专利名称：一种具有低温活性和耐盐性的甘露聚糖酶及其基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种具有低温活性和耐盐性的甘露聚糖酶ManAjb 13及其基因。
背景技术：
甘露聚糖是一种丰富的半纤维素，由吡喃甘露糖以β -1，4糖苷键连接而成，广泛存在于高等植物中，如豆科植物的种子、魔芋的球茎、兰科植物的假鳞茎、称猴桃的茎叶中等。甘露聚糖的降解主要依靠内切甘露聚糖酶(β -mannanase ；endo-1, 4-β-D-mannanase, EC 3.2. 1.78)，降解产物为甘露糖或甘露寡糖。根据氨基酸序列同源性，内切甘露聚糖酶主要归类于糖苷水解酶第5和沈家族，其可来源于细菌、放线菌及真菌等(Firm et al., Nucleic Acids Res, 2008，36: D281-D288·)。内切甘露聚糖酶在饲料、食品、医药、纺织、造纸、石油开采等领域都具有应用价值。饲料中添加甘露聚糖酶，可显著降低甘露聚糖分子大小，从而改善饲料性能、消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用并提高免疫力(Dhawan and Kaur, Crit Rev Biotechnol, 2007，27: 197 - 216.)。具有低温活性的内切甘露聚糖酶制剂可应用于低温生境和低温加工过程。水产动物体温随水温或气温变化而变化，一般在10-20°C(ZhoU et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2009，85: 323 - 333.)。因此，水产饲料中应用的内切甘露聚糖酶需要在此低温(10 - 20°C)环境下具有催化活性。另一方面，大多数水产动物消化道环境呈中性(如鲤科鱼类)并含中性内源蛋白酶，水产饲料中添加的外源内切甘露聚糖酶需在中性条件下具有催化活性，并对中性蛋白酶具有抗性。再一方面，海洋鱼类适于生长在高盐环境中(如石斑鱼最佳养殖盐度为25 - 33)，饲用海洋鱼类的内切甘露聚糖酶需要具有耐盐性。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有低温活性和耐盐性的甘露聚糖酶ManAjbl3。本发明的再一目的是提供编码上述甘露聚糖酶的基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本发明所述甘露聚糖酶ManAjb 13可得自鞘氨醇单胞菌(^Sphingobium sp.)。 ManAjbl3的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。甘露聚糖酶ManAjbl3总共含396个氨基酸，其中N端38个氨基酸为其预测的信号肽序列 “MIARRFSNLPESCGAIRSSFFCAIILLAGCGPLGRPNA”，成熟的甘露聚糖酶 ManAjbl3 含 358个氨基酸。本发明通过PCR的方法分离克隆了甘露聚糖酶ManAjbl3的编码基因ffla/H/WJ，其全长1191bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。该基因序列如SEQ ID N0. 2所示。经BLAST 比对,该甘露聚糖酶基因j》7J编码的氨基酸序列与GenBank中marinusSGO. 5JP17-172来源的潜在甘露聚糖酶(AEN72408)具有最高的一致性，为56. 2% ；与确证活性的 Cellvibrio Japonicus 来源甘露聚糖酶 Cjmar^6c (2VX4_A)的一致性为 44. 4%。本发明还提供了包含上述甘露聚糖酶基因力的重组载体，优选为 m-MmAjbl3。将本发明的甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间， 使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的甘露聚糖酶基因插入到质粒pETjSa ( + )上的feoRI和损ol限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌表达质粒m-manAjbl3。本发明还提供了包含上述甘露聚糖酶基因力的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21 (DE3) /manAjbl3。本发明制备甘露聚糖酶ManAjbl3的方法按以下步骤进行
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶表达；
3)回收并纯化所表达的甘露聚糖酶ManAjbl3。其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21 (DE3 )，得到重组菌株BL21 (DE3) /manAjbl3。本发明的甘露聚糖酶ManAjbl3的最适pH值为6. 5 ；最适温度为40°C，在10°C和 20°C下分别具有 20%和 55%的酶活；在反应体系中加入2M的NaCl，仍然具有80%的酶活； 经2M的NaCl (pH6. 5)在37°C下处理60min，活力无损失；经胰蛋白酶和蛋白酶K在37°C 处理Ih后，仍能分别保持106. 9%和98. 4%的酶活；可水解木薯粉、玉米粉、麸皮和豆粕。以上性质表明甘露聚糖酶ManAjbl3可作为一种添加剂应用于水产饲料和食品行业。
图1 在大肠杆菌中表达的重组甘露聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，M 低分子量蛋白质Marker ；1 纯化的重组甘露聚糖酶。图2重组甘露聚I套酶的最适PH。
图3重组甘露聚I套酶的PH稳定性。
图4重组甘露聚I套酶的最适温度。
图5重组甘露聚I套酶的热稳定性。
图6NaCl对重组甘露聚糖酶酶活性的影响。
图7重组甘露聚I套酶在NaCl中的稳定性。
具体实施例方式试验材料和试剂
1、菌株及载体鞘氨醇单胞菌sp.)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心 ACCC 01037 ；大肠杆菌表达载体 pET-28a( + )及菌株fecAericAia coli BL21 (DE3) 购于Novagen公司。2、酶类及其它生化试剂限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa 公司；角豆胶和甘露糖购自Sigma公司；其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基
LB 培养基=Peptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 10g，加蒸馏水至 1000ml，pH 自然 (约为7)。固体培养基在此基础上加2. 0% (w/v)琼脂。说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1 鞘氨醇单胞菌甘露聚糖酶基因的克隆
提取鞘氨醇单胞菌基因组DNA:将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入ImL溶菌酶，37°C处理60min，再加入裂解液，70°C水浴裂解60min，每隔IOmin混勻一次，在4°C下 IOOOOrpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇， 于室温静置5min后，4°C下IOOOOrpm离心lOmin。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于_20°C备用。根据糖苷水解酶第沈家族的保守氨基酸序列([N/T/E] -G- [E/G] -ff- [F/Y] -W-W-G 和 Y-P- [G/V] - [D/A] - [E/NS] -Y-V-D )设计合成了简并引物 GH26F 和(表 1)。表1.甘露聚糖酶基因的克隆与表达引物
权利要求
1.一种具有低温活性和耐盐性的甘露聚糖酶ManAjbl3，其特征在于其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2.一种编码权利要求1所述的具有低温活性和耐盐性的甘露聚糖酶ManAjbl3的甘露聚糖酶基因manAjbl3，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一种包含权利要求4所述甘露聚糖酶基因的重组载体。
4.一种包含权利要求4所述甘露聚糖酶基因的重组菌株。
全文摘要
本发明涉及一种具有低温活性和耐盐性的甘露聚糖酶ManAjb13及其基因。来源于鞘氨醇单胞菌(Sphingobiumsp.)的甘露聚糖酶ManAjb13的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，且本发明提供了编码上述甘露聚糖酶的编码基因manAjb13，甘露聚糖酶基因manAjb13的重组载体和甘露聚糖酶基因manAjb13的重组菌株。本发明的甘露聚糖酶具有以下性质最适pH6.5；最适温度为40℃，在10℃和20℃下分别具有~20%和~55%的酶活；在反应体系中加入2M的NaCl，仍然具有80%的酶活；经2M的NaCl(pH6.5)在37℃下处理60min，活力无损失；良好的蛋白酶抗性；较好的水解各种自然底物的能力。本发明的甘露聚糖酶ManAjb13可作为一种添加剂应用于水产饲料及食品行业中。
文档编号C12N15/63GK102311944SQ20111032625
公开日2012年1月11日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者周峻沛, 唐湘华, 李俊俊, 潘璐, 王凤, 许波, 高雅洁, 黄遵锡 申请人:云南师范大学