专利名称：一种富马酸生产方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，特别涉及一种富马酸的生产方法。
背景技术：
富马酸又名延胡索酸，学名反丁烯二酸。外观为白色、无气味的结晶粉末，有水果酸味，其酸味约为柠檬酸的1.5倍，可燃，在空气中稳定。富马酸是一种含有双键的二元羧酸，作为重要的有机化工原料和精细化工产品，广泛应用于食品及饲料添加剂、材料(树脂、涂料及增塑剂等)、医药、化工等领域。同时富马酸还是一种重要的四碳平台化合物，可以通过氨化、水合、加氢及异构等工艺生产L-天冬氨酸、琥珀酸、1，4_ 丁二醇、马来酸等四碳化合物，因此被美国能源部列为优先发展的12种平台化合物之一。当前工业上主要采用顺酐(又称马来酸酐)异构法生产富马酸，其他可以用来生产富马酸的工艺还包括糠醛氧化法、马来酸酶催化异构法、石蜡发酵法(又称假丝酵母发酵法)以及生物质原料发酵法等。富马酸的生产方法中顺酐异构法、马来酸酶催化异构法及石蜡发酵法采用的原料均为石油基产品，随着石油的枯竭及油价的大幅上涨，这些工艺不符合当前可持续发展的要求，且产品的市场竞争力越来越差。糠醛氧化法的原料虽说可以来自生物质原料，但该工艺的产品收率低、催化剂毒性大，不符合当前绿色环保的时代要求。生物法生产富马酸可以极大缩减原材料成本，避免化学法合成富马酸所带来的环境污染问题；通过代谢调控、基因改造、酶工程等手段是提高生物法生产富马酸的产率重要思路。正是由于这些原因，使得以可再生生物质为原料发酵生产包括富马酸在内的各种平台化合物成为各国政府今后发展的重点方向之一。20世纪初期就开始了霉菌发酵产富马酸的研究工作，随着科学技术的进步，富马酸得率一度到了 30% -40%。富马酸的生物合成法具体包括酶催化转化法和微生物发酵法。20世纪90年代中期出现的酶催化转化法一般都是以马来酸为底物，在马来酸异构酶作用下制备富马酸，但原料马来酸供应不足，且价格昂贵。20世纪70年代石油危机的出现，使得人们加大了对微生物发酵法制备富马酸的研究力度，这一时期人们用来发酵制备富马酸的微生物有霉菌、 酵母及细菌。其中根霉菌Miizopus为重点研究的对象，具体包括米根霉lihizopusoryzae、 少根根霉Rhizopusarrhizus以及黑根霉Rhizopusnigricans等。在这一时期，我国科学家对微生物发酵法生产富马酸的研究工作也进行了一定的探索，其中山西微生物研究所的白照熙等筛选出了具有产富马酸能力的少根根霉，当振荡培养于含有12%葡萄糖的培养基时，富马酸产量为53. 15g/L，得率为45%，同时产生了较多的副产物如苹果酸等，但发酵周期较长，需要11天左右(食品与发酵工业，1988)。美国Purdue大学的Tsao教授等利用米根霉发酵产富马酸，988/1初始葡萄糖发酵4811，其富马酸产量为338/1，得率为33.7(% (Bioprocess Biosyst Eng,2002，25 179 181)。目前全世界富马酸的生产能力为34万t/a，其中我国富马酸年产量达到5万t左右，供求基本处于持平状态。富马酸的主要消费领域为不饱和聚Ra树脂、纸浆料助剂、食品、医药等领域。我国富马酸的应用范围小，用途单一，随着其应用领域的不断拓展，尤其作
3为一种平台化合物从它出发可以合成很多四碳化合物，在石油资源日益枯竭的情况下，其应用前景将越来越广阔。因此，迫切需要一种廉价，高效生产富马酸的方法。生物酶法具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少和精制操作容易的优点，是一种较为有效的廉价生产富马酸的方法。本申请通过克隆表达富马酸酶，以L-苹果酸为原料，酶促反应催化脱水的方法通过体外酶法来制备富马酸，提供了一种廉价，高效生产富马酸的方法，具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少和精制操作容易的优点。本发明还优化了反应和分离条件，进一步提高了转化率和产品纯度。
发明内容
本发明提供克隆、并在大肠杆菌中表达一个来自嗜热栖热菌(Thermus Thermophilus HB8)的富马酸酶，其特征在于高表达量、高酶活、有机溶剂耐受及高温稳定性。本发明提供一种生物法生产富马酸的方法。前述方法采用一种以L-苹果酸为原料，酶促反应催化脱水的方法来制备富马酸。前述方法，其特征在于优化了反应和分离条件，提高了转化率和产品纯度。前述方法，其特征在于优化反应PH值，反应体系，特别是一定比例的有机溶剂的加入极大提高了转化效率。发明详述用分子生物学方法在大肠杆菌中克隆、表达一个来自嗜热栖热菌(Thermus Thermophilus HB8)的富马酸酶。提取该菌基因组后，设计引物，利用PCR方法扩增富马酸酶基因，通过酶切、连接构建基于pET22b (+)的表达载体，并测定其序列如序列2所示，编码如序列1所示的氨基酸序列。用该表达载体转化大肠杆菌BL21(DE!3)后用IPTG诱导，培养 12小时，离心收集菌体，超声破碎细胞，离心后取上清。上清在70摄氏度水浴20分钟使杂质蛋白变性，再次离心，去除杂质蛋白。通过富马酸酶酶法生产富马酸的方法，包括在含有有机溶剂的体系中进行酶反应，所述有机溶剂为甲醇或乙二醇；所述甲醇或乙二醇的浓度为50-70%。甲醇或乙二醇的浓度为50%或60% ；反应pH为7. 2-9. 0。反应时间为2_4h。
反应温度为60_80°C。所述酶法生产富马酸的方法在ImL体系中含有，50%的乙二醇，50mM Tris-HCl, IM L-苹果酸，20 μ L 6mg/mL的富马酸酶，pH值7.8，70°C反应3小时，苹果酸的转化率达到 54. 7%。所述富马酸酶来自嗜热栖热菌(Thermus Thermophilus)。所述富马酸酶的氨基酸序列如序列1所示。所述富马酸酶为与序列1的氨基酸序列相似度在80%以上的富马酸酶。所述富马酸酶的编码核酸序列为与序列2的核酸序列相似度在80%以上的富马酸酶基因。所述富马酸酶的热稳定性，在70摄氏度两天不失活。富马酸酶在弱碱性环境中具有较高酶活，在Tris-盐酸缓冲液pH7. 8中进行反应。
4配制Iml反应体系，含有IOOmM Tris-HCl，IOOmM L-苹果酸，0. 5 μ 1富马酸酶，pH值控制在 7. 8。本发明研究了几种代表性的亲水性有机溶剂如甲醇、乙二醇、叔丁醇，以不含有机溶剂反应体系做对比，选择较好的有机溶剂。类似上述反应条件，分别加入30%的有机溶剂，在70摄氏度反应，定时取样，测量吸光值。研究发现，甲醇和乙二醇对酶活基本没有影响，且反应平衡比不含有机溶剂反应体系更偏向富马酸，转化率最高达到了 35 %。而叔丁醇对酶活抑制较大，反应进行很慢。后续的研究采用甲醇和乙二醇。通过提高有机溶剂的比例可以进一步提高转化率，同样基于上述反应条件，分别研究了 50%、70%和90%的甲醇和乙二醇对反应的影响。在50%和70%的乙二醇中超过 40%的苹果酸转化为富马酸。较高浓度的甲醇和90%的乙二醇对酶活影响很大。通过研究富马酸酶的稳定性可以预计酶的使用时间，尽量延长酶的寿命，可以降低生产成本。分别研究了富马酸酶在50%-70%的乙二醇中的稳定性，发现，70摄氏度保温 48小时后，在50%乙二醇中酶活未有明显变化，而70%乙二醇使酶活有所降低。
图1 :DNA琼脂糖凝胶电泳。右侧为纯化后的富马酸酶基因PCR产物，约1400bp。 左侧为DNA大小标准品。图2 蛋白质SDS凝胶电泳。左侧起第一条为蛋白质分子量标准品；第二、第三条为70度热处理20分钟、30分钟并离心后的上清液，第四条为细胞破碎、离心后的上清液。 20分钟或30分钟热处理没有明显差异，但杂质蛋白质比未进行热处理的要少。图3 对比含不同有机溶剂与水系的转化百分率。图4 对比在不同浓度的有机溶剂中的转化百分率。图5 富马酸酶的热稳定性。图6 纯化后的富马酸，㈧为气相质谱图，⑶为荷质比，对比数据库鉴定该物质为富马酸。图7 富马酸酶的结构示意图(PDB =IFUP)。右侧为亚基A，左侧为亚基B。图中显示的氨基酸侧链为亚基A118位的组氨酸(中间右侧)和亚基B331位的谷氨酸(中间左侧)，其它氨基酸侧链均未显示。
具体实施例方式本发明中酶活的定义为一分钟内转化1 μ mol底物定义为IU实施例1富马酸酶基因的克隆表达以及序列测定嗜热栖热菌Thermus thermophilus HB8 (CICC10347)购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。菌种活化后，接种于50ml LB培养基中，在65摄氏度水浴摇床中培养40小时后，SOOOrpm离心IOmin收集菌体。基因组DNA提取采用北京博迈德科技发展有限公司提供的细菌基因组提取试剂盒(具体方法参见说明书)。PCR扩增富马酸酶基因使用如下引物，5' -GGAATTCcatatggaataccggattgagcgggaca-3'5， -CCCAAGCTTGctacgccccctcgtggggctt-3，
PCR 反应体系含有 0. 2 μ L 基因组 DNA，0. 2 μ L Taq 聚合酶，0. 4 μ L dNTPs, 2 μ L 缓冲液，引物各0. 5 μ L，加双蒸水补至20 μ Lo反应条件为预变性95度5min, 95度变性Imin, 退火65度lmin，延伸72度1. 5min,循环30次。PCR产物用1 %的琼脂糖进行凝胶电泳， 所得到的约1400bp条(如图1所示)带进行切胶回收、纯化后，用限制性内切酶NdeI和 HindIII在37度酶切3小时。表达载体pET22b (+)在同样条件下处理。得到的酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分离、回收。纯化后，两个酶切产物用T4连接酶在16度连接16小时。用该连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，涂布带有氨苄抗性LB琼脂平板，37度过夜培养后，挑取适量菌斑，在LB培养基中过夜培养，用试剂盒提取质粒，测序验证插入片段，并测定其序列如序列2所示，编码如序列1所示的氨基酸序列。带有正确插入片段的表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得到重组富马酸酶大肠杆菌。来自嗜热栖热菌HB8的富马酸酶基因由1401个碱基编码，GC含量为67%，起始密码子是较稀有的GTG，转译由TAG结束。富马酸酶基因共编码了 466个氨基酸。这个富马酸酶属于II类富马酸酶(EC 4.2. 1.2)，即不需要金属离子或辅因子，亦称为富马酸酶C。在自然条件下，富马酸酶为4聚体，由4个相同的亚基构成。活性中心的部分关键氨基酸如图 7所示，亚基A (图右)188位的组氨酸在亚基B (图左)331位的谷氨酸辅助下夺去苹果酸 C3位上的质子，形成烯醇式中间体，然后在139、140位的丝氨酸辅助下脱去羟基，然后异构形成富马酸。实施例2富马酸酶的制备将上步获得的重组富马酸酶大肠杆菌接种于50mL LB培养基中于37度培养，再转接到IL LB培养基中培养至0D600约0. 8，用0. 4mM的IPTG诱导，过夜培养，然后8000rpm 离心收集菌体。用40mL的Tris-HCl缓冲液(lOOmM，pH7. 8)重悬后，进行超声波破碎。离心后取上清。70度热变性30min，然后12000rpm离心lOmin，去除部分大肠杆菌蛋白(如图 2所示)。酶液用Bradford法测定蛋白含量(参见精编分子生物学实验指南，科学出版社， 1999)，每升LB培养基的重组富马酸酶大肠杆菌可以得到19aiig富马酸酶。实施例3富马酸酶酶活的测定酶活测定及反应均在pH7. 2-9. 0的偏碱性环境及温度60-80°C条件下进行，并确定最适PH为7.8，最适温度701(最适pH和温度是否作了，可否这么写)。具体酶活测定方法为取0. 5 μ L富马酸酶(6mg/mL)加入ImL含有IOOmM Tris-HCl和IOOmM L-苹果酸的反应液中，反应液pH为7. 8。70度水浴反应Imin后取30 μ L 用上述25度的缓冲稀释至3mL冷却终止反应，在250nm处测定光吸收，以未加富马酸酶的反应液为对照，增加的光吸收为0. 0171，即酶催化产生的富马酸。在250nm波长下，摩尔光吸收系数为1. 479X103M^Cm^10经计算得到2312U/mL,或385U/mg蛋白，总收率为73920酶活单位每升采用LB培养基的发酵液。实施例4富马酸酶反应体系的优化1.有机溶剂的选择富马酸酶催化下的苹果酸与富马酸的转化为可逆反应，反应平衡取决于反应体系中水的含量，因此，添加亲水性有机溶剂可以有利于脱水反应。通过研究对比几种代表性的亲水性有机溶剂如甲醇、乙二醇、叔丁醇和不含有机溶剂反应体系，可以找到较好的有机溶剂。在ImL的反应体系中含有70mM的Tris_HCl，IOOmM的L-苹果酸分别加入30%的甲
6醇、乙二醇、叔丁醇和水，PH值为7. 8，首先分别取样30 μ L稀释至3mL作为空白对照。加入 3 μ L富马酸酶(6mg/mL)，充分混合后在70摄氏度反应，于10、30、60、120、240、360分钟取样30 μ L用25度的缓冲稀释并冷却终止反应，测量吸光值。如图3所示，在反应到240分钟时，反应趋于平衡，在含甲醇和乙二醇的体系中反应平衡比不含有机溶剂反应体系更偏向富马酸，转化率达到了 30%以上。而叔丁醇对酶抑制较大，反应进行很慢。本发明的有机溶剂采用甲醇和乙二醇。2.有机溶剂用量的确定提高有机溶剂的比例可以减少水的含量，进一步提高转化率。在ImL的反应体系中分别含有50、30、10mM的Tris-HCl，IOOmM的L-苹果酸禾口 50%、70%、90%的甲醇或乙二醇，PH值为7. 8，首先分别取样30 μ L稀释至3mL作为空白对照。力Π入3 μ L富马酸酶(6mg/ mL)，充分混合后在70摄氏度反应，于10、30、60、120、240、360分钟取样30 μ L用25摄氏度的缓冲稀释并冷却终止反应，测量吸光值。如图4所示，在反应进行到240分钟时，反应趋于平衡。在50%-70%的乙二醇中40%的苹果酸转化为富马酸。高浓度的甲醇和90%的乙二醇对酶抑制很大，只有不足10%的苹果酸转化为富马酸。实施例5有机溶剂对富马酸酶活性的影响研究富马酸酶的模拟反应条件下的稳定性可以预计酶的使用时间，选择合适的反应条件，尽量延长酶的寿命，可以降低生产成本。分别研究了富马酸酶在50%和70%的乙二醇中的稳定性，图5显示，70摄氏度保温48小时后，在50%乙二醇中酶活未有明显变化， 而70%乙二醇使酶活降低到初始酶活的80%。实施例6优化反应条件后的产率采用上述优化后的反应条件，反应体系如下在IOOmL体系中含有，50%的乙二醇，50mM Tris-HC1,1M L-苹果酸，2mL富马酸酶(6mg/mL)，pH值控制在7.8。70摄氏度反应3小时后，有7%的苹果酸转化为富马酸。实施例7富马酸纯度的测定取Img真空干燥固体粉末，溶于ImL乙腈，取出50 μ L到新试管，加入等体积三甲基硅烷衍生化，室温反应池。乙腈稀释10倍后，经气相质谱鉴定，如图6所示，产品为富马酸，未有明显苹果酸被检出。气相质谱条件为气相色谱型号为GC-2010，质谱型号为 GCMS-QP2010，均由岛津公司(SHIMADZU)提供；柱箱温度80°C，进样口温度300°C，进样模式为分流模式，分流比20，载气为氦气，柱流量0. 80mL/min ；初始温度80. 0°C，保持2min，以 25. O0C /min 升温至 300. 0°C，保持 2. 5min ；色谱柱采用 HP_5ms (30m X 0. 1 μ m X 0. 25mm)； 离子源温度200°C，界面温度250°C，溶剂切割时间anin。
权利要求
1.一种通过富马酸酶酶法生产富马酸的方法，包括在含有有机溶剂的体系中进行酶反应，所述有机溶剂为甲醇或乙二醇；所述甲醇或乙二醇的浓度为50-70%。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于甲醇或乙二醇的浓度为50%或60%。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于反应pH为7.2-9. 0 ；反应时间为2-4h ；反应温度为60-80°C。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于在IOOmL体系中含有，50%的乙二醇，50mM Tris-HCl, IML-苹果酸，2mL 6mg/mL的富马酸酶，pH值7. 8，70°C反应3小时。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于苹果酸的转化率达到7%。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于一个来自嗜热栖热菌(Thermus Thermophilus)的富马酸酶。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述富马酸酶的氨基酸序列如序列1所示。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述富马酸酶为与序列1的氨基酸序列相似度在80%以上的富马酸酶。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述富马酸酶的编码核酸序列为与序列2 的核酸序列相似度在80%以上的富马酸酶基因。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述富马酸酶的热稳定性，在70°c两天不失活。
全文摘要
本发明公开了一种富马酸生产方法，从嗜热栖热菌(Thermus Thermophilus HB8)中克隆到一种富马酸酶基因，并在大肠杆菌中成功表达了该基因，测定了其最适pH，最适温度等酶学性质，发现该酶具有良好的热稳定性和有机溶剂耐受，进而将其应用于富马酸生产，通过调整加入有机溶剂的种类和浓度，优化了富马酸的生产条件，将苹果酸的转化率提高到54.7％，极大提高了转化效率。
文档编号C12P7/46GK102399829SQ20111040157
公开日2012年4月4日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者刘珞, 宋嘉宁, 王芳, 谭天伟, 邓利 申请人:北京化工大学