专利名称：低电压瞬时电脉冲构建小球藻生物反应器的方法
技术领域：
本发明涉及一种低电压瞬时电脉冲构建小球藻生物反应器的方法。它是一种条件温和，低成本，便捷的使外源基因安全地进入小球藻细胞的新方法。在生物技术领域可以建立小球藻生物反应器，对于生产高附加值产品，特别是来源紧俏的基因工程产品具有广泛应用前景。
背景技术：
椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)为绿藻门小球藻属单细胞真核藻类，是一种重要的绿色微藻资源。在具有体积小，繁殖迅速，易于培养等特点的同时还含有叶绿素 a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素，能够利用光能进行光合作用，培养成本低廉。小球藻是一种优质的蛋白质资源，被联合国粮食及农业组织(FAO)列为二十一世纪人类的绿色营养源健康食品。小球藻具有真正的细胞核，对于一些需要大量生产而又对原核表达生物有害的物质或表达需要翻译修饰的复杂蛋白，可利用小球藻生物反应器来生产。小球藻不含内毒素，利用转基因技术将小球藻改造成新型高效的生物反应器，对于生产高价值产品，特别是来源紧俏的医药产品具有广泛应用前景。Maruyama认为在高场强及长时间的电脉冲持续期，小球藻细胞可得到高的通透性，吸纳外源DNA的能力较强。Maruyama等以小球藻(C. saccharophila)为受体，采用高压电击法，在600-900V电场强度，400ms脉冲持续时间的条件下，将质粒pBI221导入藻细胞 (Maruyama M et al.，1994)。王逸云等在5000V脉冲电压，50ms脉冲持续时间，脉冲次数为 211次，循环次数为90次的高强度电场力条件下，将质粒pBI121/phyA II转入藻细胞(王逸云，200 。张小宇等在6000-9000V脉冲电压，20-50ms脉冲持续时间，脉冲次数为21°条件下，将兔防御素基因NP-I转入藻细胞，获得了稳定表达外源蛋白质的小球藻生物反应器 (张小宇，2006)。虽然以上报道成功地将外源基因转入小球藻，但是他们的方法均存在着缺点与不足。首先，高强度或长时间持续电脉冲损伤小球藻细胞；其次，实现上述高电压及长时间脉冲刺激等实验条件，必需具有高性能的电转化仪和基因枪等价格昂贵的设备，增加了实验成本。因此，寻找一种比较温和、低成本、便捷的使外源基因安全地转入小球藻细胞的新方
法非常有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种低电压瞬时电脉冲构建小球藻生物反应器的方法。 本发明首先获得了具有高通透性细胞壁的活体小球藻，利用低电压及瞬时电脉冲的条件， 将基因载体及外源基因导入活体小球藻，避免了转化藻体时高强度电压或长时间电脉冲对小球藻的损伤，从而使外源基因平稳地进入小球藻细胞，建立小球藻生物反应器。本发明利用较温和的低电压瞬时电脉冲电击转化法成功地构建了小球藻生物反应器。本发明提供的小球藻生物反应器的构建方法包括的步骤如下
1)取处于对数生长期的小球藻，以5%的接种量接种于Knop液体培养基中，25°C 下静置培养，光照条件3000 40001χ，每4h摇动一次，连续照明，培养2d ；Knop 液体培养基(pH 7. 0)葡萄糖 3g ；酵母粉 3g ；KH2PO4O. 025g ；Ca (NO3)2O. Ig ； MgSO4O. 025g ；KCl 0. 012g ；FeCl3O. OOlg ；dH20 1 L。取上述培养液1ml，离心收集小球藻细胞，重悬于Iml MBBM培养基中，置于光照培养箱中培养，3000 40001x，25°C下静置培养Mh ；MBBM 培养基(pH 7.0) 0. 5g NH4Cl，0.075g MgSO4,0. 17g KH2PO4,0. 075g K2HPO4, 0. 025g CaCl2,0. 025g NaCl，0. 05g 酵母粉，ImL A6 混合液，7. 5g 2-脱氧-D-葡萄糖，3. 75g 葡萄糖，用 dH20定容到 1L。A6混合液0. 28g H3BO3,0. 25g MnSO4 ·7Η20，0· 0222gZnS04 ·7Η20， 0. 0079g CuSO4 · 5Η20，0· 0021g Na2MoO4 · 2H20, IOOmL dH20。离心收集藻细胞，加入含有4% (ff/V)纤维素酶的高渗PBS缓冲液Iml {pH 6. 0， 0. 025mol/L 磷酸缓冲液(由 0. 2mo VLNaH2PO4 ·2Η20 和 0. 2mo 1/LNa2HPO4 · 2Η20 配置而成)， 含有0. 3mol/L山梨醇/甘露醇}重悬细胞，30°C下，80r/min摇床，黑暗酶解4h，进行处理。分别取实验处理前后的小球藻液，离心收集小球藻细胞，重悬于相同体积的低渗溶液(ddH20)中，放置30min，分别计数。结果为处理前细胞数量为3. 0750X IO7个/ml，处理后为2. 0913X IO7个/ml，细胞的崩解数量为9. 8370X IO6个/ml，崩解率达到34. 3%，说明本发明的小球藻细胞具有高通透性。2)取步骤1)处理后的小球藻液30 μ l,8000rpm离心5min，用30 μ 1 Hepes Buffer (lmol/L NaCl,0. Olmol/L KC1,0. Olmol/L CaCl2,0. 02mol/L H印es，0. 2mol/L 甘露醇，0. 2mol/L山梨醇)重悬细胞沉淀，加入2 μ 1(76. 5ng/y 1)携带ble基因的质粒pSPlMS DNA。电击转化小球藻，脉冲电压为500V，脉冲持续时间1. 2ms ；同时做的阴性对照不加质粒 PSP124S DNA。3)电击之后，将藻体于冰上预冷6min，加入Iml高渗Knop培养基(含0. 5mol/L 蔗糖的Knop液体培养基)，25°C下，光照条件3000 40001x温和培养Mh，加至ImL Knop 半固体培养基(额外加入0. 5mol/L蔗糖，Zeocin)中，混合均勻，涂布于Knop固体培养基(额外加入0.5mol/L蔗糖，10yg/mL Zeocin)上，置于25°C培养箱中，光照条件 3000 40001x静置培养。挑取单藻落接种于含有4 μ g/mL Zeocin的Knop液体培养基中，置于25°C培养箱中，光照条件3000 40001x，静置培养。培养物为小球藻生物反应器。对照组没有藻落出现。同时接种于不含kocin的Knop固体培养基上的对照组有藻落出现。本发明克服了已有技术的缺点与不足，利用较温和的低电压瞬时电脉冲电击转化法成功地构建了小球藻生物反应器。首先获得了具有高通透性细胞壁的活体小球藻，利用低电压及瞬时电脉冲的条件，将基因载体及外源基因导入活体小球藻，避免了转化藻体时高强度电压或长时间电脉冲对小球藻的损伤，从而使外源基因平稳地进入小球藻细胞，建立小球藻生物反应器。
图1第3至第10次转接培养的转基因小球藻生长状况。图2质粒pSP124S所载的ble基因。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅为解释性的，决不意味着它以任何方式限制本发明的范围。1)藻种小球藻(Chlorella ellipsoidea)藻种由天津师范大学微生物实验室筛选并保存并可公开出售。2)ble基因载体pSP124S质粒的构建设计引物ρ 1 为 GTATCGATGGCCAAGcTGACCAGcGCCG ；设计引物p2 为 TTGGTCGaCGTCGGTtAGTCC ；以质粒pUT430 (Drocourt et. al.，1990) DNA为模板，以PCR (聚合酶链式反应)的方法扩增 ble 基因，PCR 的条件是95°C变性 5min ；95°C, 40sec, 56°C, 40sec, 72°C, 40sec, 30个循环；72°C延伸lOmin。获得395bp的PCR产物。用内切酶Msc I和Ml I分别酶切处理 PCR 产物和 pSP105 Gtevens et. al.，1996) DNA，以 DNA 连接酶将 ble 基因重组到 pSPlOOTNA 上。并利用内切酶BamH I和Nco I在_173 (相对于转录起始)的位置到翻译起始，插入一个 RBCS2启动子。以内切酶Mel和KpnI双酶切处理以上构建产物获得含有ble基因的1. 2kb 大小的DNA片段；同时以内切酶&icl和KpnI双酶切处理pBluescript SK(Stratagene)质粒DNA。利用DNA连接酶将ble基因重组到质粒pBluescript SK(Stratagene)上。重组质粒命名为？3 1对5，含kocin抗性基因ble，见图2。3)步骤(1)提高小球藻细胞壁通透性取处于对数生长期的小球藻，以5%的接种量接于Knop液体培养基中，25°C下静置培养，光照条件3000 40001x，每4h摇动一次，连续照明，培养2d ；分别取Iml藻液至 1. 5ml离心管中，SOOOrpm离心5min，弃上清液收集藻细胞，设置3组实验①1组实验，于细胞沉淀中加入 Iml MBBM 液体培养基(0. 5g NH4CIjO. 075g MgSO4,0. 17gKH2P04,0 . 0 7 5g K2HPO4,0. 025g CaCl2,0. 025g NaCl，0. 05g 酵母粉，ImL A6 混合液，7. 5g2DG，3. 75g 葡萄糖， 用 dH20定容到 lL，pH 7. 0。A6 混合液0. 28g H3BO3,0. 25gMnS04 ·7Η20，0· 0222g ZnSO4 ·7Η20， 0. 0079g CuSO4 · 5Η20，0· 0021g Na2MoO4 · 2H20, IOOmLdH2O)；② 2 组实验，于细胞沉淀中加入 Iml Knop液体培养基；③3组实验，于细胞沉淀中加入Iml MBBM液体培养基(0. 5g NH4Cl, 0. 075g MgSO4,0. 17g KH2PO4,0. 075gK2HP04,0 . 0 2 5g CaCl2,0. 025g NaCl，0. 05g 酵母粉，ImL A6 混合液，7. 5g 2DG，3. 75g 葡萄糖，用 dH20 定容到 1L，pH 7. 0。A6 混合液0. 28g H3BO3, 0. 25g MnSO4 · 7Η20，0· 0222gZnS04 · 7Η20，0· 0079g CuSO4 · 5H20，0. 0021g Na2MoO4 ‘ 2H20, IOOmL dH20.)。置于光照培养箱中培养，3000 40001x，25°C下静置培养Mh ；8000rpm离心5min，收集藻细胞，①1组实验，加入Iml含有4% (W/V)纤维素酶的高渗 PBS 缓冲液{pH 6. 0,0. 025mol/L 磷酸缓冲液(由 0. 2mol/L NaH2PO4 ·2Η20 和 0. 2mol/ LNa2HPO4 ·2Η20配置而成)，含有0. 3mol/L山梨醇/甘露醇}；②2组实验，加入Iml含有4% (W/V)纤维素酶的 PBS 缓冲液{pH 6. 0,0. 025mol/L 磷酸缓冲液(由 0. 2moVLNaH2PO4 ·2Η20 和0. 2mol/L Na2HPO4 ·2Η20配置而成)，含有0. 3mol/L山梨醇和0. 3mol/L甘露醇}；③3组实验，加入Iml不含纤维素酶的PBS缓冲液{pH 6. 0,0. 025mol/L磷酸缓冲液(由0. 2mol/ L NaH2PO4 · 2H20 和 0. 2mol/L Na2HPO4 · 2H20 配置而成)，含有 0. 3mol/L 山梨醇 / 甘露醇}。 分别混合均勻。置于30°C的恒温振荡器中，转速80r/min，黑暗酶解4h。
分别取上述实验处理前后的小球藻液，离心，8000rpm，5min，收集小球藻细胞，分别重悬于相同体积的高渗溶液(0. 2mol/L甘露醇，0. 2mol/L山梨醇)和低渗溶液(ddH20) 中，静置30min后，分别用血球计数板计数小球藻细胞数量，并以Spss软件统计分析计数结果。见表1、2、3。表11组实验中不同缓冲溶液中酶解前后小球藻细胞数量(X IO7个/ml)
权利要求
1.一种低电压瞬时电脉冲构建小球藻生物反应器的方法，其特征在于包括以下步骤1)取处于对数生长期的小球藻，以5%的接种量接种于Knop液体培养基中，25°C下静置培养，光照条件3000 40001χ，每4h摇动一次，连续照明，培养2d ；取上述培养液，离心收集小球藻细胞，重悬于MBBM培养基中，置于光照培养箱中培养， 3000 40001x，25°C下静置培养Mh ；将培养后的小球藻细胞，加入含有4% (W/V)纤维素酶的PH 6. 0的并含有0. 3mol/L山梨醇/甘露醇高渗PBS缓冲液中重悬细胞，30°C下，80r/ min摇床，黑暗酶解4h，进行处理；2)取步骤1)处理后的小球藻液，8000rpm离心5min，用H印esBuffer重悬细胞沉淀， 加入携带ble基因的质粒pSPlMS DNA，浓度为76. 5ng/ μ 1 ；电击转化小球藻，脉冲电压为 500V，脉冲持续时间1. 2ms ；3)将藻体于冰上预冷6min，加入到含0.5mol/L蔗糖的Knop液体培养基中，25°C下， 光照条件3000 40001x温和培养24h,然后加至含有0. 5mol/L蔗糖，4 μ g/mL Zeocin的 Knop半固体培养基中，混合均勻，涂布于含有0. 5mol/L蔗糖，10 μ g/mL Zeocin的Knop固体培养基上，置于25°C培养箱中，光照条件3000 40001x静置培养10d。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的MBBM培养基组成0.5g NH4Cl, 0. 075g MgSO4,0. 17g KH2PO4,0. 075g K2HPO4,0. 025g CaCl2,0. 025g NaCl，0. 05g 酵母粉， lmLA6 混合液，7. 5g 2DG，3. 75g 葡萄糖，用 dH20 定容到 1L，pH 7. 0 ；A6 混合液0. 28gH3B03, 0. 25g MnSO4 · 7Η20，0· 0222g ZnSO4 · 7H20，0. 0079g CuSO4 · 5H20，0. 002IgNii2MoO4 · 2H20， 100ml ClH2O。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的Knop液体培养基组成每升Knop培养基中含有葡萄糖 3g，酵母粉 3g，KH2PO4O. 025g, Ca(NO3)2O. lg，MgSO4O. 025g, KC10. 012g， FeCl3O. OOlg。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的IfepesBuffer组成lmol/L NaCl, 0. 01mol/L KC1，0. 01mol/L CaCl2,0. 02mol/L Hepes,0. 2mol/L 甘露醇，0. 2mol/L 山梨醇。
全文摘要
本发明涉及一种低电压瞬时电脉冲构建小球藻生物反应器的方法。首先获得了具有高通透性细胞壁的活体小球藻，利用低电压及瞬时电脉冲的条件，将基因载体及外源基因导入活体小球藻，避免了转化藻体时高强度电压或长时间电脉冲对小球藻的损伤，从而使外源基因平稳地进入小球藻细胞，建立小球藻生物反应器。本发明利用较温和的低电压瞬时电脉冲电击转化法成功地构建了小球藻生物反应器，条件温和，低成本，便捷的使外源基因安全地进入小球藻细胞的新方法，对于生产高附加值产品，特别是来源紧俏的基因工程产品具有广泛应用前景。
文档编号C12N1/13GK102329733SQ20111028212
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者刘丽丽, 吴海月 申请人:天津师范大学