专利名称：一种红霉素发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种红霉素发酵方法，属于医药生物领域。
背景技术：
红霉素(Erythromycin，Er)第一代大环内酯类抗生素，主要由链霉菌、小单孢菌和糖多孢菌产生。在临床上主要应用于治疗革兰氏阳性细菌感染，对革兰氏阴性菌如流感杆菌、百日咳杆菌、淋球菌、布氏杆菌、军团菌及脑膜炎球菌等也有抗菌作用。红霉素主要活性成分是红霉素A(Er-A)，杂质组分主要有红霉素B (Er-B)和红霉素C(Er-C)、红霉素D(Er-D)、以及红霉素E(Er-E)、红霉素F(Er-F)等，各组分结构式如图1 所示。红霉素生物合成(图2)的原料是丙酸和甲基丙二酸，活性形式是丙酰-CoA和甲基丙二酰-CoA。丙酸和甲基丙二酸均由初级代谢产物分解而来，甲基丙二酸经PKS酶脱梭也能产生丙酸。六分子的甲基丙二酰-CoA和一分子的丙酰-CoA在聚酮合酶(polyketide synthases, PKS)的催化作用下，经缩合、酮还原、脱水和烯还原等多轮循环后形成红霉素的大环内酯环，即6-脱氧红霉内酯阳-deoxyerthronolide B，6_dEB)。6-dEB在C-6羟化酶的作用下形成红霉内酯(erythronolide, EB) 0 EB在糖基转移酶的作用下，先在C-3位接上第1个脱氧糖L-mycarose，后在C-5位接上第2个脱氧糖D-desosamine，从而形成了具有生物活性的红霉素D (Er-D)。从红霉素D形成红霉素 A (Erythromycin A, Er-A)有两种途径，由于C-12羟基化酶(EryK)和甲基化酶(EryG)对底物的亲和力存在差异，主要是通过红霉素D在EryK的催化下形成Er_C，然后在甲基化酶 (EryG)的催化下在碳霉糖的C-3’位甲基化而最终形成红霉素A。红霉素B杂质的产生，与 EryK催化的羟基化反应进行不完全有关。红霉素B杂质活性比红霉素A稍弱，在以红霉素A为原料合成二三代大环内酯类抗生素的过程中，红霉素B也将变成相应的杂质进入产品，极难去除，因此有必要深入研究在发酵阶段就降低红霉素B的含量。
发明内容
本发明的目的在于公开一种红霉素发酵方法。本发明使用的红霉素链霉菌(Sti^ptomyces erythreus)为广东省微生物菌种保藏中心商业上广泛销售的菌种，GIM编号GIM4. 14，其他编号AS4. 198。本发明目的是通过如下技术方案实现的将冷冻管中的红霉素链霉菌种子，接入含有20 30体积份种子培养基的三角瓶中，在33士0. 5°C的摇床间培养42 50h，摇床转速为220 MOr/min ；将培养好的种子培养液按照5 10%接种量接入含有20 30体积份发酵培养基的三角瓶中，培养温度 33士0.5°C，摇床转速220 MOr/min，培养150 210h ；即得红霉素发酵物；在发酵培养过程中加入添加剂。
本发明还可以优选如下步骤将冷冻管中的红霉素链霉菌种子，接入含有25体积份种子培养基的三角瓶中，在 33士0.5°C的摇床间培养46h，摇床转速为230r/min，将培养好的种子培养液按照8%接种量接入含有25体积份发酵培养基的三角瓶中，培养温度33士0. 5°C，摇床转速230r/min，培养160 180h ；即得红霉素发酵物；在发酵M 3 后中加入添加剂。所述的种子培养基组分为淀粉3. 5重量份，硫酸铵0. 75重量份，氯化钠0. 5重量份，蛋白胨0. 5重量份，糊精2. 0重量份，葡萄糖3. 0重量份，酵母粉2. 0重量份，碳酸钙0. 8 重量份，硫酸镁0. 05重量份，磷酸氢二钾0. 08重量份，豆油0. 4体积份，用自来水定容到 100体积份。所述的发酵培养基组分为淀粉3. 0重量份，硫酸铵0. 5重量份，糊精4. 5重量份， 葡萄糖2. 0重量份，玉米浆0. 1重量份，碳酸钙0. 9重量份，豆油0. 6体积份，用自来水定容到100体积份。所述的添加剂为铁盐、苯巴比妥衍生物、表面活性剂配制而成的组合物；所述的铁盐为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、氢氧化铁中的一种或多种；所述的苯巴比妥衍生物为苯巴比妥钠、甲乙炔巴比妥钠、司可巴比妥、2-硫代巴比妥酸中的一种或多种；所述的表面活性剂为壬基酚聚氧乙烯醚G-N-NP2E0)、η-辛基- β -D-吡喃葡萄糖苷中的一种或多种。所述的发酵液中铁盐的浓度为0. 2 5mmol/L ；所述的发酵液中苯巴比妥衍生物的浓度为lmmol/L以下；所述的发酵液中表面活性剂的浓度为0. 1 0. 7mmol/L。上述本发明方法中的重量份与体积份的关系为g/ml的关系。本发明所述的红霉素发酵方法，通过加入极少量复合添加剂，显著降低了发酵液中红霉素B杂质的含量，提高了效价。
图1红霉素主要组分及其结构红霉素主要活性成分是红霉素A(Er-A)，杂质组分主要有红霉素B (Er-B)和红霉素C(Er-C)、红霉素D(Er-D)、以及红霉素E(Er-E)、红霉素F(Er-F)等，本图所示各组分结构式。 图2红霉素生物合成过程本图所示红霉素的生物合成过程。下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。实验例一对比试验本发明实验例和实施例中，所述的红霉素产生菌为红霉素链霉菌。本发明实验例和实施例中，所述的测定方法如下先处理样品取发酵液10mL，用滤纸过滤。然后取ImL滤液，用超速离心机以 10000r/min离心lOmin，用0. 22 μ m的膜过滤上清液，置于进样瓶中分析。按照实施例一的方法，将培养好的种子培养液按照10%接种量分别接入5个含有 25mL发酵培养基的250mL中三角瓶中，培养温度33 士0. 5°C，摇床转速220r/min。5个三角瓶分别按如下五种方法操作，发酵结束后，测定效价与主要组分红霉素A、红霉素B、红霉素 C的含量，结果见表一。
本发明实验例和实施例中，所述的种子培养基组分为淀粉3. 5g，硫酸铵0. 75g， 氯化钠0. 5g，蛋白胨0. 5g，糊精2. 0g，葡萄糖3. Og,酵母粉2. Og,碳酸钙0. Sg,硫酸镁 0. 05g，磷酸氢二钾0. 08g，豆油0. 4mL，用自来水定容到IOOmL0所述的发酵培养基组分为淀粉3. 0g，硫酸铵0. 5g，糊精4. 5g，葡萄糖2. 0g，玉米浆0. lg，碳酸钙0. 9g，豆油0. 6mL，用自来水定容到100mL。生物效价测定使用管碟法。主要组分红霉素A、B、C百分含量使用HPLC法测定， 实验条件为采用反相柱C18柱ΚΡ-α8θ50πιπιΧ4·6πιπι，5μπι)，以乙腈(色谱纯)0.5% 磷酸二氢铵(A.R)缓冲液=35 65为流动相，流速为lmL/min，在215nm处检测，柱温为 35 "C。空白组发酵192h。方法1 在发酵120h后，添加ATP 2. 5mg、硫酸镁90mg、柠檬酸80mg、L-蛋氨酸为 10mg，继续发酵72h。方法2 在发酵96h后，添加Triton-XlOO 40uL (约42. ^ig)，继续发酵％h。方法3 在发酵24h后，添加六水三氯化铁27. lmg、苯巴比妥钠5. ^ig、壬基酚聚氧乙烯醚 G-N-NP2E0)6. :3mg，继续发酵 168h。方法4 在发酵24h后，添加氢氧化铁10. 8mg、甲乙炔巴比妥钠5. Omg, η-辛基-β -D-吡喃葡萄糖苷6. Img,继续发酵16 。表一与现有技术相比的实验数据表
权利要求
1.一种红霉素发酵方法，其特征在于该方法包括如下步骤将冷冻管中的红霉素链霉菌种子，接入含有20 30体积份种子培养基的三角瓶中，在33士0. 5°C的摇床间培养42 50h，摇床转速为220 MOr/min ；将培养好的种子培养液按照5 10%接种量接入含有 20 30体积份发酵培养基的三角瓶中，培养温度33 士0. 5°C，摇床转速220 MOr/min，培养150 210h ；即得红霉素发酵物；在发酵培养过程中加入添加剂。
2.如权利要求1所述的红霉素发酵方法，其特征在于该方法包括如下步骤将冷冻管中的红霉素链霉菌种子，接入含有25体积份种子培养基的三角瓶中，在33 士 0. 5°C的摇床间培养46h，摇床转速为230r/min，将培养好的种子培养液按照8 %接种量接入含有25体积份发酵培养基的三角瓶中，培养温度33士0. 5°C，摇床转速230r/min，培养160 180h ；即得红霉素发酵物；在发酵M 3 后中加入添加剂。
3.如权利要求1 2所述的红霉素发酵方法，其特征在于所述的种子培养基组分为 淀粉3. 5重量份，硫酸铵0. 75重量份，氯化钠0. 5重量份，蛋白胨0. 5重量份，糊精2. O重量份，葡萄糖3. O重量份，酵母粉2. O重量份，碳酸钙0. 8重量份，硫酸镁0. 05重量份，磷酸氢二钾0. 08重量份，豆油0. 4体积份，用自来水定容到100体积份；所述的发酵培养基组分为淀粉3. O重量份，硫酸铵0. 5重量份，糊精4. 5重量份，葡萄糖2. O重量份，玉米浆0. 1 重量份，碳酸钙0. 9重量份，豆油0. 6体积份，用自来水定容到100体积份。
4.如权利要求1 2所述的红霉素发酵方法，其特征在于所述的添加剂为铁盐、苯巴比妥衍生物、表面活性剂配制而成的组合物。
5.如权利要求4所述的红霉素发酵方法，其特征在于所述的铁盐为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、氢氧化铁中的一种或多种；所述的苯巴比妥衍生物为苯巴比妥钠、甲乙炔巴比妥钠、 司可巴比妥、2-硫代巴比妥酸中的一种或多种；所述的表面活性剂为壬基酚聚氧乙烯醚 (4-N-NP2E0), η-辛基- β -D-吡喃葡萄糖苷中的一种或多种。
6.如权利要求4所述的红霉素发酵方法，其特征在于发酵液中铁盐的浓度为0.2 5mmol/L ；所述的发酵液中苯巴比妥衍生物的浓度为lmmol/L以下；所述的发酵液中表面活性剂的浓度为0. 1 0. 7mmol/L。
全文摘要
本发明涉及一种红霉素发酵方法。通过在红霉素链霉菌(Streptomyces Erythreus)发酵液中加入添加剂，调节发酵过程，显著降低了红霉素B杂质的含量，提高了效价。添加剂为铁盐、苯巴比妥衍生物、表面活性剂按一定比例配制而成的组合物。铁盐为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、氢氧化铁中的至少一种；苯巴比妥衍生物为苯巴比妥钠、甲乙炔巴比妥钠、司可巴比妥、2-硫代巴比妥酸中的至少一种；表面活性剂为壬基酚聚氧乙烯醚(4-N-NP2EO)、n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷中的至少一种。发酵液中铁盐的浓度为0.2～5mmol/L；发酵液中苯巴比妥衍生物的浓度为1mmol/L以下；发酵液中表面活性剂的浓度为0.1～0.7mmol/L。
文档编号C12P19/62GK102286578SQ20111020523
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月21日 优先权日2011年7月21日
发明者张翔, 张韬, 文跃强, 阳海, 黄耀宗 申请人:四川科伦药物研究有限公司