专利名称：一种红霉素发酵液的发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物发酵方法，特别涉及一种红霉素的低糖低氮发酵方法，属于医药生物技术领域。
背景技术：
红霉素(Erythromycin)是 1952年从红色链霉菌(Streptomyces erythreus)培养液中分离出来的一种碱性抗生素。红霉素具有广谱抗菌作用，对革兰阳性菌、如葡萄球菌、 化脓性链球菌、绿色链球菌、肺炎链球菌、粪链球菌、梭状芽孢杆菌、白喉杆菌等有较强的抑制作用。对革兰阴性菌、如淋球菌、螺旋杆菌、百日咳杆菌、布氏杆菌、军团菌、以及流感嗜血杆菌、拟杆菌也有相当的抑制作用。我国从1957年试制成功并逐步投入大生产。目前，国内已有关于红霉素发酵工艺的研究，如华东理工大学韩德全等人进行的红霉素发酵工艺优化研究(2004年华东理工大学工程硕士学位论文)；中国专利说明书 CN101134972B中也描述了利用菌渣套用技术改进红霉素的发酵工艺等，随着高产菌株的投产及发酵方法的不断改进，使发酵单位水平不断提高，但仍然没有解决原料消耗大，糖氮利用率低等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红霉素发酵方法。本发明目的是通过如下技术方案实现的本发明所述的红霉素发酵液的发酵方法包括如下步骤(1)红霉素种子液培养①母斜面孢子制备将冷冻保存在砂土管中的红霉素链霉菌(产生菌)孢子(本发明使用的红霉素链霉菌为广东省微生物菌种保藏中心商业上广泛销售的菌种，GIM编号GIM4. 14，其他编号AS4. 198)，接种于灭菌的斜面培养基上，在温度32 34°C条件下，培养7 9天；②子斜面孢子制备将母斜面孢子，接种于灭菌的斜面培养基上，在温度32 34°C条件下，培养7 9天；③种子培养将子斜面孢子，接种于灭菌的液体种子培养基中，经过三级种子扩大培养，得到红霉素种子液；(2)红霉素发酵将红霉素种子液按10 20%体积比接种于灭菌的培养基中，通入无菌空气并开启搅拌，添加营养物质，在温度32 34°C条件下，培养7 10天，得红霉素发酵液。本发明所述的母斜面孢子培养基是由下述组分组成淀粉0. 1 1. 0重量份，玉米浆0. 05 0. 2重量份，琼脂0. 1 1. 0重量份，葡萄糖0. 1 1. 0重量份，氯化钠0. 5 2. 0重量份，氯化钙0. 1 1. 0重量份，用自来水定容到100体积份。本发明所述的母斜面孢子培养基组分可以优化为淀粉0. 5重量份，玉米浆0. 1重量份，琼脂0. 5重量份。葡萄糖0. 5重量份，氯化钠1重量份，氯化钙0. 5重量份，用自来水定容到100体积份。本发明所述的子斜面孢子培养基是由下述组分组成淀粉0. 1 1. 0重量份，玉米浆0. 05 0. 2重量份，琼脂0. 1 1. 0重量份，葡萄糖0. 1 1. 0重量份，氯化钠0. 5 2. 0重量份，氯化钙0. 1 1. 0重量份，用自来水定容到100体积份。本发明所述的子斜面孢子培养基组分组成优化为淀粉0. 4重量份，玉米浆0. 2重量份，琼脂0. 4重量份，葡萄糖0. 4重量份，氯化钠1. 5重量份，氯化钙1. 0重量份，用自来水定容到100体积份。本发明所述的一级种子扩大培养条件为⑴培养基组成黄豆粉2 4重量份， 淀粉1 2重量份，CaCO3O. 6 0. 8.重量份，糊精1 2重量份，硫铵0. 2 0. 4重量份，玉米浆1 4重量份，植物油0. 5 1重量份，用自来水定容到100体积份；(2)温度为32 34 0C ； (3)培养时间48 96小时；本发明所述的一级种子扩大培养基组成优化为黄豆粉3重量份，淀粉1. 5重量份，CaCO3O. 7重量份，糊精1. 5重量份，硫铵0. 3重量份，玉米浆2重量份，植物油0. 7重量份，用自来水定容到100体积份。本发明所述的一级种子扩大培养基组成优化为黄豆粉2重量份，淀粉2重量份， CaCO3O. 75重量份，糊精1重量份，硫铵0. 4重量份，玉米浆3重量份，植物油0. 8重量份，用自来水定容到100体积份。本发明所述的二，三级种子扩大培养条件为(1)培养基组成黄豆粉2. 0 4. 5 重量份，淀粉2. 5 4. 0重量份，CaCO3O. 5 0. 7重量份，氯化钠0. 4 0. 6重量份，糊精 2. 5 4. 0重量份，硫铵0. 1 0. 3重量份，玉米浆1 2重量份，植物油0. 8 1. 5重量份，消沫剂0 0. 02重量份，用自来水定容到100体积份；(2)温度为32 34°C; (3)培养时间24 48小时。本发明所述的二，三级种子扩大培养基组成(1)培养基组成黄豆粉3. 5重量份， 淀粉3. 2重量份，CaCO3O. 6重量份，氯化钠0. 5重量份，糊精3. 2重量份，硫铵0. 2重量份， 玉米浆1. 5重量份，植物油1. 1重量份，消沫剂0. 005重量份，用自来水定容到100体积份。本发明所述的二，三级种子扩大培养基组成(1)培养基组成黄豆粉4重量份，淀粉3重量份，CaCO3O. 5重量份，氯化钠0. 4重量份，糊精4重量份，硫铵0. 3重量份，玉米浆 1重量份，植物油0. 8重量份，消沫剂0. 01重量份，用自来水定容到100体积份。本发明所述的发酵培养基组成黄豆粉3. 5 5. 5重量份，淀粉2. 0 4. 0重量份，硫铵0. 08 0. 15重量份，CaCO3O. 6 1. 0重量份，植物油0. 5 1. 0重量份，消沫剂 0. 005 0. 02重量份，用自来水定容到100体积份。本发明所述的发酵培养基组成黄豆粉4. 5重量份，淀粉3. 0重量份，硫铵0. 12重量份，CaCO3O. 8重量份，大豆油0. 7重量份，消沫剂0. 01重量份，用自来水定容到100体积份。本发明所述的发酵培养基组成黄豆粉5. 0重量份，淀粉2. 5重量份，硫铵0. 15重量份，CaCO3O. 7重量份，植物油0. 9重量份，消沫剂0. 005重量份，用自来水定容到100体积份。本发明所述的添加营养物质组成为液糖10 50重量份，植物油1 10重量份， 正丙醇溶液0.5 5重量份。本发明所述的添加营养物质组成为液糖20重量份，植物油4重量份，正丙醇2重量份。
本发明所述的的添加营养物质组成为液糖40重量份，植物油5重量份，正丙醇1
重量份。本发明所述的植物油为花生油、菜籽油、大豆油、棉籽油、香油、葵花籽油、橄榄油、莪术油、大蒜油、沙棘油、当归油、生姜油、连翘油、紫苏油、陈皮油、蓖麻油、薄荷油、肉豆蔻油中的任一种。本发明所述的植物油优选为大豆油，菜籽油中的任一种。本发明所述的液糖为20 70%葡萄糖溶液。本发明所述的正丙醇溶液为20 70%正丙醇溶液。本发明所述的消沫剂为聚醚类消沫剂。本发明所述的聚醚类消沫剂为聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油中的任一种或两种的组合物。上述本发明方法中的重量份与体积份的关系为g/mL的关系。本发明红霉素发酵液按常规方法提取即可得到红霉素。本发明与现有的红霉素发酵方法相比的进步性如下本方法通过对培养基的优化及发酵方法改进，使葡萄糖、黄豆粉、玉米浆等原料利用率得到提高。2，通过对培养基的优化使发酵所需原辅料种类减少，需量减小，对原辅料生物利
用度提高。3，由于发酵所需物料种类和使用量减少，加之糖氮利用率的提高，发酵液中残留的葡萄糖、黄豆饼粉、商品玉米浆等营养物残留量随之减少，红霉素生产废水污染程度大大降低，利于经污水站处理后达标排放，符合清洁生产的要求。以下的实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。实验例1对比试验本发明实验例和实施例中，所述的红霉素产生菌为红霉素链霉菌。本发明实验例和实施例中，所述的方法如下按照实施例一的方法，将红霉素种子液按10%比例接种于经灭菌的发酵培养基中，通入无菌空气并搅拌，在15小时添加60%葡萄糖溶液40g，菜籽油5g，30%正丙醇lg， 经过7天培养，得红霉素发酵液。现有技术中红霉素种子制备培养基组分为淀粉3. 5g，硫酸铵0. 75g，氯化钠 0. 5g，蛋白胨0. 5g，糊精2. Og,葡萄糖3. Og,酵母粉2. Og,碳酸钙0. Sg,硫酸镁0. 05g,磷酸氢二钾0. 08g，豆油0. 4mL，用自来水定容到100mL。培养条件为温度为33°C ； (3)培养时间70小时。现有技术中红霉素发酵培养基组分为淀粉3. Og,硫酸铵0. 5g，糊精4. 5g，葡萄糖 2. 0g，玉米浆0. lg，碳酸钙0. 9g，豆油0. 6mL，用自来水定容到100mL。本实验例所述的红霉素一级种子培养基组分为黄豆粉3g，淀粉1. 5g，CaCO3O. 7g， 糊精1. 5g，硫铵0. 3g，玉米浆2g，大豆油0. 7g，用自来水定容到100ml。培养条件为温度为330C ；培养时间70小时。本实验例所述的红霉素二、三级种子培养基组分为黄豆粉3. 5g，淀粉3. 2g，CaCO3O. 6g，氯化钠0. 5g，糊精3. 2g，硫铵0. 2g，玉米浆1. 5g，大豆油1. Ig,聚氧丙烯甘油 0. 005g，用自来水定容到100ml。培养条件为温度为32 34°C ；培养时间M 48小时。本实验例所述的红霉素发酵培养基组分为黄豆粉4.5g，淀粉3.0g，硫铵0. 12g， CaCO3O. 8g，大豆油0. 7g，聚氧丙烯甘油0. Olg，用自来水定容到100ml。表1红霉素发酵技术的比较
权利要求
1.一种红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)红霉素种子液培养①母斜面孢子制备将冷冻保存在砂土管中的红霉素链霉菌 (产生菌)孢子，接种于经灭菌的斜面培养基上，在温度32 34°C条件下，培养7 9天； ②子斜面孢子制备将母斜面孢子，接种于经灭菌的斜面培养基上，在温度32 34°C条件下，培养7 9天；③种子培养将子斜面孢子，接种于经灭菌的种子培养基，经过三级种子扩大培养，得到红霉素种子液；(2)发酵将红霉素种子液按10 20%体积比接种于经灭菌的培养基中，通入无菌空气并搅拌15 30小时，添加营养物质，经过7 10天培养，得红霉素发酵液。
2.如权利要求1所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的母斜面孢子制备斜面培养基是由下述组分组成淀粉0. 1 1. 0重量份、玉米浆0. 05 0. 2重量份、琼脂 0. 1 1. 0重量份、葡萄糖0. 1 1. 0重量份、氯化钠0. 5 2. 0重量份、氯化钙0. 1 1. 0 重量份、用自来水定容到100体积份。
3.如权利要求2所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的母斜面孢子制备斜面培养基组分由下述组分组成淀粉0. 5重量份、玉米浆0. 1重量份、琼脂0. 5重量份。 葡萄糖0. 5重量份，氯化钠1重量份，氯化钙0. 5重量份、用自来水定容到100体积份。
4.如权利要求1所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的子斜面孢子制备斜面培养基是由下述组分组成淀粉0. 1 1. 0重量份、玉米浆0. 05 0. 2重量份、琼脂 0. 1 1. 0重量份、葡萄糖0. 1 1. 0重量份、氯化钠0. 5 2. 0重量份、氯化钙0. 1 1. 0 重量份、用自来水定容到100体积份。
5.如权利要求4所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的子斜面孢子制备斜面培养基是由下述组分组成淀粉0. 4重量份、玉米浆0. 2重量份、琼脂0. 4重量份、葡萄糖0. 4重量份，氯化钠1. 5重量份，氯化钙1. 0重量份、用自来水定容到100体积份。
6.如权利要求1所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的一级种子扩大培养培养基组成为黄豆粉2 4重量份、淀粉1 2重量份、CaCO3O. 6 0. 8.重量份、糊精 1 2重量份、硫铵0. 2 0. 4重量份、玉米浆1 4重量份、植物油0. 5 1重量份、用自来水定容到100体积份；
7.如权利要求1所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的一级种子扩大培养温度为32 34°C ；培养时间为48 96小时。
8.如权利要求6所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的一级种子扩大培养基组成为黄豆粉3重量份、淀粉1. 5重量份、CaCO3O. 7重量份、糊精1. 5重量份、硫铵0. 3 重量份、玉米浆2重量份、植物油0. 7重量份、用自来水定容到100体积份。
9.如权利要求6所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的一级种子扩大培养基组成为黄豆粉2重量份、淀粉2重量份、CaCO3O. 75重量份、糊精1重量份、硫铵0. 4重量份、玉米浆3重量份、植物油0. 8重量份、用自来水定容到100体积份。
10.如权利要求1所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的二、三级种子扩大培养培养基组成黄豆粉2. 0 4. 5重量份、淀粉2. 5 4. 0重量份、CaC03 0. 5 0. 7 重量份、氯化钠0. 4 0. 6重量份、糊精2. 5 4. 0重量份、硫铵0. 1 0. 3重量份、玉米浆 1 2重量份、植物油0. 8 1. 5重量份、消沫剂0 0. 02重量份、用自来水定容到100体积份；
11.如权利要求1所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的二、三级种子扩大培养温度为32 34°C ；培养时间为M 48小时。
12.如权利要求10所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的二、三级种子扩大培养培养基组成为黄豆粉3. 5重量份、淀粉3. 2重量份、CaCO3O. 6重量份、氯化钠0. 5 重量份、糊精3. 2重量份、硫铵0. 2重量份、玉米浆1. 5重量份、植物油1. 1重量份、消沫剂 0. 005重量份、用自来水定容到100体积份。
13.如权利要求10所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的二、三级种子扩大培养培养基组成为黄豆粉4重量份、淀粉3重量份、CaCO3O. 5重量份、氯化钠0. 4重量份、糊精4重量份、硫铵0. 3重量份、玉米浆1重量份、植物油0. 8重量份、消沫剂0. 01重量份、用自来水定容到100体积份。
14.如权利要求1所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的发酵培养基组成为黄豆粉3. 5 5. 5重量份、淀粉2. 0 4. 0重量份、硫铵0. 08 0. 15重量份、 CaTO3O. 6 1. 0重量份、植物油0. 5 1. 0重量份、消沫剂0. 005 0. 02重量份、用自来水定容到100体积份。
15.如权利要求14所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的发酵培养基组成为黄豆粉4. 5重量份、淀粉3. 0重量份、硫铵0. 12重量份、CaCO3O. 8重量份、大豆油0. 7 重量份、消沫剂0. 01重量份、用自来水定容到100体积份。
16.如权利要求14所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的发酵培养基组成为黄豆粉5. 0重量份、淀粉2. 5重量份、硫铵0. 15重量份、CaCO3O. 7重量份、植物油0. 9 重量份、消沫剂0. 005重量份、用自来水定容到100体积份。
17.如权利要求1所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的添加营养物质组成为液糖10 50重量份、植物油1 10重量份、正丙醇溶液0. 5 5重量份。
18.如权利要求17所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的添加营养物质组成为液糖20重量份、植物油4重量份、正丙醇2重量份。
19.如权利要求17所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的添加营养物质组成为液糖40重量份、植物油5重量份、正丙醇1重量份。
20.如权利要求6或8 10或12 19任一所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的植物油为花生油、菜籽油、大豆油、棉籽油、香油、葵花籽油、橄榄油、莪术油、大蒜油、沙棘油、当归油、生姜油、连翘油、紫苏油、陈皮油、蓖麻油、薄荷油、肉豆蔻油中的任一种。
21.如权利要求20所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的植物油为大豆油或菜籽油。
22.如权利要求17所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的液糖为20 70%葡萄糖溶液。
23.如权利要求17所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的正丙醇溶液为 20 70%正丙醇溶液。
24.如权利要求10或12 16任一所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的消沫剂为聚醚类消沫剂。
25.如权利要求24所述的红霉素发酵液的发酵方法，其特征在于所述的聚醚类消沫剂为聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油中的任一种或两种的组合物。
全文摘要
本发明公开了一种红霉素发酵液的发酵方法，本发明红霉素的发酵方法包括如下步骤将红霉素链霉菌(产生菌)孢子接种，斜面培养基培养，再经三级种子扩大培养后接种于经灭菌的培养基中，通入无菌空气搅拌，添加营养物质，培养，即得。本发明通过对培养基的优化及发酵方法改进，使葡萄糖、黄豆粉、玉米浆等原料利用率得到提高，发酵所需原辅料种类减少，需量小，对原辅料生物利用度高。
文档编号C12P19/62GK102409071SQ20111039620
公开日2012年4月11日 申请日期2011年12月2日 优先权日2011年12月2日
发明者刘思川, 梁隆, 王利春, 程志鹏, 邓芸, 邹太平, 黄海玉 申请人:伊犁川宁生物技术有限公司