专利名称：一种促进水稻秧苗素质的假单胞菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种假单胞菌属的菌株，特别是涉及一种利用微生物筛选技术，从芦苇根际土壤分离获得的具有提高水稻秧苗素质的假单胞菌菌株。
背景技术：
良好的水稻秧苗素质有利于提高插秧质量、增加水稻产量。目前，我国大多地区采取使用化水稻育秧剂(或壮秧剂)增强水稻秧苗质量。即便如此，一些地区水稻秧苗，特别是机插秧和手抛秧苗仍出现幼苗黄化、秧苗不发棵、长势弱、甚至根部腐烂等现象，一旦遇到低温、干旱、寡照或多雨等环境，上述现象尤为严重。针对这些问题，人们先后采取了适当降低播种量、使用农药(多效唑等)防止徒长、蓝色膜育秧等方法，其结果要不效率偏低， 要不成本偏高。目前我国已有的一些水稻育秧专用微生物肥料的主要用途，是缓解水稻苗期常见的病害，如青枯、立枯、恶苗等，对一些物理性伤害，如低温、多雨、干旱等并无缓解作用，或目前尚未报道。然而，育秧时节的天气变化和土壤病害状况都可能对秧苗素质产生重大影响。因此，筛选能高效促进水稻秧苗素质的PGPR菌株，应对生物和非生物因素干扰，对稳定/提高水稻产量具有重要意义。
发明内容
本发明针对水稻育秧微生物肥料存在的缺陷，应用筛选技术，从根际土壤获得1 株能促进水稻秧苗素质，提高水稻对生物/非生物因素干扰能力的PGPR菌株，并已在水稻育秧相关试验中获得成功。本发明提供的菌株为恶臭假单胞菌(作洲而膨/？浙putida) RBPl (以下简称为 RBPl菌株)，是从我国江苏省大丰麋鹿自然保护区芦苇根际土壤中分离、筛选出的，其已于 2011年8月31日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心”保藏，保藏编号为CGMCC No. 5205。本发明所述的RBPl菌株具有下述性质 A、形态特征
在肉汤琼脂培养基培养2天后，用光学显微镜和电子显微镜进行观察，RBPl杆状， 长度3、微米，宽度为0. 5^0. 6微米，革兰氏阴性，不产芽孢，以极生鞭毛运动。B、培养特征
在肉汤琼脂培养基上菌落乳白，半透明，表面光滑有光泽，边缘整齐。C、菌株生理生化特性
RBPl菌株在7%氯化钠培养基上可缓慢生长，接触酶反应阳性，能液化明胶，产硫化氢， V-P>甲基红反应阴性，不能水解淀粉，能水解尿素，分解精氨酸，0/F试验为氧化型，不能还原硝酸。D、菌株16S rRNA基因序列如SEQ ID NO. 1所示。E、菌株鉴定结果通过形态特征、理化特性，结合16S rRNA基因序列结果，将该菌株鉴定为恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida\用该菌株浸种1(Γ20分钟晾干，或用菌液喷施苗盘土壤润湿表面即可，具有用量省、见效快、适应性强等特点，所培育出的秧苗最典型的特征是秧苗“矮壮”，体现在秧龄 18-20天，叶龄3-4叶，苗基部茎宽大于2. 5毫米，每棵秧苗白根数多于15条，盘根良好，呈 “毯状”，秧苗高度12厘米左右，秧苗均勻整齐，高度一致。可节约609Γ100%苗期农化用品投入量，此外对水稻一些常见病害具有一定的生防效果。
图1为RBPl菌株在水稻育秧中的促生效果，图中左侧为对照，右侧为添加RBPl处理；
图2为RBPl菌株电镜形态(23 000Χ )。
具体实施例方式实施例1 :RBP1菌株的筛选方法
采集扬州大学农学院试验田小麦根及其附着土壤2 mm区域)，置于冰盒(温度约 4°C )，立即带回实验室。取植物根部，用无菌dH20轻柔冲洗，以去除外围土壤，切成长约3 cm小段(利于内生细菌释放)，各称取约1 g根段加入200 mL无菌dH20,150 r/min混合30 min，梯度稀释后，分别吸取20 μ L菌液涂布于3种筛选培养基Jensen’ s培养基、King’ s B培养基，和NA (nutrient agar)培养基，28°C培养72 h，挑取共计98株形态各异的细菌， 分别编号，按照溶磷、解钾、固氮、产IAA、产嗜铁素、抗生素等指标进行PGPR菌株的进一步筛选，最终获得1株高效促生能力的RBPl菌株。RBPl菌株于2011年8月31日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 5205 ；分类命名为恶臭假单胞菌G^ei/i/offloftas putida、M 藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。实施例2 =RBPl促生及生防指标测定 A、生长素(IAA)测定
细菌在特定液体培养基中(添加0.5 g/L L-色氨酸，约2. 5 mM)生长48 h，取培养液 2 mL, 10000 r/min 离心 15 min,每 1 ml 上清液加 2 mL Salkowski 试剂(每升 10. 8 M H2SO4含4. 5 g !^eCl3),室温暗处显色30 min后，于530 nm处测光密度值。以空白培养基作对照，并以纯IAA对应的光密度作标准曲线，计算IAA产出量(mg/L)。标准曲线配1 g/L IAA母液100 mL，分别吸取0、1、2、3、4、5 ml定容至50 mL，即得到0、60、120、180、M0、300 mg/L的系列IAA溶液。再在上述溶液中，分别吸取1 mL加入 2 mL显色剂，即得到0、2、40、60、80、100 mg/L的系列IAA溶液。结果显示，RBPl产IAA能力为 4. 85 mg/L οB、产 NH3 鉴定
将菌株转接到含10 ml蛋白胨水(10 g/L)试管中，28°C培养48-72 h，每管加入0.5 mL Nessler' s试剂，颜色由褐色转为黄色的表明有NH3产生。结果表明，RBPl有很强的产氨能力。
C、产 HCN 鉴定
在NB培养基中添加4. 4 g/L甘氨酸，将细菌划线接种于该平板上，另将浸过洲碳酸钠、 0. 5%苦味酸溶液(2，4，6-三硝基苯酚)whatman 1号滤纸置于培养基上，密封，28°C培养4 d，滤纸颜色由橘黄色转为红色的说明有HCN产生。结果表明，RBPl有一定的产HCN能力。D、溶磷能力测定
在培养基中添加 Cei3 (PO4) 2J8°C，170 r/min 培养 5 d，10000 r/min 离心 30 min，钼锑抗比色法定量测定溶解磷含量。结果表明，RBPl的溶磷量为106.75 mg P/L。实施例3 =RBPl对水稻塑盘旱育秧苗素质的影响
将消毒过的水稻种子在IO8 cfu/mL RBPl细胞液内浸泡20 min，于无菌操作台上风干后，备播种用。在434孔规格的塑盘旱育抛秧盘中，每盘均勻撒播45 g种子，用细土覆土 2 cm，喷洒自来水使苗盘湿润，覆膜。齐苗后，在第一叶完全抽出1.0 cm左右时揭膜。早晚时分洒水补湿。20 d后，取出秧盘，测量茎长、茎基粗等；自来水下冲洗洗净后，将茎叶和根部分离，置于烘箱80°C烘8 h左右至恒重，分别称重。试验中，RBPl处理的茎高比对照减少 6. 17%，茎基粗对照增粗26. 32%，差异均达显著水平；RBPl处理的地上部和地下部干重分别比对照增重17. 72%禾口 50. 60% (如图1)。实施例4 菌株的鉴定
A、形态及培养特征接种RBPl菌株于营养肉汤琼脂上培养2、天后，观察菌落形状及菌体颜色，并用光学显微镜及电子显微镜进行常规菌体形态的观察(图2)。B、生理生化实验参照《Bergey’ s Manual of Systematic Bacteriology》的内容对菌株进行生理生化鉴定。C、16S rRNA基因序列分析按反复冻融法提取细菌基因组DNA。以总DNA为模板，利用特异引物27F/1492R (引物参见SEQ ID NO. 2和3)扩增16S rRNA基因近乎全长片段。50 μ L 的反应体系中含有 IXPCR Buffer (含 MgCl2)，200 μ mol/L 的 dNTPs，0. 2 μ mol/L的引物，IXTaq DNA聚合酶(Takara，大连宝生物)和1 μ L的模板。PCR反应程序为94° C预变性5min;94° C变性45 s，64° C退火lmin，72° C延伸90 s，20个循环，每次循环退火温度降低0.5° C;72° C延伸20 min。PCR产物送上海生工测序。根据获得16S rDNA序列，在GenBank中Blast搜索同源序列。
权利要求
1. 一种促进水稻秧苗素质的假单胞菌菌株，是恶臭假单胞菌(作^/而 /^^ putida) RBPl，保藏编号为 CGMCC No. 5205。
全文摘要
本发明涉及一种假单胞菌属的菌株，是恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)RBP1，保藏编号为CGMCCNo.5205。用该菌株浸种10~20分钟晾干，或用菌液喷施苗盘土壤润湿表面即可，具有用量省、见效快、适应性强等特点，所培育出的秧苗最典型的特征是秧苗“矮壮”，体现在秧龄18-20天，叶龄3-4叶，苗基部茎宽大于2.5毫米，每棵秧苗白根数多于15条，盘根良好，呈“毯状”，秧苗高度12厘米左右，秧苗均匀整齐，高度一致。可节约60%~100%苗期农化用品投入量，此外对水稻一些常见病害具有一定的生防效果。
文档编号C12N1/20GK102443554SQ20111035114
公开日2012年5月9日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者康贻军, 殷仕学, 程洁, 高君君 申请人:扬州大学