专利名称：肠杆菌sya2及用其制备乳糖酶的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体的说是一种肠杆菌及用其制备乳糖酶的方法。
背景技术：
乳糖酶(Lactase)学名为β _D_半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside galactohydrolase, Ε. C. 3. 2. 1. 23)，又名 β -半乳糖苷酶(β -galactosidase)，是一类催化β-D-半乳糖苷键发生水解的酶，它能将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。乳糖酶在动物、植物和微生物中分布广泛。目前为止，研究发现能够产生乳糖酶的微生物有很多，常见的霉菌包括黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲毒(Aspergillus oryzae)> 亮白曲 M^Aspergillus candidus\'微,\、毛霉(Micor pusillus、等；酵母菌包括脆壁克鲁维酵母GfA/j^erofflj^^s fragilis、、乳酸克鲁维酵母(Muyverowces lactis),热带假丝酵母(JJandida tropicalis )等；细菌包括大肠杆菌(.Escherichia Coli )、成团肠杆菌(Mn terobac ter agglomerans ) > 巨大芽抱杆 1 {Bacillus mega terium ) > 枯草芽抱杆 lif {Bacillus subtil is),环状芽孢杆OMcillus Circulans),嗜热脂肪芽孢杆鬼(Macillus stearothermophilus )> 保力口禾Ij 亚乳杆 lif {Lactobacillus bulgaricus )> 双歧杆菌 {Bifidobac terium )、7jC 生拉 JS、氏菌 iRahnella aqua tills )、口耆热链球菌(Strep tococcus thermophilus )、节杆菌(Arthrobacter aurescens)、黄杆菌 iFlavobacterium、等。不同微生物来源的乳糖酶性质及用途不同霉菌作用最适PH偏酸性(pH2. 5 5.0)，主要用于酸性乳清和干酪的水解；酵母所产乳糖酶最适PH近中性(pH6. 0 7. 0)，适合于牛乳和乳清的加工处理；细菌所产的酶与酵母最适PH接近且具有较高的耐热性。目前国内外细菌乳糖酶的研究尚处在起步阶段。
发明内容
本发明的目的是提供一种肠杆菌SYA2。本发明的另一个目的是提供一种用肠杆菌制备乳糖酶的方法。本发明中的肠杆菌SYA2从甘肃省甘南州牧区采集牦牛乳酸奶中筛选得到，分类命名为肠杆菌〈Enterobacter sp ) SYA2，于2011年09月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号CGMCC No :5251。本发明肠杆菌SYA2的筛选方法是采集甘肃省甘南州牧区采集牦牛乳酸奶样品， 涂布于含X-gal的分离筛选培养基上，观察菌落颜色变蓝的程度进行初步筛选，并比较乳糖酶活性大小而得到。牧区土壤样品经分离筛选培养基培养，选择生长良好、颜色变蓝的程度大的菌落进行摇瓶发酵培养，通过比较乳糖酶活性大小，最终确定菌株。含X-gal的分离筛选培养基组成乳糖20 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨10g/L、 X-gal 0. 04 g/L、琼脂 20 g/L, pH 7. 0o
一个标准酶活单位(U)定义为在37°C每分钟水解释放1 μ moL ONP所需的酶量。 取0. 5mL稀释后的粗酶液，在37°C下水浴5min，加入已预热至37°C的含5mmol/L ONPG磷酸盐缓冲液(pH6. 5)1. 5mL，37°C下水浴lOmin，然后立即加入3. OmL 0. 5mol/LNa2C03终止反应，于420nm处测定OD值，测定3次取平均值。
式中，X为乳糖酶活力；C为标准曲线上对应的ONP浓度；N为酶液的稀释倍数。本发明肠杆菌SYA2 CGMCC No :5251，具有产乳糖酶的能力。本发明用肠杆菌SYA2制备乳糖酶的方法为如下步骤
A、种子液制备
将肠杆菌SYA2接种于种子培养基中，在温度37 ！下，转速150 r/min摇床培养M小时，得到种子液；
种子培养基组成是乳糖10 g/L、蛋白陈10 g/L、酵母浸膏3 g/L、氯化钠3 g/L，pH为
7. 0 ；
B、发酵液制备
将种子液按3%的接种量，加入液体发酵培养基中，在温度37°C、转速180 200r/min 下振荡培养M小时，得到发酵液；
液体发酵培养基组成是乳糖15g/L、蛋白陈20 g/L、酵母浸膏3 g/L、氯化钠3 g/L、 磷酸氢二钾1 g/L、二氧化锰0. lg/L，pH为7. 0 ；
C、发酵液的离心与细胞破碎
将发酵液在温度4°C、转速6000r/min条件下离心20min，收集菌体并用0. lmol/L的 PH为6. 5的磷酸盐缓冲溶液洗涤两次，菌体超声破碎15min后，在温度4°C、转速12000r/ min下离心20min，得到上清液；
D、酶的分级沉淀
将硫酸铵烘干研细，取C步骤的上清液，向其中缓慢加入硫酸铵粉末至其饱和度达到 35%，在4°C温度下静置2. 5小时后，以7000转/分钟离心lOmin，取上清液，继续加入硫酸铵粉末至其饱和度达到75%，在4°C温度下静置2小时后，以7500转/分钟离心IOmindX 淀溶于0. 01moI/L的pH为6. 8的磷酸盐缓冲液中，再在4°C温度下透析M小时，即为透析液；
E、酶的纯化
将透析液加入DEAE-S印hadex A-25离子交换柱，以0. 05mol/L的pH为6. 2的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，采用氯化钠梯度洗脱，分布收集，检测活性，合并有活性的洗脱液；
F、酶的膜过滤浓缩
将有活性的洗脱液用截留分子量为2万道尔顿的超滤膜浓缩10倍，得到浓缩乳糖
酶液；
G、酶的冷冻干燥
在浓缩乳糖酶液中加入冻干保护剂，冻干保护剂的加入比例按每IOOmL浓缩乳糖酶液加入30g冻干保护剂，与零下20°C温度下预冷8小时，然后保持物料温度在零下30°C下干燥24小时，得到乳糖酶；冻干保护剂的重量比组成为，甘氨酸环糊精甘露醇氯化钠= 1 1 1 1 。H、粉碎、包装
将乳糖酶粉碎后进行包装。细菌与霉菌和酵母相比较，具有体积小、繁殖快、发酵过程易控制等特点，应用于工业化生产有很大的潜力。本发明开发的可以应用于乳制品加工的细菌乳糖酶，具有一定的经济效益和社会效益。本发明肠杆菌SYA2的形态特征与生理生化特征如下
1)形态特征菌株SYA2单菌落呈圆形、无色、突起、表面光滑、半透明状。革兰氏染色为阴性，菌体钝圆形，单个排列，无芽孢。菌株SYA2菌落及菌体形态分别见
图1和图2。2)生理生化特征见表1 表权利要求
1.一种肠杆菌SYA2 CGMCC No :5251，具有产乳糖酶的能力。
2.用权利要求1的肠杆菌SYA2制备乳糖酶的方法，其特征在于该制备方法为如下步骤A、种子液制备将肠杆菌SYA2接种于种子培养基中，在温度37 ！下，转速150 r/min摇床培养M小时，得到种子液；种子培养基组成是乳糖10 g/L、蛋白陈10 g/L、酵母浸膏3 g/L、氯化钠3 g/L，pH为7. 0 ；B、发酵液制备将种子液按3%的接种量，加入液体发酵培养基中，在温度37°C、转速180 200r/min 下振荡培养M小时，得到发酵液；液体发酵培养基组成是乳糖15g/L、蛋白陈20 g/L、酵母浸膏3 g/L、氯化钠3 g/L、 磷酸氢二钾1 g/L、二氧化锰0. lg/L，pH为7. 0 ；C、发酵液的离心与细胞破碎将发酵液在温度4°C、转速6000r/min条件下离心20min，收集菌体并用0. lmol/L的 PH为6. 5的磷酸盐缓冲溶液洗涤两次，菌体超声破碎15min后，在温度4°C、转速12000r/ min下离心20min，得到上清液；D、酶的分级沉淀将硫酸铵烘干研细，取C步骤的上清液，向其中缓慢加入硫酸铵粉末至其饱和度达到 35%，在4°C温度下静置2. 5小时后，以7000转/分钟离心lOmin，取上清液，继续加入硫酸铵粉末至其饱和度达到75%，在4°C温度下静置2小时后，以7500转/分钟离心IOmindX 淀溶于0. 01moI/L的pH为6. 8的磷酸盐缓冲液中，再在4°C温度下透析M小时，即为透析液；E、酶的纯化将透析液加入DEAE-S印hadex A-25离子交换柱，以0. 05mol/L的pH为6. 2的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，采用氯化钠梯度洗脱，分布收集，检测活性，合并有活性的洗脱液；F、酶的膜过滤浓缩将有活性的洗脱液用截留分子量为2万道尔顿的超滤膜浓缩10倍，得到浓缩乳糖酶液；G、酶的冷冻干燥在浓缩乳糖酶液中加入冻干保护剂，冻干保护剂的加入比例按每IOOmL浓缩乳糖酶液加入30g冻干保护剂，与零下20°C温度下预冷8小时，然后保持物料温度在零下30°C下干燥M小时，得到乳糖酶；H、粉碎、包装将乳糖酶粉碎后进行包装。
3.如权利要求2所述的制备乳糖酶的方法，其特征在于所述步骤G中冻干保护剂的重量比组成为，甘氨酸环糊精甘露醇氯化钠=1 1 1 1。
全文摘要
本发明公开了一种肠杆菌SYA2及用其制备乳糖酶的方法，本发明菌种为一株肠杆菌，是采用含X-gal分离筛选培养基从甘肃省甘南州牧区采集牦牛乳酸奶中筛选得到。乳糖酶的制备方法是以肠杆菌为菌种制备发酵液，得到的发酵液经高速冷冻离心、硫酸铵分级沉淀、DEAE-SephadexA-25离子交换层析、膜过滤浓缩和冷冻干燥得到成品乳糖酶成品，可用于乳制品加工。
文档编号C12N1/20GK102286419SQ20111028160
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月21日 优先权日2011年9月21日
发明者乔海军, 张卫兵, 张炎, 梁琪, 甘伯中, 米兰 申请人:甘肃农业大学