专利名称：一株产胞外多糖的植物乳杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株产胞外多糖的植物乳杆菌
(Lactobacillus plantarum) ^ *口口口巾白勺I^ffi0
背景技术：
乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)是一类能利用可发酵性糖产生大量乳酸的细菌总称，目前在自然界已发现的这类细菌在分类学上至少有23个属。在食品、医药等领域应用较多的乳酸菌主要有乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等。乳酸菌是益生菌最主要的来源，许多乳酸菌是人体肠道固有的益生菌，已具有改善人体肠道菌群，调节机体免疫力，抑肿瘤，降低血清胆固醇，调节血压等重要的生理活性。人类对乳酸菌在发酵乳制品和微生态制剂中的应用已取得了显著的进展。目前研究的热点是如何通过新型微生物发酵剂的开发而赋予发酵乳特定的功能性质。已知的乳酸菌发挥主要功能特性的作用机理，除了定殖、通过主要代谢产物(乳酸等)改善肠道内环境等以外，一些次生代谢产物如细菌素、胞外多糖等也发挥着非常重要的作用。其中具有理论和实际应用价值的乳酸菌胞外多糖(LAB EPS)引起了国内外许多学者的研究兴趣。多糖是指由二十个以上单糖组成的糖类化合物。根据来源不同，多糖可以分为植物多糖、动物多糖和微生物多糖。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌产生并分泌到细胞外的一种多糖。乳酸菌胞外多糖具有重要的工艺学功能，对酸乳、干酪及绝大多数发酵乳制品的流变性质、质构、口感以及风味具有重要的影响。乳酸菌胞外多糖可以改善乳制品的流变学特性和质构特性。由于天然增稠作用由产粘乳杆菌与非产粘球菌混合发酵形成的酸乳与非产粘菌株形成的酸乳相比口感滑润、粘度增加；产胞外多糖乳酸菌能够赋予酸乳更强的持水力，从而避免乳清析出；此外，产胞外多糖而产生的持水性增强有助于提高干酪等产品的得率。乳酸菌胞外多糖还具有良好的生理功能，如增强黏膜吸附作用、抗肿瘤、抗溃疡、免疫调节、降胆固醇、降血压等。因此，开展产胞外多糖乳酸菌的研究，对于改善乳制品生产加工、开发具有特定功能性质的乳酸菌发酵乳制品，具有十分重要的研究意义和经济价值。开发具有益生功能的LAB EPS成为目前研究的热点。20世纪60年代以来，多糖被认为是一种广谱的非特异性的促进剂，在人类免疫中，可增强宿主细胞的细胞免疫和体液免疫功能，如激活巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等，激活补体及诱导产生干扰素等，其作用将是激活人体的非特异性防御机能，在抗病毒、 抗肿瘤、抗辐射等方面有很好的疗效。(周世文，徐传福.多糖的免疫药理作用.中国生化药物杂志，1994，15 O) :143-147)。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对现有技术中缺乏高产胞外多糖的乳酸菌的不足，提供一株较高产胞外多糖的植物乳杆菌(Lactokicillus plantarum)。本发明的技术方案如下
本发明技术方案一一株产胞外多糖的植物乳杆菌(LactcAacillus ρlantarum)， 其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 5222。本发明的技术方案二 一种植物乳杆菌CGMCC No. 5222的工作发酵剂，由包括以下步骤(a)或(b)的方法制备而得(a)将植物乳杆菌CGMCC No. 5222菌种接种于添加乳清蛋白的灭菌乳中培养至凝乳，连续培养活化两代作为母发酵剂；将母发酵剂按3-5% (ν/ν)接种于添加乳清蛋白的灭菌乳中培养至凝乳，即得工作发酵剂；(b)将植物乳杆菌CGMCC No. 5222菌种接种于液体培养基中连续活化两代，然后将活化培养物按2-4% (ν/ν)接种于液体培养基中培养16-1 ,固液分离得到细胞沉淀，将沉淀用无菌乳悬浮，即得工作发酵剂。步骤(a)中，灭菌乳中添加乳清蛋白的量优选0. 5-5% (wt)，更优选(wt)。培养至凝乳的方法是常规方法，较佳的在37°C条件下培养14-1他。步骤(b)中，在液体培养基中活化的方法是植物乳杆菌的常规活化方法，较佳的在37°C条件下培养12-1他。所用的液体培养基是常规的植物乳杆菌液体培养基，较佳的如 MRS液体培养基。固液分离的方法是常规的菌体发酵液的固液分离方法，包括离心法、过滤法等，本发明优选离心法，更优选在4°C条件下4000r/min离心15min。本发明所述的植物乳杆菌CGMCC No. 5222的工作发酵剂中，活菌数优选109cfu/mL 以上。本发明技术方案三植物乳杆菌CGMCC No. 5222在发酵食品中的用途。其中，所述的发酵食品是常规的发酵类食品，优选乳酸菌奶饮料或者发酵乳。优选的，所述的乳酸菌奶饮料是按照下述步骤制备的原料乳灭菌后冷却然后加入植物乳杆菌CGMCC No. 5222工作发酵剂混合均勻，使植物乳杆菌CGMCC No. 5222浓度达到IO6CfuAiL以上，即得到含有所述植物乳杆菌的乳酸菌奶饮料。其中，所述的灭菌方法是常规的原料如灭菌方法，较佳的如超高温瞬时灭菌 (140°C下高温热杀菌k)。待灭菌乳冷却后再加入所述的植物乳杆菌工作发酵剂，冷却温度常规，较佳的冷却到40°C。优选的，所述的发酵乳是按照下述步骤制备的原料乳灭菌后冷却然后加入 3-5% (V/V)植物乳杆菌CGMCC No. 5222工作发酵剂和3_5% (V/V)可共生的发酵乳商品发酵剂，混勻后发酵至滴定酸度以乳酸计0. 6-0. 7，即得到含有所述植物乳杆菌的发酵乳。其中，所述的灭菌方法是常规的原料如灭菌方法，较佳的如超高温瞬时灭菌 (140°C下高温热杀菌2s)，更佳的如在95°C下加热杀菌20min。待灭菌乳冷却后再加入所述的植物乳杆菌工作发酵剂，冷却温度常规，较佳的冷却到37°C。发酵温度常规，较佳的为 37°C。可共生的发酵乳商品发酵剂是常规的商品发酵剂，如保加利亚乳杆菌。本发明的技术方案四从植物乳杆菌CGMCC No. 5222中提取的胞外多糖。其中，所述的提取的方法是常规的微生物胞外多糖的提取方法，优选的包括将植物乳杆菌CGMCC No. 5222的发酵液煮沸后离心以除去菌体和凝结蛋白，上清液用三氯乙酸法沉淀除去蛋白，然后用醇沉淀，沉淀溶解于水后再用水透析。其中，所述的植物乳杆菌的发酵液是常规的植物乳杆菌发酵液，较佳的是将所述的植物乳杆菌以5% (V/V)的接种量接种于含(w/v)葡萄糖的12% (w/w)脱脂乳中发酵培养而得的发酵液。较佳的是在30°C条件下培养30h而得发酵液。其中，优选的离心条件是20min，IOOOOg, 4°C。三氯乙酸法是除蛋白的常规方法，较佳的添加三氯乙酸至终浓度4% (w/v)，静置过夜，4°C，10000g，离心20min除去沉淀蛋白。 醇沉淀法也是常规的方法，较佳的采用乙醇，加乙醇至终浓度75% (v/v)，4°C静置Mh，离心(20min, IOOOOg,4°C )取沉淀。本发明的技术方案五所述的从植物乳杆菌CGMCC No. 5222中提取的胞外多糖在增强免疫药物、保健品或食品中的用途。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明提供了一株植物乳杆菌CGMCC No. 5222，经试验证明它具有产胞外多糖的特征，并且与其它植物乳杆菌产胞外多糖的量不同，是一株新分离鉴定的植物乳杆菌菌株。所产的胞外多糖能够刺激B淋巴细胞增殖，增强免疫，在提高免疫力的药品、保健品、食品的应用方面具有广阔的前景。保藏信息本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株BDLP0001，已于2011 年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编:100101，其保藏编号为CGMCC No. 5222。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1示本发明所述植物乳杆菌CGMCCNo. 5222的菌落形态。图2示本发明所述植物乳杆菌CGMCCNo. 5222的细胞形态(X 1000)。图3示本发明所述植物乳杆菌CGMCCNo. 5222的生长曲线。图4示本发明所述植物乳杆菌CGMCCNo. 5222的最适生长温度。图5示本发明所述植物乳杆菌CGMCCNo. 5222的最适pH。
具体实施例方式本发明从乳酸菌生境中采集样品，筛选产胞外多糖的乳酸菌野生菌株，并通过体外T/B淋巴细胞增殖实验初步确定多糖的免疫活性。本发明从自然发酵的泡菜中筛选出一株乳酸菌BDLP0001，利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性及其遗传特性16s rDNA将该乳酸菌BDLP0001鉴定为植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum)，该菌株已于2011年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No. 5222。本发明植物乳杆菌CGMCC No. 5222的形态学特征菌落特征菌株在MRS平板上划线分离，37°C厌氧培养48h，菌株生长良好。其菌落形态如图1所示。菌落为圆形，凸起，边缘整齐，颜色乳白色稍微有点偏黄，不透明，表面湿润光滑，挑取能拉丝。菌体特征菌体呈杆状(图幻，多排列成长短不一的链状，也有单个分散排列，菌体大小一般为0. 6 μ mX 1. 5 μ m，不产芽孢，革兰氏染色阳性。本发明植物乳杆菌CGMCC No. 5222的培养特征
植物乳杆菌BDLP0001的最低生长温度为15°C，最高生长温度为40°C，在30_40°C 生长温度最佳；最高和最低初始生长pH为9. 0和4. 0，最适生长初始pH为5. 0 ；菌株 BDLPOOO 1的延迟期相对较短，ai进入对数生长期，IOh达到稳定期；菌株在胆盐浓度 0. 1% -0. 4%范围内生长良好，具有良好的胆盐耐受性；BDLP 0001在彡7% NaCl浓度下生长良好，能够耐受8% NaCl。本发明的植物乳杆菌BDLP0001来源于传统发酵食品，属公认安全(Generally Recognized As Safe, GRAS)菌种，可用于乳酸菌食品中。因此，本发明还涉及所述的植物乳杆菌BDLP0001在发酵食品中的用途。所述含有植物乳杆菌BDLP0001的发酵食品包括乳酸菌奶饮料和发酵乳。本发明还提供所述植物乳杆菌BDLP0001工作发酵剂。本发明工作发酵剂较佳的是采用下述制备方法制备的将植物乳杆菌BDLP0001 菌种接种于添加乳清蛋白(WPC)的12% (w/v)在115°C灭菌15min的脱脂乳中，在37°C 条件下培养14-1 至凝乳，连续培养活化两代，作为母发酵剂使用；将母发酵剂按3-5% (ν/ν)接种于上述的灭菌乳中，培养14-1 !至凝乳，此时凝乳中活菌数约在109cfu/mL，得到所述的工作发酵剂；或者将植物乳杆菌BDLP0001菌种接种于MRS液体培养基中，在37°C 条件下培养12-1 进行活化，连续活化两代，然后将活化培养物按2-4% (ν/ν)接种于MRS 液体培养基中，培养16-1 1，在4°C条件下4000r/min离心15min，去除上清液，得到细胞沉淀，将沉淀用一定量的无菌脱脂乳悬浮，得到所述的工作发酵剂。本发明中优选的所述的乳酸菌奶饮料是按照下述步骤制备得到的原料乳在 95°C下加热杀菌20min或在140°C下高温热杀菌k，然后冷却到40°C，再加入所述的植物乳杆菌BDLP0001工作发酵剂，使其浓度达到IO6CfuAiL以上，在4°C冷藏保存即得到含有植物乳杆菌BDLP0001的乳酸菌奶饮料。本发明中优选的所述的发酵乳是按照下述步骤制备得到的原料乳在95°C下加热杀菌20min或在140°C下高温热杀菌k，然后冷却到37°C，再按照3-5% (V/V)加入所述植物乳杆菌BDLP0001，再加入3-5% (V/V)可共生的制备发酵乳商品发酵剂，混勻后在37°C 下混菌发酵至滴定酸度以乳酸计0. 6-0. 7，然后冷却至40°C，再进行冷藏保存得到含有植物乳杆菌BDLP0001的发酵乳。下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。实施例1植物乳杆菌BDLP 0001的采集、分离(1)、样品采集从自然发酵的泡菜、传统发酵乳制品(酸奶、酸马奶酒等)、生牛乳、生面团、发酵香肠、腊肠、开菲尔粒(藏灵菇)、青贮饲料、婴儿粪便等中取样。将收集的样品放入冰盒内冷藏，保持在较低温度下带回实验室并放置于4°C冰箱内，尽快将乳酸菌进行分离。O)、样品预处理取固体样品20g(液体样品20mL)放入装有ISOmL 0. 无菌蛋白胨水(蛋白胨 lg，蒸馏水IOOOg)的250mL三角瓶(含玻璃珠)中，振荡后静置20min，备用。(3)、产糖菌株的初步分离
使用0. 无菌蛋白胨水以体积计按照1 10对上述样品进行连续稀释，在每个稀释度取0. ImL稀释样品，分别涂布MRS琼脂平板、M17琼脂平板和SM琼脂平板，Modified MRS琼脂平板和ESM平板，在37°C厌氧条件下恒温培养对-4他，用无菌牙签挑取粘稠且有明显拉丝的单菌落。然后在相应的琼脂平板上划线分纯，得到纯的单菌落，进行革兰氏染色， 接触酶实验。纯化菌株保藏在相应的分离培养基中，添加20%的甘油作为保护剂，-20°C冻存。其中使用的培养基配方如下SM培养基(g/L) :120g脱脂乳粉，IOg葡萄糖，880g水。ESM培养基(g/L) :90g脱脂乳粉，3.5g酵母抽提物，3.5g蛋白胨，20g葡萄糖。 (Van den Berg, D. J. C. , A. Smits, B. Pot, Α. Μ. Ledeboer, K. Kersters, J. Μ. Α. Verbakel, and C. Τ. Verrips. 1993. Isolation, screening and identification of lactic acid bacteria from traditional food process and culture collections. Food Biotechnol. 7 :189-205.)MRS培养基(乳杆菌选择性培养基，德国Merck公司购得)。M17培养基(乳球菌培养基BD Difco公司)。Modified MRS培养基MRS培养基中葡萄糖的含量改为50g/L，其他组分不变。不同样品在MRS琼脂培养基、M17琼脂培养基、Modified MRS琼脂平板、ESM琼脂培养基和SM琼脂培养基上共分离出700株菌。这些菌株在分离平板上表现出粘丝状、粘稠状和粘液状。(4)菌株产胞外多糖将从平板上得到的分离株接种到MRS液体培养基中培养18h，再按(V/V)的接种量接种到含50g/L葡萄糖的MRS液体培养基中，在30°C发酵Mh。量取20mL培养液， 沸水浴lOmin，冷却到室温，上清液加入80%质量分数的三氯乙酸至终浓度4% (m/v),4°C 静置过夜，IOOOOg离心20min，轻倾上清液于截留分子量14000的透析袋中，去离子水透析 72h，每换水一次，定容。采用硫酸-苯酚法(Dubois Μ, Gilles KA，Hamilton JK, Pebers PA, Smith F. (1956). Colorimetric method of determination of sugars and related substances. Analytical chemistry. 28(3) :350-356.)测定胞外多糖的含量。实验结果列于表1中。从表中可以看出，菌株9-9产的粗多糖的产量相对较高，结合菌落的拉丝性能， 选取这株菌，命名为BDLP0001。表1.产胞外多糖乳酸菌的初步分离(30°C，24h培养)
权利要求
1.一株产胞外多糖的植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum)，其特征在于，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 5222。
2.一种如权利要求1所述的植物乳杆菌的工作发酵剂，其特征在于，由包括以下步骤 (a)或(b)的方法制备而得(a)将如权利要求1所述的植物乳杆菌菌种接种于添加乳清蛋白的灭菌乳中培养至凝乳，连续培养活化两代作为母发酵剂；将母发酵剂按3-5% (ν/ν)接种于添加乳清蛋白的灭菌乳中培养至凝乳，即得工作发酵剂；(b)将如权利要求1所述的植物乳杆菌菌种接种于液体培养基中连续活化两代，然后将活化培养物按2-4% (ν/ν)接种于液体培养基中培养16-1 ,固液分离得到细胞沉淀，将沉淀用无菌乳悬浮，即得工作发酵剂。
3.如权利要求2所述的植物乳杆菌的工作发酵剂，其特征在于，所述的工作发酵剂中活菌数为109Cfu/mL以上。
4.植物乳杆菌CGMCCNo. 5222在发酵食品中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的发酵食品是乳酸菌奶饮料或者发酵乳。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的乳酸菌奶饮料是按照下述步骤制备的原料乳灭菌后冷却然后加入如权利要求2所述的植物乳杆菌的工作发酵剂混合均勻，使所述的植物乳杆菌浓度达到IO6CfuAiL以上，即得到含有所述植物乳杆菌的乳酸菌奶饮料。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的发酵乳是按照下述步骤制备的 原料乳灭菌后冷却然后加入3-5% (V/V)如权利要求2所述的植物乳杆菌的工作发酵剂和 3-5% (V/V)可共生的发酵乳商品发酵剂，混勻后发酵至滴定酸度以乳酸计0.6-0. 7，即得到含有所述植物乳杆菌的发酵乳。
8.从权利要求1所述的植物乳杆菌中提取的胞外多糖。
9.如权利要求8所述的胞外多糖，其特征在于，所述的提取的方法包括将权利要求1 所述的植物乳杆菌的发酵液煮沸后离心以除去菌体和凝结蛋白，上清液用三氯乙酸法沉淀除去蛋白，然后用醇沉淀，沉淀溶解于水后再用水透析。
10.如权利要求8或9所述的胞外多糖在增强免疫药物、保健品或食品中的用途。
全文摘要
本发明公开了一株产胞外多糖的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)及其应用，其保藏编号CGMCC No.5222。经试验证明它具有产胞外多糖的特征，并且与其它植物乳杆菌产胞外多糖的量不同，是一株新分离鉴定的植物乳杆菌菌株，具有独特的生理生化特征和遗传背景。所产的胞外多糖能够刺激B淋巴细胞增殖，增强免疫，在提高免疫力的药品、保健品、食品的应用方面具有广阔的前景。
文档编号A23C9/123GK102453689SQ20111040120
公开日2012年5月16日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者吴正钧, 孙克杰, 张灏, 杭锋, 艾连中, 邵丽, 郭本恒, 陈万义, 陈卫 申请人:光明乳业股份有限公司