专利名称：小球藻生物反应器的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种小球藻生物反应器的构建方法。它是一种条件温和，低成本，便捷的，使外源基因安全地进入小球藻细胞的新方法。在生物技术领域建立小球藻生物反应器， 对于生产高价值产品，特别是来源紧俏的基因工程产品具有广泛的应用前景。
背景技术：
椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)为绿藻门小球藻属真核单细胞绿藻，是一种重要的绿色微藻资源。小球藻是一种理想的蛋白质资源，被联合国粮食及农业组织(FAO) 列为二十一世纪人类的绿色营养源健康食品。小球藻具有原核生物的一些特点体积小、生态分布广、易于培养、生长速度快、应用价值高。小球藻还含有叶绿素，可利用光能进行光合作用，像植物一样自养生长，培养成本低廉。同时，作为真核藻类，它又具有真正的细胞核， 对于一些需要大量生产而又对原核生物生长不利的物质或表达需要翻译修饰的复杂蛋白， 可利用小球藻生物反应器来生产。此外，小球藻不含内毒素，因而利用转基因技术将小球藻改造成新型高效的生物反应器，对于生产高价值产品，特别是来源紧俏的产品具有广泛应用前景。Maruyama认为在高场强及长时间的脉冲持续期，小球藻细胞可得到高的通透性，吸纳外源DNA的能力较强。Maruyama等以小球藻(C. saccharophila)为受体，采用高压电击法，在600-900V电场强度，400ms脉冲持续时间的条件下，将质粒pBI221导入藻细胞， 并检测到了 gus基因的瞬间表达(Maruyama M et al.，1994)。王逸云等在5000V脉冲电压，50ms脉冲持续时间，脉冲次数为211次，循环次数为90次的高强度电场力条件下，将质粒 pBI121/phyAII转入藻细胞(王逸云，2005)。张小宇等在6000-9000V脉冲电压，20_50ms 脉冲持续时间，脉冲次数为21°条件下，将兔防御素基因NP-I转入藻细胞，获得了稳定表达外源蛋白质的小球藻生物反应器(张小宇，2006)。以上报道的方法可以将外源基因转入小球藻，但是这些方法均存在着缺点与不足。首先，高强度或长时间持续脉冲损伤小球藻细胞；其次，实现上述高电压及长时间脉冲刺激等实验条件，必需具备价格昂贵的设备，增加了实验成本和实验难度。因此，寻找一种温和、不需要专门设备的使外源基因安全地转入小球藻细胞的新方法非常有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种新的小球藻生物反应器的构建方法，可以克服现有技术的缺陷。本发明首先获得了具有高通透性细胞壁的活体小球藻，温和地导入基因载体及外源基因，使小球藻表达外源基因，建立小球藻生物反应器。本发明是一种温和不需要专门设备以及安全的构建小球藻生物反应器的方法，利用本生物反应器成功地产出了 gus基因的表达产物。本发明提供的小球藻生物反应器的构建方法包括的步骤1)预培养筛选获得高通透性细胞壁的活体小球藻
取对数生长期的小球藻液体培养物，接种量至SE培养基中25°C静置培养，光照条件3000 40001x，每4h摇动一次，连续照明，培养3天。4000rpm离心，收集小球藻细胞。25°C静置条件下，MBBM液体培养基预培养Mh，30°C条件下，用纤维素酶处理小球藻细胞4h，得到纤维素酶酶解的小球藻细胞培养液。2)小球藻生物反应器构建取步骤1)的小球藻培养液lmL，4000rpm离心5min，弃上清，用0. Snol/LNaCl 和0. 05mol/LCaCl2混合液ImL重悬细胞，将小球藻浓度调整到3 8X IO7个/mL ；27°C 下，取0. 4mL上述藻液至1. 5mL离心管中，加入25 μ L(l. 77ng/ μ L)携带gus基因的质粒 pSP-Ubi-GUS DNA{含kocin(博莱霉素)抗性基因ble}，同时做的阴性对照不加入质粒 pSP-Ubi-GUS DNA。静置 15min。再分别加入 200 μ L 的 PNC 溶液(0. 8mol/LNaCl，0. 05mol/ LCaCl2,40% PEG 4000)，静置 30min。4000rpm 离心 5min，弃去上清液，分别加入 ImL SEC 液体培养基(SE培养基中加入0. 5mol/L蔴糖)和2 μ L浓度为10mg/mL Zeocin (博莱霉素)， 混合均勻，分别涂布于含有10ug/mL Zeocin的SEC固体培养基(SEC培养基中加入1. 3% 的琼脂)上，置于25°C培养箱中，光照条件3000 40001x静置培养。挑取单藻落于含有 lOyg/mLkocin的SEC液体培养基中。培养物为小球藻生物反应器。对照组没有藻落出现。接种于不含kocin的SEC固体培养基上的对照组有藻落出现。3)小球藻生物反应器中gus基因产物的检测在无菌条件下，挑取kocin抗性的单藻落转接入500 μ L含有10 μ g/mL Zeocin 的SEC液体培养基中，培养2 3天。8000rpm离心5min，收集藻体沉淀，加入0. ImL固定液(95%乙醇冰醋酸=3 1)固定30min。加入IOOyL⑶S染液，37°C下过夜染色。观察藻液变化，呈现出蓝色时证明gus基因已被转入小球藻细胞，其表达产物将反应底物催化成新生物质。本发明提供的一种新的小球藻生物反应器的构建方法，首先获得了具有高通透性细胞壁的活体小球藻，以温和的简便的新方法使外源基因安全地进入小球藻细胞。本发明不需要在高强度电场力或长时间电脉冲的电击条件下来建立小球藻生物反应器，避免了小球藻细胞遭受高强度电场力或长时间电脉冲的打击。利用本生物反应器成功地产出了 gus 基因的产物。
图1、组织化学染色法对小球藻生物反应器所产gus基因产物的验证。图2、质粒pSP-Ubi-GUS的构建图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅为解释性的，决不意味着它以任何方式限制本发明的范围。1)藻种小球藻(Chlorella ellipsoidea)藻种由天津师范大学微生物实验室筛选并保存，并且可以公开销售。2)试剂=NaCl, HCl，KCl，EDTA, KNO3, NaNO3, H3BO3, KH2PO4, Na2EDTA, Ca (NO3)2, FeCl3 · 6H20, K2HPO4 · 3H20, MgSO4 · 7H20, CaCl2 · 2H20, MnCl2 · 4H20, ZnSO4 · 7H20, CuSO4 · 5H20,Na2MoO4 · 2H20，酵母粉，葡萄糖，山梨醇，甘露醇，以上实验试剂均购于天津普博欣公司； 纤维素酶(Cellulase Onozuka R-10)，2-脱氧-D-葡萄糖购于日本Yakult Honsha公司；X-Gluc, TritonX-100, PEG 4000，Tris，乙酸钾，冰乙酸，Na3PO4 (ρΗ7. 0), K3 [Fe (CN)6], K4[Fe(CN)6]，溶菌酶，蔗糖，蛋白胨均购于天津大学科威试剂有限公司Jeocin购于北京迈晨科技。SE 液体培养基(pH 7. 0) 0. 25g NaNO3,0. 075g K2HPO4 ·3Η20，0· 075g MgSO4 ·7Η20， 0. 025g CaCl2 · 2Η20，0· 175g KH2PO4,0. 025g NaCl，40mL 土壤浸提液，0. 005g FeCl3 · 6H20, ImL Fe-EDTA, ImL A5 混合液，958mL 蒸馏水。(Fe-EDTA :lg Na2 .EDTA，0. 081g FeCl3 ·6Η20， 50mL HCl (0. IN)，50mL 蒸馏水；A5 混合液:0. 286g H3BO3,0. 181g MnCl2 · 4Η20，0· 022g ZnSO4 · 7Η20，0· 0079g CuSO4 · 5Η20, IOOmL 蒸馏水)。MBBM 培养基(pH 7.0) :0. 5g NH4Cl，0.075g MgSO4,0. 17g KH2PO4,0. 075g K2HPO4, 0. 025g CaCl2,0. 025g NaCl，0. 05g 酵母粉，ImL A6 混合液，7. 5g 2-脱氧-D-葡萄糖， 3. 75g 葡萄糖，用 dH20 定容到 1L。A6 混合液0. 28g H3BO3,0. 25g MnSO4 · 7H20，0. 0222g ZnSO4 · 7Η20，0· 0079g CuSO4 · 5Η20，0· 0021g Na2MoO4 · 2H20, IOOmL dH20。特别指出，本文中没有特别注明的百分比均为质量百分比。3)质粒的构建取基因载体质粒 pSP124S (Lumbreras，V.，Stevens, D. R. and Purton, S. Efficient foreign gene expression in Chlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous intron. Plant J. 1998,14(4) :441-448)，将 pSP124S DNA 与 Ubi-gus基因⑴bi为启动子)PCR产物分别用限制性内切酶Bam HI和Hin dill处理，分别得到具有粘性末端的DNA片段，使用DNA ligation Kit将DNA片段连接，构建重组DNA。 重组质粒命名为kocin抗性基因ble，携带外源gus基因，见图2。4) GUS 染液:50mmol/L PBS 缓冲液(pH 7. 0)，5mmol/L 铁氰化钾(K3 [Fe (CN)6]), 5mmol/L 亚铁氰化钾{K4[Fe (CN)6] · 3H20} ,0. 3% X-葡萄糖醛酸苷(X-Gluc) ,0. 5% Triton X-100。5)实施步骤(1)提高小球藻细胞壁通透性从初始细胞密度为2. 86 X IO8个/mL的小球藻培养液中取对数生长期的小球藻液体培养物，1 %接种量至SE液体培养基中，25°C静置培养，光照条件3000 40001χ，每4h摇动一次，连续照明，培养3天。分别取ImL培养液置于离心管中，4000rpm离心，除去SE液体培养基，收集藻细胞。分别按照表1所列实验条件进行预培养。收集藻细胞分别加入含有不同量纤维素酶的高渗酶解缓冲液10. 025mol/L磷酸缓冲液(由0. 2mol/LNaH2P04 ·2Η20 和0. 2mo VLNa2HPO4 · 12H20配置而成)，pH 6. 0，含有0. 3mol/L山梨醇/甘露醇}，混勻，置于水温30°C的水浴恒温振荡器中，转速80rpm，酶解4h。表1各种酶解实验条件
权利要求
1.一种小球藻生物反应器的构建方法，其特征在于包括以下步骤1)预培养筛选获得高通透性细胞壁的活体小球藻取对数生长期的小球藻液体培养物，1 %接种量至PH7的SE液体培养基中，25°C静置培养，光照条件3000 40001x，每4h摇动一次，连续照明，培养3天，4000rpm离心，收集小球藻细胞；25°C静置条件下，MBBM液体培养基预培养Mh，30°C条件下，用纤维素酶处理小球藻细胞，得到具有高通透性细胞壁的小球藻细胞培养液；2)小球藻生物反应器构建取步骤1)的小球藻培养液lmL，4000rpm离心5min，弃上清，用0. 8mol/L NaCl和 0. 05mol/L CaCl2混合液ImL重悬细胞，将小球藻浓度调整到3 8X107个/mL ；27 °C 下，取0.4mL上述藻液至1.5mL离心管中，加入25 μ L(0D26Q 1.77)携带gus基因的质粒 pSP-Ubi-GUS 0嫩{含&0(^11，博莱霉素)抗性基因ble}，静置15min ；再分别加入200 μ L的 PNC 溶液，其组成0. 8mol/L NaCl, 0. 05mol/L CaCl2,40% PEG 4000，静置 30min ;4000rpm 离心5min，弃去上清液，分别加入ImL SEC液体培养基和2 μ L浓度为10mg/mL Zeocin,混合均勻，分别涂布于含有lOug/mL Zeocin的SEC固体培养基上，置于25°C培养箱中，光照条件3000 40001x静置培养。挑取单藻落于含有10 μ g/mL kocin的SEC液体培养基中， 培养物为小球藻生物反应器；所述的SEC液体培养基的组成SE培养基中加入0. 5mol/L蔗糖所述的SEC固体培养基的组成SE培养基中加入1. 3%的琼脂；3)小球藻生物反应器中gus基因产物的检测在无菌条件下，挑取kocin抗性的单藻落转接入500 μ L含有10 μ g/mL Zeocin的SEC 液体培养基中，培养2 3天；SOOOrpm离心5min，收集藻体沉淀，加入0. ImL固定液固定 30min ；加入100 μ L⑶S染液，37°C下过夜染色；观察藻液变化，呈现出蓝色时证明gus基因已被转入小球藻细胞，其表达产物将反应底物催化成新生物质；所述的固定液组成95% 乙醇冰醋酸=3:1。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的SE液体培养基的组成0.25g NaNO3, 0. 075g K2HPO4 · 3Η20，0· 075g MgSO4 · 7Η20，0· 025g CaCl2 · 2Η20，0· 175g KH2PO4, 0. 025gNaCl，40mL 土壤浸提液，0. 005g FeCl3 · 6H20, ImL Fe-EDTA, ImL A5 混合液，958mL 蒸馏水；Fe-EDTA :lg Na2 · EDTA，0. 081g FeCl3 · 6H20，50mL HCl (0. IN)，50mL 蒸馏水；A5 混合液:0. 286g H3BO3,0. 181g MnCl2 · 4H20,0. 022g ZnSO4 · 7H20,0. 0079g CuSO4 · 5H20, IOOmL 蒸馏水。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的MBBM培养基组成0.5g NH4Cl, 0. 075g MgSO4,0. 17g KH2PO4,0. 075g K2HPO4,0. 025g CaCl2,0. 025g NaCl，0. 05g 酵母粉， lmLA6混合液，7. 5g 2-脱氧-D-葡萄糖，3. 75g葡萄糖，用dH20定容至Ij IL ；A6混合液:0. 28g H3BO3,0. 25g MnSO4 ·7Η20，0· 0222g ZnSO4 ·7Η20，0. 0079g CuSO4 ·5Η20，0· 002IgNii2MoO4 ·2Η20， IOOmL dH20，pH7.0。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的纤维素酶处理条件是由0.2mol/ LNaH2PO4 · 2H20 和 0. 2mol/L Na2HPO4 · 12H20 配置而成磷酸缓冲液，pH6. 0，含有 0. 3mol/L 山梨醇/甘露醇，混勻，置于水温30°C的水浴恒温振荡器中，转速80rpm，处理4h。
全文摘要
本发明涉及一种小球藻生物反应器的构建方法。它包括的步骤预培养筛选获得高通透性细胞壁的活体小球藻、小球藻生物反应器构建和小球藻生物反应器中gus基因产物的检测。利用本生物反应器成功地产出了gus基因的表达产物。本发明是一种条件温和，低成本，便捷的，使外源基因安全地进入小球藻细胞的新方法。在生物技术领域建立小球藻生物反应器，对于生产高价值产品，特别是来源紧俏的基因工程产品具有广泛的应用前景。
文档编号C12N15/63GK102337217SQ20111028206
公开日2012年2月1日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者刘丽丽, 王艳琪 申请人:天津师范大学