专利名称：快速检测鉴定李斯特菌的pcr-rflp方法及检测用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法及检测用试剂盒。
背景技术：
目前国际上公认的李斯特菌共有6种单核细胞增生李斯特菌(lis teria mwocj^ow/ ^，简称单增李斯特菌)、绵羊李斯特菌(listeria ivanovii)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)lif {Listeria welshimeri)lif {Listeria grayi)和西尔李斯特菌(listeria seeligcri).其中单增李斯特菌是一种人畜共患的病原菌，可引起严重的传染病，如败血症、脑炎、脑膜炎。该菌广泛存在于自然界中，肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是单增李斯特菌的感染源，食品中存在的单增李斯特菌对人类的安全具有威胁，该菌在4 ！的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原之一，2000年被WHO食品安全工作计划列为检测的食源性致病菌之一； 绵羊李斯特菌主要危害动物，特别是反刍兽，常表现为败血症和流产，对人危害较少；近期有国内外报道，英诺克李斯特菌存在于食品中，当其发生由非溶血性变为溶血性的变异时， 对人类具有一定的潜在致病性；其余3种李斯特菌对人和动物的危害相对较小。英诺克李斯特菌、威尔李斯特菌、格氏李斯特菌等李斯特菌虽不是常规致病菌，但由于其常与致病的李斯特菌共同存在于食品中，因此也被作为致病李斯特菌的指示菌。在食品中，虽然不同李斯特菌的危害严重性不同，但任何一种李斯特菌的存在，均被认为是卫生状况不良的指示。 目前，人们对这几种李斯特菌的分布状况不甚明了，为了能调查清楚不同李斯特菌的分布环境，首先需要发展适宜的检测鉴定几种李斯特菌的方法。掌握食品被李斯特菌污染状况是获得安全食品的重要一步，也是防止食物中毒， 保障人民健康的最有效的一步。按传统的生化鉴定方法检测鉴定李斯特菌时，有时会造成漏检，国内外已有多次非典型菌株缺少典型特征的报道；同时通过传统生化鉴定方法不易于做6种李斯特菌的种间区分。鉴于此，通过分子生物学方法鉴定李斯特菌得到了广泛的发展，然而目前这些方法主要是做李斯特菌属的鉴定。PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length polymorphism)方法常被用来做鉴定物种的方法。，该方法将PCR技术、RFLP分析与电泳方法联合应用，先将待测的靶DNA片段进行复制扩增，然后应用DNA限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析靶DNA片段是否被切割而分型。该方法操作简单，结果容易判定。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种检测和鉴别单增李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、威尔李斯特菌和格氏李斯特菌的PCR-RFLP方法及检测用试剂盒。本发明的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案，一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法，包括如下步骤1)基因组DNA模板的制
备；
2)PCR扩增反应通过李斯特菌iap基因特异引物对，进行PCR扩增反应；
3)PCR产物检测凝胶电泳检测PCR产物；
4)限制性内切酶消化反应用DdeI内切酶对PCR产物进行酶切；
5)酶切产物检测凝胶电泳检测酶切产物，并与酶切标准图谱比对。所述的步骤5)中比对方法为当阴性对照无条带，阳性对照出现与标准图谱一致的酶切片段时，说明实验有效；被检测样品与标准图谱中格氏李斯特菌的酶切谱带一致，说明为格氏李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中单增李斯特菌的酶切谱带一致，说明为单增李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中威尔李斯特菌的酶切谱带一致，说明为威尔李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中绵羊李斯特菌的酶切谱带一致，说明为绵羊李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中英诺克李斯特菌的酶切谱带一致，说明为英诺克李斯特菌阳性。所述步骤2)中PCR扩增反应所用的李斯特菌基因特异引物对的序列为 上游引物 5’ -ATGAATATGAAAAAAGCAAC-3，；
下游引物 5，-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3，。所述步骤2)中PCR扩增反应的反应液组成如下
10 X扩增缓冲液5 μ L ；(购于FERMENTAS公司) 4种dNTP混合物各
200 ymol/L;(购于生工生物工程(上海)有限公司) 引物对各0.5 μ mol/L ；
DNA模板2 yg;Taq DNA聚合酶2 u;(购于生工生物
工程(上海)有限公司) MgCl2 1. 5 mmol/L ； 加ddH20至50 μ L0所述PCR扩增反应条件如下95 °C变性3 min ；95 °C变性15 S,58 °C变性30 S、 72 °C变性45 S，进行35个循环扩增；72 °C延伸5 min。所述步骤4)中限制性内切酶消化反应体系按20 μ L计如下所示
DNA (PCR扩增后的产物)0.2-1 μ g ； IOX酶切buffer 2.0 μ L ；(购于天根生化科技(北京)有限公司)限制性内切酶Dde I 1-2 u ；(购于天根生化科技(北京)有限公司) 力口 ddH20 M 20 μ L。所述限制性内切酶Dde I消化反应的反应条件如下按上述配比先加入DNA (PCR 扩增后的产物)，10X酶切buffer，加ddH20至20 μ 1，最后加入限制性内切酶Dde I，轻轻混勻，稍加离心，放置于水浴温育。所述水浴温度为37°C，温育时间为lh。一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法所用的试剂盒，包括如下组成李斯特菌iap基因特异引物对，限制性内切酶Dde I，酶切标准图谱(见图3)和阳性对照液(iap 基因标准品)iap基因标准品序列见GenBank。试剂盒中其它组成，可按本领域常规进行选择。试剂盒实施步骤按上述的快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法的步骤进行。本发明的有益效果是本发明建立了检测和鉴定5种李斯特菌的PCR-RFLP方法及试剂盒，并经实际样本检测测试，未发现假阳性结果，表明该方法切实可行。本方法采用PCR 扩增技术，使得检测5种李斯特菌的灵敏度显著提高。本方法采用RFLP技术，一次即可对5 种李斯特菌进行筛查，不需要对每种李斯特菌分别进行确证鉴定，节省了实验时间，加快了检出速度。综上所述本发明的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，较传统的生理生化鉴定方法有更高的可重复性，较普通PCR更为快速、简便，可实现对5种李斯特菌的快速、准确、特异的检测和鉴定。可应用于检验检疫、临床诊断、公共卫生等实验室检测部门。
图1为本发明具体实施例1中标准菌珠的PCR扩增产物电泳M、Marker，1、格氏李斯特菌，2、单增李斯特菌，3、威尔李斯特菌，4、绵羊李斯特菌，5，英诺克李斯特菌；
图2为本发明具体实施例1中标准菌珠的PCR-RFLP产物电泳图； M、Marker，1、格氏李斯特菌，2、单增李斯特菌，3、威尔李斯特菌，4、绵羊李斯特菌，5，英诺克李斯特菌；
图3为酶切标准图谱；
M、Marker，1、格氏李斯特菌，2、单增李斯特菌，3、威尔李斯特菌，4、绵羊李斯特菌，5，英诺克李斯特菌。
具体实施例方式实施例1
本实施例的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法，包括如下步骤1)基因组 DNA模板的制备；取疑似菌落的细菌培养液1 ml，置于无菌的Eppendorf管中，12000 rpm 离心1 min，去上清，用灭菌蒸馏水洗涤两次，收集菌体；加入400yL裂解液(40 mmol/ L Tris-醋酸，20 mmol/L 醋酸钠，1 mmol/L EDTA，1%SDS，pH7. 8)混勻，置于 37 °C 水浴 1 h ；.然后加入200 μ L 5mol/L的氯化钠溶液，混勻后于13000 rpm离心15 min。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3 mol/L ,pH8. 0),-20 °C保存1 h后，13000 rpm离心15 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50yL TE溶液中，置4°C保存备用。2)PCR扩增反应通过李斯特菌iap基因特异引物对，进行PCR扩增反应； (1)引物
根据相关文献，选择一对引物为李斯特菌属的特异性扩增反应引物。用于PCR反应的引物对的序列为
上游引物5，-ATGAATATGAAAAAAGCAAC-3，， 下游引物5，-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3，； 李斯特菌的特异性PCR产物大小均为1400 bp左右。(2) PCR 反应 PCR反应液组成如下
IOX扩增缓冲液 5 μ L ；(购于FERMENTAS公司) 4种dNTP混合物各200 μ mol/L ；(购于生工生物工程(上海)有限公司) 引物对各0.5 μ mol/L ； DNA模板2 μ g ；Taq DNA聚合酶2 u ；(购于生工生物工程
(上海)有限公司) MgCl21. 5 mmol/L ； 加 ddH20 至50 μ L0
6
PCR扩增反应条件如下95 °C变性3 min ；95 °C变性15 S,58 °C变性30 S,72 V 变性45 S，进行35个循环扩增；72 °C延伸5 min。
(3) PCR产物电泳检测
取扩增后的产物5 μ L点样于1%琼脂糖凝胶(含0.5 yg/ml溴化乙锭)，以2000 bp Marker为标准分子参照，以5 V/cm的电场强度于0. 5 X TBE电泳缓冲液中电泳30 min ；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析、拍照；见图1，从图1可得5种李斯特菌均产生1400 bp 左右的特异性扩增条带。根据待检样品的电泳图是否出现1400 bp左右的特异性扩增条带可初步判定是否含为5种李斯特菌。PCR产物的序列鉴定
切下带有所需DNA片段的凝胶，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TAKARA)(购于天根生化科技(北京)有限公司)从琼脂糖凝胶中回收纯化目的片段；DNA测序由大连宝生物工程有限公司完成；测序证明，PCR扩增片段与预期一致。4)限制性内切酶Dde I消化反应限制性内切酶消化反应体系如下所示
DNA (PCR扩增后的产物)0.2-1 μ g ； IOX酶切buffer 2.0 μ L ；(购于天根生化科技(北京)有限公司)限制性内切酶Dde I 1-2 u ；(购于天根生化科技(北京)有限公司) 力口 ddH20 M 20 μ L。限制性内切酶Dde I消化反应条件如下
按上述配比先加入DNA (PCR扩增后的产物)，10 X酶切buffer，加ddH20至20 μ L， 最后加入限制性内切酶Dde I，轻轻混勻，稍加离心，放置于温度为37 ！水浴温育1 h。PCR-RFLP的消化产物电泳鉴定
取消化反应后的产物10 μ L点样于1%琼脂糖凝胶(含0.5 yg/ml溴化乙锭)，以2000 bpMarker为标准分子参照，以5 V/cm的电场强度于0. 5XTBE电泳缓冲液中电泳30 min ； 电泳结果用紫外凝胶成像系统分析、拍照；其中利用标准菌株进行上述PCR-RFLP的消化反应后电泳图为标准菌珠的PCR-RFLP产物电泳图，见图2，从图2可得经限制性内切酶 Dde I消化后，5种李斯特菌产生特异的酶切谱带。格氏李斯特菌具有250 bp和1200 bp左右的酶切片段；单增李斯特菌不被酶切，保持1400 bp左右的PCR产物片段；威尔斯李斯特菌具有600 bp,560 bp,400 bp,260 bp和200 bp左右的酶切片段；绵羊李斯特菌具有1200 bp和400 bp左右的酶切片段；英诺克李斯特菌具有710 bp,550 bp,260 bp左右的酶切片段。通过标准菌珠的PCR-RFLP产物电泳图构建酶切标准图谱，见图3。所以鉴定并区分这5种李斯特菌为当阴性对照无条带，阳性对照出现与酶切标准图谱一致的酶切片段时，说明实验有效；此时，被检测样品与酶切标准图谱中格氏李斯特菌的酶切谱带一致，说明为格氏李斯特菌阳性；被检测样品与酶切标准图谱中单增李斯特菌的酶切谱带一致，说明为单增李斯特菌阳性；被检测样品与酶切标准图谱中威尔李斯特菌的酶切谱带一致，说明为威尔李斯特菌阳性；被检测样品与酶切标准图谱中绵羊李斯特菌的酶切谱带一致，说明为绵羊李斯特菌阳性；被检测样品与酶切标准图谱中英诺克李斯特菌的酶切谱带一致，说明为英诺克李斯特菌阳性。本实施例的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法所用的试剂盒，包括如下组成上述李斯特菌iap基因特异引物对，限制性内切酶Dde I，酶切标准图谱和阳性对照液。 本实施例建立了检测和鉴定5种李斯特菌的PCR-RFLP方法及试剂盒，并经实际样本检测测试，未发现假阳性结果，表明该方法切实可行。本方法采用PCR扩增技术，使得检测5种李斯特菌的灵敏度显著提高。本方法采用RFLP技术，一次即可对5种李斯特菌进行筛查，不需要对每种李斯特菌分别进行确证鉴定，节省了实验时间，加快了检出速度。所以说本实施例所述的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，较传统的生理生化鉴定方法有更高的可重复性，较普通PCR更为快速、简便，可实现对5种李斯特菌的快速、准确、特异的检测和鉴定。可应用于检验检疫、临床诊断、公共卫生等实验室检测部门。
权利要求
1.一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特征在于包括如下步骤1)基因组DNA模板的制备；2)PCR扩增反应通过李斯特菌iap基因特异引物对，进行PCR扩增反应；3)PCR产物检测凝胶电泳检测PCR产物；4)限制性内切酶消化反应用DdeI内切酶对PCR产物进行酶切；5)酶切产物检测凝胶电泳检测酶切产物，并与酶切标准图谱比对。
2.如权利要求1所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特征在于 所述的步骤5)中比对方法为当阴性对照无条带，阳性对照出现与标准图谱一致的酶切片段时，说明实验有效；被检测样品与标准图谱中格氏李斯特菌的酶切谱带一致，说明为格氏李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中单增李斯特菌的酶切谱带一致，说明为单增李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中威尔李斯特菌的酶切谱带一致，说明为威尔李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中绵羊李斯特菌的酶切谱带一致，说明为绵羊李斯特菌阳性； 被检测样品与标准图谱中英诺克李斯特菌的酶切谱带一致，说明为英诺克李斯特菌阳性。
3.如权利要求1所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特征在于所述步骤2)中PCR扩增反应所用的李斯特菌基因特异引物对的序列为上游引物 5，-ATGAATATGAAAAAAGCAAC-3，；下游引物 5，-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3，。
4.如权利要求1所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特征在于所述步骤2)中PCR扩增反应的反应液组成如下IOX扩增缓冲液5 yL; 4种dNTP混合物各200 μ mol/L ；引物对各 0.5 μ mol/L ；DNA 模板 2 yg;TaqDNA聚合酶2 u ；MgCl21. 5 mmol/L ； 力口 ddH20 至50 μ L。
5.如权利要求4所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特征在于所述 PCR扩增反应条件如下95 °C变性3 min ；95 °C变性15 S,58 °C变性30 S,72 °C变性45 S，进行35个循环扩增；72 °C延伸5 min。
6.如权利要求1所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特征在于所述步骤4)中限制性内切酶消化反应体系按20 μ L计如下所示PCR 扩增后的产物 DNA 0. 2-1 μ g ； IOX 酶切 buffer 2. 0 μ L ；限制性内切酶Dde I 1-2 u ；力口 ddH20 M 20 μ L。
7.如权利要求6所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特征在于所述限制性内切酶Dde I消化反应的反应条件如下按上述配比先加入PCR扩增后的产物DNA， IOX酶切buffer，加ddH20至20 μ L，最后加入限制性内切酶Dde I，轻轻混勻，稍加离心，放置于水浴温育。
8.如权利要求7所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法，其特征在于所述水浴温度为37 °C，温育时间为1 h。
9.如权利要求1所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法所用的试剂盒，其特征在于包括如下组成李斯特菌iap基因特异引物对，限制性内切酶Dde I，酶切标准图谱和阳性对照液。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法及检测用试剂盒，包括如下步骤1)基因组DNA模板的制备；2)PCR扩增反应通过李斯特菌iap基因特异引物对，进行PCR扩增反应；3)PCR产物检测凝胶电泳检测PCR产物；4)限制性内切酶消化反应用DdeⅠ内切酶对PCR产物进行酶切；5)酶切产物检测凝胶电泳检测酶切产物，并与酶切标准图谱比对。本发明的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。
文档编号C12Q1/04GK102329883SQ201110314558
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者叶妍妍, 孔繁德, 徐淑菲, 杨俊萍, 林立, 郭书林, 陈信忠, 陈垚, 龚艳清 申请人:厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心