专利名称：海地瓜消化道总rna快速提取方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种海地瓜消化道总RNA的提取方法，尤其是一种步骤相对简单，提取完整性好、主要用于实时定量PCR (real-time PCR)检测的海地瓜消化道总RNA的方法。
背景技术：
从海洋生物组织细胞中提取完整性好的RNA是进行分子生物学研究的必要前提和保障，不同的海洋生物组织成分和结构差异较大。因此，对不同物种和组织来源的组织细胞，提取总RNA应该采用相应的方法。海地瓜消化道组织含有消化道内容物，消化道管壁化学成分主要为粘多糖、消化酶、肌肉蛋白等。因此，海底花消化道总RNA提取前样品处理比较困难，处理不当，将使总 RNA提取得率下降、样品降解、容易受污染，严重影响后续实时定量PCR检测工作。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种可避免海地瓜消化道总RNA提取中受内容物污染，提取完整性好、简便快速的海地瓜消化道总RNA的方法。本发明方法的具体步骤是
步骤(1).解剖取海地瓜消化道，使用针头纵向剖开消化道管，采用经膜过滤及高温灭菌的海水清洗后用液氮冷冻；
步骤(2).将冷冻后的海地瓜消化道研磨成粉末，取30 50mg粉末加入到液氮预冷的离心管中；
步骤(3).离心管中加入0. 8 1. 2ml的TRIZOL裂解液，振荡混勻，常温下静置5 lOmin，离心 0. 5 2min ；
步骤取上清液，加入200 300μ1氯仿，振荡混勻5 lOmin，静置5 IOmin后离心10 20min，取上层水相200 300μ1 ；
步骤(5).取出的上层水相中加入与上层水相等体积的经过-30 -10°C预冷的异丙醇，混勻后-30 -10°C下静置10 20min，离心5 15min，沉淀RNA ；
步骤(6).将离心管置于冰盒中，去除上清后加入1 2ml经-30 -10°C预冷的浓度为75%乙醇进行清洗；
步骤(7).吹洗沉淀后，重复步骤(6)；
步骤(8).去除上清后离心1 2min，移液枪吸除剩余液体，加入20 40μ1的无RNA 酶去离子水，混勻后在3 5°C下放置10 20min，溶解RNA ；
步骤(9).获得的RNA溶液中加入4 5μ1的无RNA酶的DNA酶缓冲液、8 ΙΟμΙ浓度为lU/μΙ的无RNA酶的DNA酶及1 2μ1的RNA酶抑制剂，混勻后30 40°C恒温培育 30 60min，成培养液;
步骤(10).培养液中加入与培养液等体积的经过-30 -10°C预冷的异丙醇，混勻后-30 -10°C下静置10 20min，离心5 15min，再次沉淀RNA ；
步骤(11).再次将离心管置于冰盒中，去除上清后加入1 2ml经-30 -10°C预冷的浓度为75%乙醇进行清洗；
步骤(1 .吹洗沉淀后，重复步骤(11)；
步骤(13).去除上清后离心1 2min，移液枪吸除剩余液体，加入20 40μ1的无RNA 酶去离子水，混勻后在3 5°C下放置20 40min，再次溶解RNA ；
步骤(14).取1 3P1RNA溶液用于凝胶检测和浓度检测，其余置于-90 -70°C保存。各步骤中所述离心的条件为3 5°C，离心速度为8000 15000 X g。本发明方法在取样后，采用针头剖开消化道管，清洗后迅速置入液氮冻存后研磨， 解剖及清洗方便，液氮低温研磨避免样品RNA降解；采用预冷异丙醇及低温静置沉淀RNA， 提高RNA沉淀效果，降低实验过程的RNA降解；采用预冷的乙醇重复清洗，并且操作过程置于冰盒中保持低温，有效降低RNA降解；使用DNAase消化粗体样品，并加入RNA酶抑制剂， 有效去除基因组DNA污染，抑制消化过程中的RNA降解。本发明方法提取时间短，RNA完整性好，完全可以满足实时定量PCR检测要求。
具体实施例方式实施例1
步骤(1).解剖取海地瓜消化道，使用针头纵向剖开消化道管，采用经膜过滤及高温灭菌的海水清洗后用液氮冷冻；
步骤O).将冷冻后的海地瓜消化道研磨成粉末，取30mg粉末加入到液氮预冷的离心
管中；
步骤(3).离心管中加入0. 8ml的TRIZOL裂解液，振荡混勻，常温下静置5min，离心 0. 5min ；
步骤(4).取上清液，加入200μ1氯仿，振荡混勻5min，静置5min后离心IOmin，取上层水相200μ1 ；
步骤(5).上层水相中加入与200μ1经过_30°C预冷的异丙醇，混勻后_30°C下静置 IOmin,离心 5min，沉淀 RNA ；
步骤(6).将离心管置于冰盒中，去除上清后加入Iml经-30°C预冷的浓度为75%乙醇进行清洗；
步骤(7).吹洗沉淀后，重复步骤(6)；
步骤(8).去除上清后离心lmin，移液枪吸除剩余液体，加入20μ1的无RNA酶去离子水，混勻后在3°C下放置lOmin，溶解RNA ；
步骤(9).获得的RNA溶液中加入4μ1的无RNA酶的DNA酶缓冲液、8μ1浓度为lU/μΙ 的无RNA酶的DNA酶及 μ 的RNA酶抑制剂，混勻后30°C恒温培育60min，成培养液；
步骤(10).培养液中加入与培养液等体积的经过_30°C预冷的异丙醇，混勻后_30°C下静置lOmin，离心5min，再次沉淀RNA ；
步骤(11).再次将离心管置于冰盒中，去除上清后加入Iml经_30°C预冷的浓度为75% 乙醇进行清洗；
步骤(1 .吹洗沉淀后，重复步骤(11)；步骤(13).去除上清后离心lmin，移液枪吸除剩余液体，加入20μ1的无RNA酶去离子水，混勻后在3°C下放置20min，再次溶解RNA ；
步骤(14).取WlRNA溶液用于凝胶检测和浓度检测，其余置于-90°C保存。各步骤中所述离心的条件为3°C，离心速度为15000 X g。实施例2:
步骤(1).解剖取海地瓜消化道，使用针头纵向剖开消化道管，采用经膜过滤及高温灭菌的海水清洗后用液氮冷冻；
步骤O).将冷冻后的海地瓜消化道研磨成粉末，取50mg粉末加入到液氮预冷的离心
管中；
步骤(3).离心管中加入1. 2ml的TRIZOL裂解液，振荡混勻，常温下静置lOmin，离心 2min ；
步骤(4).取上清液，加入300μ1氯仿，振荡混勻lOmin，静置IOmin后离心20min，取上层水相300μ1 ；
步骤(5).上层水相中加入300μ1经过-10°C预冷的异丙醇，混勻后-10°C下静置 20min，离心 15min，沉淀 RNA ；
步骤(6).将离心管置于冰盒中，去除上清后加入2ml经-10°C预冷的浓度为75%乙醇进行清洗；
步骤(7).吹洗沉淀后，重复步骤(6)；
步骤(8).去除上清后离心2min，移液枪吸除剩余液体，加入40μ1的无RNA酶去离子水，混勻后在5°C下放置20min，溶解RNA ；
步骤(9).获得的RNA溶液中加入5μ1的无RNA酶的DNA酶缓冲液、ΙΟμΙ浓度为lU/μΙ 的无RNA酶的DNA酶及2μ1的RNA酶抑制剂，混勻后40°C恒温培育30min，成培养液；
步骤(10).培养液中加入与培养液等体积的经过-10°C预冷的异丙醇，混勻后-10°C下静置20min，离心15min，再次沉淀RNA ；
步骤(11).再次将离心管置于冰盒中，去除上清后加入2ml经-10°C预冷的浓度为75% 乙醇进行清洗；
步骤(1 .吹洗沉淀后，重复步骤(U)；
步骤(13).去除上清后离心aiiin，移液枪吸除剩余液体，加入40μ1的无RNA酶去离子水，混勻后在5°C下放置40min，再次溶解RNA ；
步骤(14).取3P1RNA溶液用于凝胶检测和浓度检测，其余置于-70°C保存。各步骤中所述离心的条件为5°C，离心速度为8000 X g。实施例3:
步骤(1).解剖取海地瓜消化道，使用针头纵向剖开消化道管，采用经膜过滤及高温灭菌的海水清洗后用液氮冷冻；
步骤O).将冷冻后的海地瓜消化道研磨成粉末，取40mg粉末加入到液氮预冷的离心
管中；
步骤(3).离心管中加入1.0ml的TRIZOL裂解液，振荡混勻，常温下静置8min，离心 Imin ；
步骤(4).取上清液，加入250μ1氯仿，振荡混勻8min，静置Smin后离心15min，取上层水相250μ1 ；
步骤(5).上层水相中加入250μ1经过-20°C预冷的异丙醇，混勻后-20°C下静置 15min，离心 lOmin，沉淀 RNA ；
步骤(6).将离心管置于冰盒中，去除上清后加入1. 5ml经_20°C预冷的浓度为75%乙醇进行清洗；
步骤(7).吹洗沉淀后，重复步骤(6)；
步骤(8).去除上清后离心1. 5min，移液枪吸除剩余液体，加入30μ1的无RNA酶去离子水，混勻后在4°C下放置15min，溶解RNA ；
步骤(9).获得的RNA溶液中加入4. 5μ1的无RNA酶的DNA酶缓冲液、9μ1浓度为IU/ μ 的无RNA酶的DNA酶及1. 5μ1的RNA酶抑制剂，混勻后35°C恒温培育45min，成培养液； 步骤(10).培养液中加入与培养液等体积的经过_20°C预冷的异丙醇，混勻后_20°C下静置15min，离心lOmin，再次沉淀RNA ；
步骤(11).再次将离心管置于冰盒中，去除上清后加入1.5ml经-20°C预冷的浓度为 75%乙醇进行清洗；
步骤(1 .吹洗沉淀后，重复步骤(11)；
步骤(13).去除上清后离心1. 5min，移液枪吸除剩余液体，加入30μ1的无RNA酶去离子水，混勻后在4°C下放置30min，再次溶解RNA ；
步骤(14).取2P1RNA溶液用于凝胶检测和浓度检测，其余置于-80°C保存。
各步骤中所述离心的条件为4°C，离心速度为10000 X g。
权利要求
1.海地瓜消化道总RNA快速提取方法，其特征在于该方法的具体步骤是步骤(1).解剖取海地瓜消化道，使用针头纵向剖开消化道管，采用经膜过滤及高温灭菌的海水清洗后用液氮冷冻；步骤( .将冷冻后的海地瓜消化道研磨成粉末，取30 50mg粉末加入到液氮预冷的离心管中；步骤(3).离心管中加入0. 8 1. 2ml的TRIZOL裂解液，振荡混勻，常温下静置5 lOmin，离心 0. 5 2min ；步骤取上清液，加入200 300μ1氯仿，振荡混勻5 lOmin，静置5 IOmin后离心10 20min，取上层水相200 300μ1 ；步骤(5).取出的上层水相中加入与上层水相等体积的经过-30 -10°C预冷的异丙醇，混勻后-30 -10°C下静置10 20min，离心5 15min，沉淀RNA ；步骤(6).将离心管置于冰盒中，去除上清后加入1 2ml经-30 _10°C预冷的浓度为75%乙醇进行清洗；步骤(7).吹洗沉淀后，重复步骤(6)；步骤(8).去除上清后离心1 2min，移液枪吸除剩余液体，加入20 40μ1的无RNA 酶去离子水，混勻后在3 5°C下放置10 20min，溶解RNA ；步骤(9).获得的RNA溶液中加入4 5μ1的无RNA酶的DNA酶缓冲液、8 ΙΟμΙ浓度为lU/μΙ的无RNA酶的DNA酶及1 2μ1的RNA酶抑制剂，混勻后30 40°C恒温培育 30 60min，成培养液;步骤(10).培养液中加入与培养液等体积的经过-30 -10°C预冷的异丙醇，混勻后-30 -10°C下静置10 20min，离心5 15min，再次沉淀RNA ；步骤(11).再次将离心管置于冰盒中，去除上清后加入1 2ml经-30 -10°C预冷的浓度为75%乙醇进行清洗；步骤(1 .吹洗沉淀后，重复步骤(11)；步骤(13).去除上清后离心1 2min，移液枪吸除剩余液体，加入20 40μ1的无RNA 酶去离子水，混勻后在3 5°C下放置20 40min，再次溶解RNA ；步骤(14).取1 3P1RNA溶液用于凝胶检测和浓度检测，其余置于-90 -70°C保存。
2.如权利要求1所述的海地瓜消化道总RNA快速提取方法，其特征在于所述离心的条件为3 5°C，离心速度为8000 15000 X g。
全文摘要
本发明涉及海地瓜消化道总RNA快速提取方法。目前海底花消化道总RNA提取前样品处理比较困难，总RNA提取得率不高且容易受污染。本发明方法将采用液氮冷冻海地瓜消化道组织，采用研钵研磨后置入TRIZOL裂解液中裂解、匀浆；组织匀浆离心后取上清，加入氯仿并震荡混匀，离心取上清；加入低温异丙醇，混匀、离心沉淀；75%乙醇洗涤；无RNA酶的去离子水溶解沉淀物，-90～-70℃保存。本发明方法有效避免了样品RNA降解，提高了RNA沉淀效果，该方法提取时间短，RNA完整性好，完全可以满足实时定量PCR检测要求。
文档编号C12N15/10GK102344923SQ20111032883
公开日2012年2月8日 申请日期2011年10月26日 优先权日2011年10月26日
发明者刘永芹, 王天明, 肖金星, 邵庆均, 郑刚, 马文明 申请人:浙江大学舟山海洋研究中心