组载体；(4)测序分析正确的重组载体PcopA: :gfpmut2-T经双酶切切下目的条带连接到 pET28a载体上，构建融合报告载体PcopA: gfpmut2-pET28a ；(5)将步骤(4)所得融合报告载体转入步骤1构建的Δ copA-Δ cueO-Δ cusA三基因突变菌株。通过上述步骤可以方便地构建一种对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感
ο上述制备方法的进一步设置是步骤(1)中Δ copA-Δ cueO-Δ cusA三基因突变菌株的制备依次包括有如下步骤1、引物信息及合成；2、单突变菌AcopA的制备；3、双突变菌Δ copA-AcueO的制备；4、三突变菌Δ copA-Δ cueO-Δ cusA的制备；其中上述步骤2中的单突变菌AcopA的制备具体是一、pKD46/MC4100菌株制备；二、带FRT位点的 cat基因PCR扩增；三、pKD46/MC4100电转感受态细胞的制备；四、电转化cat基因；五、 cat基因的PCR鉴定；六、pCP20的转化；七、cat抗性基因的消除；八、Δ copA单突变菌的纯化；所述的报告基因选用选用编码增强型绿色荧光蛋白的gfpmut2基因，融合报告基因PcopA::gfpmut2的制备依次包括有如下步骤1、引物信息及合成；2、E. coli MC4100细菌基因组DNA的提取；3、PCR扩增PcopA ；4、PCR扩增gfpmut2-soxSCo基因；5、交叉PCR获得融合报告基因PcopA: :gfpmut2 ；6、PCR产物胶回收；融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET a 制备依次包括有如下步骤(一)试剂盒提取质粒pET28a ； (二)pED8a质粒的双酶切及其回收；(三)目的片断与载体的连接反应；(四)将连接好的重组质粒转入DH5 α感受态细胞中；(五)阳性克隆的鉴定。本发明进一步设置中报告基因选用选用编码水母Aequorea Vicroria绿色荧光蛋白(GFP)的GFP基因的优点是(1)易于检测。GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子， 只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别；(2)荧光稳定。GFP对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光照；GFP在ρΗ7-12 范围内也能正常发光；对高温(70°C )、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数都有较强抗性；(3)无毒害。从目前的研究结果来看，GFP对生活的细胞基本无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞仍可连续传代；(4)通用性。表现在GFP的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次是GFP没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光；(5)易于构建载体。由于GFP分子量较小，仅为27 30kD，编码GFP的基因序列也很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。(6)可进行活细胞定时定位观察。对活细胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真实的状态。稳定的GFP蛋白较之细菌性荧光素酶( 0. 1)有更高的量子产量(0. 88)。而且，只需大约IO5 IO6个GFP分子即可检测出荧光信号。在此，我们使用一种由GFPmut2基因编码的GFP蛋白，它比野生型GFP蛋白亮100 多倍。从pGFPmut2质粒(购自Clonetech) DNA中获得含GFPmut2基因的DNA片段，利用交叉PCR技术进行基因融合，将copA启动子序列与gfpmut2基因及转录终止子SoxS序列融合后连接到T载体，经测序正确后切下融合目的基因连接到pET28a载体形成融合报告载体 PcopA: :gfpmut2-pET28a0在此构建中，基因组中cueR基因编码产生的CueR蛋白结合于 copA启动子序列。当存在铜离子时，刺激PcopA: :gfpmut2融合基因的表达，产生GFPmut2 蛋白，产生的GFPmut2蛋白的量或其荧光强度与铜离子呈剂量依赖关系，所以通过测定荧光强度可以反映铜离子的含量。本发明的对铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的技术方案是由野生型大肠杆菌E. coli MC4100缺失copA、cueO和cusA三个基因，并转化入融合报告载体 PcopA: :gfpmut2-pEI^8a，命名为E. coli WMC-006，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC No. 46 ，保藏地点北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间2011年2月28日，分类名称大肠埃希氏菌hcherichina coli。本发明的对铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器解决了野生型大肠杆菌作为宿主菌的生物检测法敏感性不高等问题，可以克服物理化学等方法受到实验条件限制等的弊端，并且特异性好，敏感性高。
图1单基因敲除流程图；图2利用交叉PCR技术进行基因融合示意图；图3融合报告载体PcopA: gfpmut2-pET28a的构建流程图；图^at基因PCR电泳图；图 5copA: :cat/MC4100 菌株 PCR 鉴定电泳图；M :lkb DNA ladder ； 1-2 引物 CopA-No/Co，copA: cat 突变菌与野生型细菌PCR产物大小分别为2044bp、353^p ；3-4 引物CueO-No/Co，cueO: cat突变菌与野生型细菌PCR 产物大小分别为2044bp、2586bp图6单突变菌的PCR鉴定电泳图；M :lkb DNA ladder1-3 引物CopA-No/Co，野生型细菌、copA: :cat突变菌、ACOpA(copA基因已缺失)4-6 引物Cue0-No/Co，野生型细菌、cueO: cat突变菌、AcueO (cueO基因已缺失)7-9 引物CusA-No/Co，野生型细菌、cusA: :cat突变菌、AcusA(cusA基因已缺失)图7双突变菌的PCR鉴定电泳图；M :lkb DNA ladder ； 1-3 Δ copA-Δ cueO 突变菌 CueO-No/Co、CopA-No/Co、 CusA-No/Co 三对引物 PCR 产物；4-6 Δ cusA- Δ cueO 突变菌 CueO-No/Co、CopA-No/Co、 CusA-No/Co 三对引物 PCR 产物；7-9 Δ cusA- Δ copA 突变菌 CueO-No/Co、CusA-No/Co、 CopA-No/Co三对引物PCR产物图8三突变菌的PCR鉴定电泳图；M :lkb DNA ladder1-3 Δ cusA- Δ copA- Δ cueO 突变菌 CueO-No/Co、CopA-No/Co、CusA_No/Co 三对引物PCR产物图9 E. coli MC4100基因组DNA提取电泳鉴定图；M :lkb DNA ladder ； 1-2 基因组 DNA图10 PCR扩增PcopA基因电泳图；M :lkb DNA ladder ； 1-2 =PcopA 目的基因条带图 11 PCR 扩增 gfpmut2_soxSCo 基因电泳图；M :lkb DNA ladder ； 1-3 :gfpmut2_soxSCo 目的基因图 12 交叉 PCR 扩增 PcopA: gfpmut2 电泳图；M :lkb DNA ladder ；1 :PcopA基因；2 :gfpmut2_soxSCo 基因 3 :gfpmut2_soxSCo 与 PcopA交叉PCR产物图 13 生物传感器 PcopA: gfpmut2-pET28a/ Δ cusA- Δ copA- Δ cueO 焚光蛋白的诱导及鉴定图；A :PcopA: :gfpmut2_pET28a/AcusA-AcopA-AcueO 被不同浓度0_8，0， 1.0Xl(T8，1.0Xl(T7，1.0Xl(r6，1.0Xl(r5，1.0Xl(r4and LOXl(T3M)的铜离子所诱导后， 收获菌体重悬于PH 8. O的Tris缓冲液中，其中1为pET28a/ACusA-ACOpA-ACue0阴性对照；B =SDS-PAGE全细胞电泳图；C :A中7号标本的发射光谱扫描图；D :A中7号标本的荧光共聚焦成像图。
图14报告菌株E. coli WMC-006与野生型及其他6种突变菌敏感性曲线图；图15报告菌株E. coli WMC-006特异性实验柱状图；图16不同pH条件下荧光强度变化曲线图；图17不同培养基对生物传感器测定的影响柱状图；图18最佳初始菌液浓度的探索实验结果；图19最佳诱导时间的探索及最适检测范围的确定实验结果；图20报告菌株E. coli WMC-006线性范围曲线拟合结果。
具体实施例方式本发明所述对铜离子高敏感的大肠杆菌的构建具体方法如下I、突变菌的制备(一)引物信息及合成基因敲除引物根据http://eCOgene. org/提供基因敲除的引物序列，Primer5. 0 及DNAMAN软件，设计同源重组引物(见表1)，5'端为50bp的cat基因两侧的同源臂(表 1有单下划线的部分)，3'端为20bp的用于扩增氯霉素抗性基因(表1有双下划线的部分)。上游同源臂引物Hl-Pl ；下游同源臂引物H2-P2。基因敲除鉴定弓I 物利用 Harvard Molecular Technology Group & Lipper Center for Computational Genetics N^httpi/Zarep. med. harvard, edu/labgc/adnan/ projects/EcoliKO-primers/EcoliKOprimers. htm提供的一对跨越待敲除基因的外侧设计敲除鉴定引物(见表幻。鉴定copA基因敲除引物设计上游引物CopA-No位于copA基因上游499bp，下游引物CopA-Co位于copA基因下游501bP ；鉴定cueO基因敲除引物设计上游引物位于cueO基因上游500bp，下游引物位于cueO基因下游502bp ；鉴定cusA基因敲除引物设计上游引物位于cusA基因上游496bp，下游引物位于cusA基因下游498bp。引物由大连宝生物公司合成。用无菌去离子水将引物溶解，配成浓度为ΙΟμπιοΙ/ L0表1基因敲除引物
权利要求
1.一种对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法，其特征在于包含以下步骤(1)利用条件复制质粒PKD46和PCP20，利用Red重组系统，敲除野生型大肠杆菌 E. coli MC4100 基因组中 copA、cueO 和 cusA 三个基因，构建 AcopA-AcueO-AcusAHS 因突变菌株；(2)利用交叉PCR技术构建含有报告基因gfpmut2与大肠杆菌copA基因启动子PcopA 及转录终止子SoxS相融合的融合报告基因PcopA: :gfpmut2 ；(3)将步骤2所得片段克隆到pMDIS-T载体上，构建PcopA: gfpmut2-T重组载体；(4)测序分析正确的重组载体PcopA gfpmut2-T经双酶切切下目的条带连接到 pET28a载体上，构建融合报告载体PcopA: gfpmut2-pET28a ；(5)将步骤(4)所得融合报告载体转入步骤1构建的ΔcopA-AcueO-AcusA三基因突变菌株。
2.根据权利要求1所述对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法，其特征在于步骤(1)中Δ copA-AcueO-AcusA三基因突变菌株的制备依次包括有如下步骤1、引物信息及合成；2、单突变菌AcopA的制备；3、双突变菌AcopA-AcueO的制备；4、 三突变菌Δ copA-AcueO-AcusA的制备；其中上述步骤2中的单突变菌AcopA的制备具体是一、PKD46/MC4100菌株制备；二、带FRT位点的cat基因PCR扩增；三、pKD46/MC4100 电转感受态细胞的制备；四、电转化cat基因 ’五、cat基因的PCR鉴定；六、pCP20的转化； 七、cat抗性基因的消除；八、AcopA单突变菌的纯化。
3.根据权利要求1或2所述对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法，其特征在于所述的报告基因选用选用编码增强型绿色荧光蛋白的gfpmut2基因，融合报告基因PcopA: :gfpmut2的制备依次包括有如下步骤1、引物信息及合成；2、E. coli MC4100细菌基因组DNA的提取；3、PCR扩增PcopA ；4、PCR扩增gfpmut2_soxSCo基因；5、交叉PCR获得融合报告基因PcopA: :gfpmut2 ；6、PCR产物胶回收。
4.根据权利要求1或2所述对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法，其特征在于融合报告载体PcopA: gfpmut2-pET28a制备依次包括有如下步骤(一) 试剂盒提取质粒pET28a ； (二)pET28a质粒的双酶切及其回收；(三)目的片断与载体的连接反应；(四)将连接好的重组质粒转入DH5 α感受态细胞中；(五)阳性克隆的鉴定。
5.根据权利要求3所述对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法，其特征在于融合报告载体PCOpA::gfpmUt2-pET28a制备依次包括有如下步骤(一)试剂盒提取质粒pET28a ； (二)pET a质粒的双酶切及其回收；(三)目的片断与载体的连接反应； (四)将连接好的重组质粒转入DH5 α感受态细胞中；(五)阳性克隆的鉴定。
6.按照上述制备方法得到的对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器，其特征在于由野生型大肠杆菌Ε. coli MC4100缺失copA、cueO和cusA三个基因，并转入融合报告载体 PcopA: gfpmut2-pET28a。
全文摘要
本发明涉及大肠杆菌生物传感器制备方法及其产品，制备方法的技术方案是(1)利用Red重组系统，敲除野生型大肠杆菌E.coli MC4100基因组中copA、cueO和cusA三个基因；(2)利用交叉PCR技术构建融合报告基因PcopA::gfpmut2；(3)将步骤2所得片段克隆到pMD18-T载体上；(4)将载体PcopA::gfpmut2-T经双酶切切下目的条带连接到pET28a载体上；(5)将步骤4所得融合报告载体转化至步骤1的ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三基因突变菌株。上述方案得到产品是由野生型大肠杆菌E.coli MC4100缺失copA、cueO和cusA三个基因，并转化入融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a，本发明产品具有特异、敏感、快速、简便、高效和高性价比等特点，适用于铜离子的野外实时实地监测。
文档编号C12N15/09GK102417901SQ201110259158
公开日2012年4月18日 申请日期2011年8月25日 优先权日2011年8月25日
发明者李 东, 洪旭芬, 王娟娟, 谭国强, 赵建国 申请人:温州医学院