专利名称：一株生产重组猪杀菌蛋白的基因工程菌及其构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域，主要涉及一株生产重组猪杀菌蛋白的基因工程菌及其构建方法以及应用。
背景技术：
我国是世界第一大猪肉生产国，猪的存栏量、出栏量、屠宰量、猪肉总产量均居世界首位，但是由病原菌引发的传染病每年给养猪生产造成巨大的损失，严重影响我国养猪业与畜牧业的经济增长及出口创汇。目前对传染病的控制主要采用疫苗接种和抗生素治疗，疫苗的使用并不总是有效，而抗生素在预防和治疗猪细菌性疾病中确实发挥了重要作用，但长期大量使用带来了许多危害，其中突出的是造成病原菌广泛而严重的耐药性和药物残留，耐药性使得疫苗和抗生素对疾病预防无效，且药物残留严重影响肉品质，甚至危害人类健康。因此寻找无毒副作用、无残留、能高效控制疾病传染的天然杀菌药物，已成为十分紧迫的任务。革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria, GNB)包括大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎杆菌等20余种病原菌，其共同特点之一是细胞壁外膜的主要成分是脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)或称内毒素(endotoxin),是决定GNB细菌感染(如脓毒症和感染性休克)的主要致病因子，与其他许多疾病有着密切的关系，如Crohn病、溃疡性大肠炎、新生儿坏死性小肠结肠炎、急性胰腺炎、肝硬化、酒精性肝病、阻塞性黄疸、牙周疾病等)、呼吸系统(如囊胞性纤维化、哮喘等)、心血管系统(如冠状动脉硬化)、泌尿系统(如溶血性尿毒综合征、血透或腹膜透析并发症)等多个系统疾病。近年研究证明，内毒素结合蛋白(endotoxin binding protein, EBP)及其受体系统在机体识别和调控内毒素作用中起重要作用，内毒素通过其增敏或抑制作用而发挥生物学效应，其中杀菌通透性增加蛋白 (bact ericidal/permeability increasing protein, BPI)起至丨J关键作用。杀菌蛋白对革兰阴性菌具有杀伤作用，在机体内被称为“超级抗生素”。它不仅具有杀菌和中和内毒素的双重抗感染活性，还具有抗真菌、促进补体活化、增强吞噬的调理功能、抑制血管生成和抗原虫等一系列生物学功能，很有希望成为一种新型抗菌蛋白药物。程玉磊(2006)和祁克宗等(2006)仅克隆了猪BPIN端基因约140bp，且没有对该片段的表达及功能进行研究。秦孝建等(1999)报道的BPI功能区合成肽对光滑型G具有杀菌活性，周红和肖光夏(1996)和周红等(2002)对猪源BPI (从猪PMNs分离猪BPI)体外生物活性进行研究，证实具有杀菌功能。到目前为止，国内外尚无重组猪杀菌蛋白功能研究的相关报道。
发明内容
本发明的目的是构建一株生产重组猪杀菌蛋白基因工程菌，并提出其构建方法。本发明的另一目的是该生产重组猪杀菌蛋白基因工程菌的应用。本发明的技术方案应用RT-PCR技术，克隆猪杀菌蛋白基因的开放阅读框5’端片段678bp，将其整合到大肠杆菌表达载体pET32a(+)上，转化Esherichia coli BL21(DE3),得到重组子，构建重组子文库，经筛选，最终得到一株能稳定生产重组猪杀菌蛋白的基因工程菌。一种猪杀菌蛋白基因工程菌，其分类命名为大肠杆菌BL21 (DE3) -pET32a (+) -pBPI N (Escherichia coli BL21 (DE3)-pET32a(+)-pBPIN)，已保藏于中国典型培养物保藏中心， 其保藏编号为CCTCC M 2011252。CCTCC M 2011252基因工程菌的构建，从黔邵花猪肝脏组织中提取RNA，进行 RT-PCR扩增，引物Forward Primer 5/ -GCAAGGATCCATGGCCAGGGGCGCTGAC-3'Reverse Primer 5/ -CCATCTCGAGTTATTTTTTTCACTTTGGCTGTCACTGGCAG-3逆转录TotalRNA 4 μ I ( ^ 5 μ g) , random hexamer primer I μ I, DEPC-H207 μ 1，轻轻混合，离心沉淀，总体积12 μ 1，65°C温育5min,轻柔离心，冰上冷却；然后加入 5Xreaction buffer 4 μ I, Ribonuclease inhibitor (20u/ μ I) I μ I, IOmM dNTP mix 2 μ I, Rever Transcriptase (200u/ μ I) I μ I,总体积 20 μ 1，轻轻混合，离心沉淀，25°C 温育5min，再42°C温育60min，然后70°C温育5min，合成的cDNA于_20°C保存备用。PCR 反应体系200 μ I PCR 管，依次加入 dd-water 7. 2 μ I, MasterMix 10 μ I, Sense Primer (10 μ m) 0. 4 μ I, Anti-sense Primer (10 μ m) O. 4 μ I,模板 cDNA 2 μ I,混勻， 轻度尚心。PCR 反应程序首先 94°C 3min，然后 94°C 30s，57°C 30s, 72°C 45s 循环 35 次，后延伸 72°C IOmin0将其用BamHl和Xhol酶切后连接到大肠杆菌表达载体pET32a (+)上，得到重组载体 E. coli pET32a(+)-pBPIN，用氯化钙法转化 Esherichia coli BL21(DE3)得到重组大肠埃希氏菌(E.coli BL21 (DE3) -pET32a (+) -pBPIN) CCTCCM2011252 经筛选获得的CCTCC M 2011252，在LB培养基中用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)诱导表达，进行SDS-PAGE检测，确定重组猪杀菌蛋白的表达纯度和表达量，采用柱纯化法纯化目标重组猪杀菌蛋白，用分光光度计定量所得到的重组猪杀菌蛋白。体外杀菌活性检测将回收的杀菌蛋白作用于非致病性大肠杆菌JM109、沙门氏菌(猪霍乱沙门氏菌S. choleraesuis和鼠伤寒沙门氏菌S. typhimurium),发现重组杀菌蛋白有明显的杀菌作用。生物材料样品保藏一株生产重组猪杀菌蛋白的基因工程菌，其分类命名为大肠埃希氏菌E.coli BL21 (DE3)-pET32a(+)-pBPIN,已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2011252。保藏时间为2011年7月13日。
下面结合附图进一步描述本发明。图I是重组猪BPI肽的杀菌曲线。图2是温度对重组猪BPI肽杀灭E.图3是温度对重组猪BPI肽杀灭S.图4是温度对重组猪BPI肽杀灭S.
coli能力的影响。 typhimurium能力的影响。 chloleraesuis能力的影响。
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具体实施例方式以下实施例更为详细地解释了本发明的技术关键点，为更好地理解本发明提供依据。实施例I构建从黔邵花猪肝脏组织中提取RNA，进行RT-PCR扩增，引物Forward Primer 5/ -GCAAGGATCCATGGCCAGGGGCGCTGAC-3'Reverse Primer 5/ ~CCATCTCGAGTTATTTTTTTCACTTTGGCTGTCACTGGCAG~3逆转录在500 μ I 离心管中加入 Total RNA 4 μ I ( < 5 μ g), random hexamer primer I μ I, DEPC-H2O 7 μ I,轻轻混合，离心沉淀，总体积12 μ 1,65°C温育5min,轻柔离心，冰上冷却；然后加入 5Xreaction buffer 4 μ I, Ribonuclease inhibitor (20u/ μ I) I μ I, IOmM dNTP mix 2 μ I, Rever Transcriptase (200u/ μ I) I μ I,总体积 20 μ I,轻轻混合，离心沉淀，25°C温育5min，再42°C温育60min，然后70°C温育5min，合成的cDNA 于-20°C保存备用。200 μ I PCR 管中按顺序加入 dd-water 7. 2 μ I, MasterMix 10 μ I, Forward Primer (10 μ m) 0. 4 μ I, Reverse Primer (10 μ m) 0. 4 μ I, dNTP mix (IOmM) 0. 5 μ I,模板 cDNA 2 μ 1，混匀，轻度离心。按下列程序进行PCR扩增94°C预变性3min，94°C变性30s， 57°C退火30s, 72°C延伸45s, 35个循环，72°C后延伸IOmin0PCR产物经I. 2%琼脂糖电泳分离，回收700bp左右的片段，用BamHl和Xhol酶切后，连接表达载体pET32a(+)，转化Esherichia coli BL21 (DE3)，涂布抗性平板，构建重组
子文库。对获得的重组子进行筛选鉴定，选出表达重组猪杀菌蛋白效果较好的菌株。实施例2应用将大肠杆菌、猪副伤寒沙门氏菌、鼠沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分别接种于固体培养基中，37°C培养16 18h，挑取单克隆于LB培养液中培养14h，再转移至新鲜LB培养液中培养至对数生长期(约4h)，用LB培养液调整细菌浓度至I X 105cfu/mL。选择恰当的重组猪BPI肽浓度，测定其对大肠杆菌、猪副伤寒沙门氏菌、鼠沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的时间-杀菌曲线，菌量为I X 103cfu/mL,反应体积lmL，当重组猪BPI 肽与细菌混合后，37°C培养,在不同时间(5min、10min、20min、40min、lh、2h、4h、8h)每次取 10 μ L于37°C平皿培养16 24h后计数菌落，并绘制时间_杀菌曲线图，见附图I。温度对重组猪BPI肽活性的影响取适当浓度重组猪BPI肽，分别置于-20、4、20、40和60°C条件下温度处理 30min后取出，测定其对大肠杆菌、猪副伤寒沙门氏菌和鼠沙门氏菌的杀菌活性，菌量为I X 103cfu/mL。以不经温度处理的重组猪BPI肽做阳性对照，pH7. 5的PBS为阴性对照，见附图2-4。pH值对重组猪BPI肽活性的影响取适当浓度重组猪BPI肽，用酸度计以O. lmol/L的HCl和2mmol/L NaOH分别将重组猪BPI肽的pH值调至3、5、7、10、12，然后分别测定其对大肠杆菌、猪副伤寒沙门氏菌和鼠沙门氏菌的杀菌活性，菌量为lX103cfu/mL。以不经酸碱处理的重组猪BPI融合蛋白做阳性对照，pH 7. 5的PBS为阴性对照，见附图5-7。细菌量对重组猪BPI肽活性的影响调整重组猪BPI肽浓度，以大肠杆菌、猪副伤寒沙门氏菌和鼠沙门氏菌为实验对象，在其它条件相同的情况下，改变接种菌量为1 X 103、I X 104、I X 105、I X 106、 IX 107cfu/mL,比较不同菌量对重组猪BPI肽的最低抑菌浓度(Minimal inhibition concentration, MIC)的影响，见附图 8-10。结果显示，经筛选获得表达重组猪杀菌蛋白效果较好的菌株，在LB培养基中用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达，对获得的重组猪杀菌蛋白进行体外杀菌活性检测，发现重组杀菌蛋白对非致病性大肠杆菌JM109、猪副伤寒沙门氏菌、鼠沙门氏菌等革兰氏阴性菌有明显的杀菌作用。附图I适当浓度的重组猪BPI蛋白在与大肠杆菌、猪副伤寒沙门氏菌、鼠沙门氏菌和金黄色葡萄球菌作用20-120min的杀菌活性最强。附图2-4结果显示重组猪BPI肽在_20、4、20、40和60°C作用30min仍具有明显的
杀菌活性。附图5-7在不同pH值条件下的杀菌活性表现为对大肠杆菌、猪副伤寒沙门氏菌、 鼠沙门氏菌在酸性条件下增强，在碱性条件下则杀菌活性减弱。附图8-10在pH 7.0条件下，观察重组猪BPI肽对大肠杆菌、猪副伤寒沙门氏菌和鼠沙门氏菌在I X 103、I X 104、I X 105、I X 106、I X 107cfu/mL等细菌浓度下的杀菌活性，结果显示重组猪BPI肽对大肠杆菌在这5种不同浓度下的MIC值分别为O. 05 μ g/mL、 I. 625 μ g/mL、3. 25 μ g/mL、6. 5 μ g/mL、13 μ g/mL ;对猪副伤寒沙门氏菌在这5种不同浓度下的 MIC 值分别为 O. 063 μ g/mL、I. 88 μ g/mL,3. 5 μ g/mL,6. 88 μ g/mL、13. 0 μ g/mL ;对鼠沙门氏菌在这5种不同浓度下的MIC值分别为O. 063 μ g/mL、I. 88 μ g/mL、3. 5 μ g/mL、7. 0 μ g/ mL、13. 88 μ g/mL。
权利要求
1.一株生产重组猪杀菌蛋白的基因工程菌，其分类命名为大肠杆菌BL21(DE3)-pET32 a(+)-pBPIN(Escherichia coli BL21 (DE3)-pET32a(+)-pBPIN)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M2011252。
2.分类命名为大肠杆M BL21(DE3)-pET32a(+)-pBPIN(Escherichia coli BL21 (DE3) -pET32a (+) -pBPIN)的一株生产重组猪杀菌蛋白的基因工程菌，表达的重组猪杀菌蛋白对革兰氏阴性菌的明显杀菌作用。
全文摘要
本发明公开了一株生产重组猪杀菌蛋白的基因工程菌及其构建以及应用，属于基因工程技术领域。本发明采用RT-PCR技术扩增黔邵花猪杀菌蛋白基因的开放阅读框5’端678bpDNA片段，插入到大肠杆菌表达载体pET32a(+)中，转化Esherichia coli BL21(DE3)，构建重组子文库，经筛选鉴定，最终得到一株可以生产重组猪杀菌蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)-pET32a(+)-pBPIN(Escherichia coli BL21(DE3)-pET32a(+)-pBPIN)CCTCC M2011252，表达产物经体外活性检测，发现重组猪杀菌蛋白对革兰氏阴性菌有明显的杀菌作用。
文档编号C12N15/70GK102586162SQ20111040111
公开日2012年7月18日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者刘胜贵, 向孙军, 魏麟 申请人:刘胜贵, 向孙军, 怀化学院, 魏麟