专利名称：核酸转运用载体组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在将核酸给予来自动物的细胞或生物时能够保护核酸不被分解并将其高效率地转运至细胞内的、低毒性且安全性高的核酸转运用载体组合物、及核酸转运用组合物。
背景技术：
近年，随着生物技术的发展，已经发现了多种在细胞内发挥生理活性功能的核酸。 例如，已知siRNA(small interfering RNA:小干扰RNA)可引起存在于细胞内的靶基因的 mRNA分解，阻碍靶基因表达(RNA interference =RNA干涉)。由此RNA干涉产生的阻碍靶基因表达的功能导致特定基因或基因组的异常表达，在减轻所患疾病症状乃至治疗方面是有用的，故人们期待将siRNA开发用作治疗药。但是，为了将以siRNA为首的核酸用作治疗药等，重要的是使siRNA在靶细胞内发挥功能，因此，确立使核酸有效地转运至靶细胞内的技术必不可少。作为将外来性核酸分子或基因转运至细胞内的技术，包括逆转录病毒、腺病毒及疱疹病毒等在内的多种病毒被用于人难治性疾病的治疗。但是，由于存在感染性、免疫反应性、生产率等问题，在治疗中有难度。因此，人们正在开发一种能克服来自病毒的问题、且可用于将核酸分子转运至细胞内的非病毒性载体。目前为止，作为促进siRNA等核酸向细胞内转运的非病毒性核酸转运用载体，例如，专利文献1中公开了特定结构的阳离子性脂质。但是，专利文献1中公开的阳离子性脂质，具有在给予培养细胞或生物体时呈现毒性的缺点。另外，专利文献2中，作为毒性较低、 可将siRNA转运至细胞内的载体组合物，公开了含有两亲性化合物及聚阳离子的组合物。 但是，即使是专利文献2中公开的组合物，在将充分量的siRNA导入细胞内时，其对细胞的毒性方面依然存在问题。以上述现有技术为背景，人们期待开发出低毒性、能够使以siRNA为代表的核酸高效率地转运到细胞内的核酸转运用载体组合物。专利文献1 特表2002-5^439号公报专利文献2 特表2005-508394号公报
发明内容
因此，本发明的目的在于解决上述现有技术中存在的问题。具体而言，本发明的目的在于提供一种在将siRNA等核酸给予来自动物的细胞或生物时能够保护核酸不被分解并将其高效率地转运至细胞内的、低毒性且高安全性的核酸转运用载体组合物、及含有该载体组合物和核酸的核酸转运用组合物。
本发明人等为了解决上述问题进行了潜心研究，发现组合含有(A)具有留核的阳离子性脂质、及(B)季铵盐型的阳离子性脂质的组合物，毒性低且能够保护核酸不被分解并使其高效率地转运至细胞内，作为核酸转运用载体是有用的。本发明是基于上述发现，通过进一步反复研究而完成的。即，本发明提供下述方案的发明项1. 一种核酸转运用载体组合物，其特征在于，含有(A)具有留核的阳离子性脂质、及(B)季铵盐型的阳离子性脂质。项2.如项1所述的核酸转运用载体组合物，其中还含有(C)油性基材。项3.如项1所述的核酸转运用载体组合物，其中，(A)成分为3 3-例_^’力’-二甲基氨基乙烷)_氨基甲酰基]胆固醇、及/或3β-[Ν’，Ν’，Ν’ -三甲基氨基乙烷]碘化胆固醇。项4.如项1所述的核酸转运用载体组合物，其中，(B)成分为选自二甲基二(十八烷基)溴化铵盐、二油酰基三甲基铵丙烷、及N-(l-(2，3-双(油酰氧基)丙基)-Ν，Ν，Ν-三甲基铵盐酸盐中的至少1种。项5.如项1所述的核酸转运用载体组合物，其中，相对于100重量份(A)成分，以 10 200重量份的比例含有⑶成分。项6.如项1所述的核酸转运用载体组合物，其中，所述组合物为SiRNA转运用载体。项7. —种核酸转运用组合物，其中含有核酸及项1至5中任一项所述的核酸转运用载体组合物。项8.如项7所述的核酸转运用组合物，其中，核酸为siRNA。项9. 一种核酸导入方法，其特征在于，通过使项7所述的核酸转运用组合物与细胞接触，使核酸导入到细胞内。项10. (A)具有甾核的阳离子性脂质及⑶季铵盐型的阳离子性脂质的组合在制造核酸转运用载体组合物中的用途。根据本发明的核酸转运用载体组合物及核酸转运用组合物，可以得到下述优异的效果。(1)能够有效率地将核酸转运至细胞内，使核酸在细胞内有效地发挥功能。(2)能够抑制核酸在生物体内或培养液中分解。(3)毒性低、安全性高。所以，上述核酸转运用载体组合物及核酸转运用组合物可以用于通过导入核酸进行的各种疾病的治疗，特别是对用低分子化合物等难于治疗的难治性疾病的治疗有效。另外，本发明的核酸转运用组合物可以进行冻干处理，因此，也具有可在冻干状态下保存的优点。
[图1]是表示在试验例1中使用各种受试试样处理细胞后，通过荧光显微镜观察来自细胞中的核酸的荧光像的结果的图。[图2]是表示在试验例2中使用各种受试试样处理细胞后，测定细胞的荧光素酶活性的结果的图。[图3]是表示在试验例3中测定大鼠的肺中脑啡肽酶(NEP)活性的结果的图。[图4]是表示在试验例4中使用各种受试试样处理后的活细胞数的测定结果的图。[图5]是表示在试验例5中将大鼠的肺组织切片用苏木精-伊红染色的结果的图。图中，苏木精将核·核糖体等染成蓝绿色，伊红将细胞质·纤维·红细胞染成红色。
具体实施例方式以下，详细地说明本发明。核酸转运用载体本发明的核酸转运用载体组合物的特征在于，含有(A)具有留核的阳离子性脂质、及(B)季铵盐型的阳离子性脂质。本发明的核酸转运用载体组合物可以作为用于将核酸转运(导入)至细胞内的核酸载体使用。本发明的核酸转运用载体组合物适用的核酸，只要是必需转运至细胞内的核酸即可，对其种类或结构没有特殊的限定。作为该核酸的具体例，可以举出siRNA、mRNA、tRNA、 rRNA、cDNA、miRNA(微RNA)、核酶、反义寡核苷酸、诱饵寡核苷酸、质粒DNA、肽核酸、三链形成性寡核苷酸(Triplex Forming Oligonucleotide，TFO)、基因等。其中，本发明的核酸转运用载体组合物在将siRNA向细胞内转运方面特别有用。本发明的核酸转运用载体适用的核酸，可以是来自人、动物、植物、细菌、病毒等的核酸，另外，也可以是通过化学合成制造的核酸。进而，上述核酸可以是单链、双链、三链中的任一种，并且对其分子量也没有特殊的限定。另外，本发明中，核酸可以为被化学、酶或肽修饰的核酸。本发明中，核酸可以单独使用 1种，也可以2种以上适当地组合使用。本发明的核酸转运用载体组合物中使用的具有留核的阳离子性脂质(以下，有时也表示为“(A)成分”)，是指具有甾核(环戊烷多氢菲环；C17H28)、显示阳离子性的脂质。 作为本发明中使用的具有留核的阳离子性脂质，只要是药理学上允许的脂质即可，没有特殊的限制，作为具体例，可以举出3β-[Ν-(Ν’，N’ - 二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、3 β-[N，，Ν，，N，-三甲基氨基乙烷]碘化胆固醇(TC-Chol)、(N，，N-双胍乙基氨基乙烷)氨基甲酰-胆固醇(bis (guanidinium) -tren-cholesterol) (BGTC)、 N-胆留烯基氧基羰基-3，7-二氮杂壬烷-1，9-二胺、β-丙氨酸-二乙醇胺-胆固醇、 N4-精胺胆固醇氨基甲酸酯(GL-67 ;N4-spermine cholesteryl carbamate)、N[N4_3_ 氨基丙基亚精胺]胆固醇氨基甲酸酯(GL-78 ；N[N4-3-aminopropylspermidine] cholesteryl carbamate)、N4-精胺胆固醇甲酰胺(GL-90 ；N4-Spermine cholesteryl carboxamide)、 Ni，N8-双(精氨酸甲酰胺)-N4-亚精胺胆固醇氨基甲酸酯(GL-95 ；N1, N8-Bis (argininc carboxamide)-N4-Spermidine cholesteryl carbamate)、N-[N1, N4, N8-三(3_ 氨基丙基)亚精胺]胆固醇氨基甲酸酯(GL-96 ；N-[N1, N4, N8-Tris (3-aminopropyl) spermidine] cholesteryl carbamate)等胆固醇衍生物(具有胆固醇骨架的阳离子性脂质)；角鲨胺 (Squalamine)、3a，7a，12a-三(3_ 氨基丙氧基)_5 β -胆烷-24-(N，N-双(3_ 氨基丙基)胺 (3a,7a,12a_Tris(3-aminopropoxy)-5 β -cholan-24- (N, N-bis(3-aminopropyl)amine)、3a, 7a, 12a-三(3_氨基丙氧基)_5 β -胆烷_24_ (N- (N- (3-氨基丙基))_3_氨基丙基)-胺 (3a,7a,12a_Tris(3-aminopropoxy)-5b-cholan_24-(N-(N-(3-aminopropyl))-3-aminop ropyl)-amine)、3a，7a，12a-三(3_ 叠氮基丙氧基)_5 β -胆烷 _24_ (N，N-双(2-氰基乙基)胺)(3a，7a，12a_Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan_24-(N，N_bis(2-cyanoethyl) amine))、3a，7a, 12a-三(3-叠氮基丙氧基)_5 β -胆烷-24- (N-(苄基氧基羰基)_N_ (羟基丙基)_ 月安)(3a, 7a, 12a-Tris (3-azidopropoxy) -5b-cholan-24- (N- (benzyloxycarbon yl)-N-(3-hydroxypropyl)-amine))等甾族化合物结合的阳离子性脂质；伞状精胺复合体 (Umbrella-spermine conjugates)等胆酸结合的阳离子性脂质；甾醇糖苷结合的阳离子性脂质；留类皂苷结合的阳离子性脂质等。上述具有留核的阳离子性单纯脂质可以单独使用 1种，或任意组合2种以上使用。作为具有留核的阳离子性脂质，优选举出胆固醇衍生物(具有胆固醇骨架的阳离子性脂质)，更优选举出3 β -[N-(N'，N’ - 二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇、及 3β-[Ν，，Ν，，Ν，-三甲基氨基乙烷]碘化胆固醇(TC-Chol)。作为本发明的核酸转运用载体组合物中使用的季铵盐型阳离子性脂质(以下，有时也表示为“(B)成分”)，只要在药理学上允许即可，没有特殊限制。作为其具体例，可以举出二甲基二(十八烷基)溴化铵盐(DDAB)、1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP) ,1,2- 二油酰基-3-三甲基铵丙烷甲基硫酸盐、1，2- 二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷、1，2- 二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷、N-(l-(2, 3-双(油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基铵盐酸盐(DOTMA)、二肉豆蔻酰基氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵盐(DMRIE)、二油酰氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵(DORIE)、二甲基二(十二烷基)溴化铵、N- (a-三甲基铵基乙酰基)-二(十二烷基)-D-谷氨酰胺盐酸盐、N- (a-三甲基铵基乙酰基)-0，0’ -双-(1H，1H，2H，2H-全氟癸烷基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、0，0’ - 二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、甲基烯丙基二(十二烷基)溴化铵、N- {p- (w-三甲基铵基丁基氧基)-苯甲酰基} - 二(十二烷基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、 9-(w-三甲基铵基丁基)-3，6_双(十二烷酰基)咔唑溴化物、二甲基二(十八烷基)铵盐酸盐、N-W-三甲基铵基癸酰基-二(十六烷基)-D-谷氨酰胺溴化物、N- {p- (w-三甲基铵基己基氧基)_苯甲酰基}-二(十四烷基)-L-谷氨酰胺溴化物、P-(w-三甲基铵基癸基氧基)-P’ -辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-l-0810)、p-{w-(b-羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}-P，-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-3-0810)、0，0，，0，，-三(十二烷酰基)-N-(w-三甲基-铵基癸酰基)_三(羟基甲基)氨基甲烷溴化物盐(TC-1-12)、1，2-二月桂基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2- 二肉豆蔻酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2- 二棕榈酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2_ 二硬脂酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2_ 二油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱等。上述季铵盐型阳离子性脂质可以单独使用1种，也可以任意组合2种以上使用。上述季铵盐型阳离子性脂质中，优选举出二甲基二(十八烷基)溴化铵盐(DDAB)、 二油酰基三甲基铵丙烷(D0TAP)、N-(l-(2，3-双(油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基铵盐酸盐(DOTMA)、0，0，_二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐(DC-6-12， η = 12 ；及DC-6-14，η = 14)、ρ-{w_(b_羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}-ρ，-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-3-0810)、&0，0’，0”-5 (十二烷酰基)_N_(W-三甲基-铵基癸酰基)-三(羟基甲基)氨基甲烷溴化物盐(TC-1-12)，更优选举出二甲基二(十八烷基)溴化铵盐(DDAB)、二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)、N-(1-(2，3-双(油酰氧基)丙基)-N，N， N-三甲基铵盐酸盐(DOTMA)。另外，本发明的核酸转运用载体组合物中，对(A)成分和(B)成分的配合比率没有特殊的限制，从将核酸有效地转运至细胞内的观点考虑，相对于100重量份㈧成分，⑶成分为10 200重量份，优选为30 150重量份，更优选为75 125重量份。另外，相对于本发明的核酸转运用载体的总量，(A)成分和⑶成分的总量例如可以为10 100重量％， 优选为20 80重量％，更优选为40 70重量％。本发明的核酸转运用载体组合物，除上述(A)及(B)成分之外，还可以含有油性基剂(以下，有时也称为(C)成分)。配合油性基剂，利用其特性，由此能够控制核酸转运用载体组合物的核酸导入效率。例如通过配合油性基剂调整核酸转运用载体组合物的比重， 可以控制细胞和核酸转运用载体组合物的接触性，改善体外的导入效率。另外，例如通过配合具有温度感受性功能的油剂作为油性基剂，能够在规定的温度条件下使核酸载体的芯破碎，诱发细胞表面的波动，提高核酸的导入效率。进而，例如通过配合具有外部刺激破碎性的油剂作为油性基剂，可以通过外部刺激使核酸载体组合物的芯破碎，诱发细胞表面的波动，提高核酸的导入效率。作为本发明的核酸转运用载体组合物中配合的油性基材，例如可以举出，全氟化碳、全氟戊烷、溴代全氟辛烷、全氟己烷、全氟三丁基胺、大豆油、精制大豆油、氢化大豆油、 大豆油非皂化物、角鲨烯、蓖麻油、丁香油、三油酸脱水山梨糖醇酯、松节油、红花油、红花油脂肪酸、油酸、棕榈油、菜子油、杂醇油、橄榄油、亚麻仁油、芝麻油、叶绿素油、巴豆油、佛手油、雪松油、橙油、茴香油、桉树油、玉米油、熏衣草油、马郁兰油、柠檬油、棉籽油、椰子油、蛋黄油、玫瑰花油、松油、杏仁油、花生油、山茶油、白樟油、春黄菊油、桂皮油、薄荷油、酯化玉米油、生姜油、罗马春黄菊油、蛇油、留兰香油(spearmintoil)、向日葵油、可可脂、小麦胚芽油、氧化锌油、氢化油、氢化植物油、轻质液体石蜡、液体石蜡、中链脂肪酸三甘油酯、貂油 (minkoil)、苦橙油、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、聚氧乙烯氢化蓖麻油100、聚氧乙烯氢化蓖麻油20、聚氧乙烯氢化蓖麻油40、聚氧乙烯氢化蓖麻油5、聚氧乙烯氢化蓖麻油50、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧基35蓖麻油、操作油等。上述油性基剂中，全氟戊烷具有温度感受性，具有在29. 5°C下通过沸腾气化的特性。另外，全氟己烷、溴代全氟辛烷、及全氟三丁基胺具有下述特性，即具有外部刺激破碎性，在由超声波照射产生的刺激等来自外部的刺激作用下，使载体组合物的芯产生空腔，使其破碎。含有该油性基剂时，作为该油性基剂的比例，只要不妨碍本发明的效果即可，没有特殊的限制，例如可以为下述比例，即相对于100重量份上述(A)成分及(B)成分的总量， 该油性基材为0. 1 50重量份，优选为1 30重量份，更优选为5 20重量份。进而，本发明的核酸转运用载体组合物中根据需要也可以含有膜融合性脂质(辅助脂质)。通过含有上述膜融合性脂质，能够进一步提高核酸向细胞内的转运效率。作为上述膜融合性脂质，例如可以举出，二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰胆碱、反式磷脂酰基磷脂酰基乙醇胺、1，2-双(10，12- 二十三烷二酰基)-磷酸乙醇胺、1，2- 二反油酰基磷酸乙醇胺、1，2_ 二(十六烷基)磷酸乙醇胺、1，2_ 二己酰基磷酸乙醇胺、1，2_ 二月桂酰基磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、1，2- 二棕榈油酰基磷酸乙醇胺、1，2- 二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1，2- 二植烷酰磷酸乙醇胺、1，2_ 二硬脂酰基磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-(10，12- 二十三烷二酰基)磷酸乙醇胺、1，2- 二油酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、1， 2- 二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、N, N- 二甲基-1，2- 二油酰基磷酸乙醇胺、N, N- 二甲基-1，2- 二棕榈酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷酰基-1，2- 二棕榈酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷酰基-1，2- 二油酰基磷酸乙醇胺、1，2- 二油酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1，2- 二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1，2- 二油酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1，2- 二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1，2_ 二油酰基磷酸乙醇胺-N-乳糖、1，2_ 二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4 (ρ-马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酸盐、二棕榈酰磷酸乙醇胺-N-[4 (ρ-马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酸盐、1，2_ 二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺苯基)丁酰胺、 1，2- 二油酰基磷酸乙醇胺-N- [4 (ρ-马来酰亚胺苯基)丁酸盐]、N-甲基-1，2- 二油酰基磷酸乙醇胺、N-甲基-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1，2_ 二油酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸盐、1，2_ 二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸盐、N-(琥珀酰)-1， 2-二油酰基磷酸乙醇胺、N-(琥珀酰)-1，2_ 二棕榈酰基磷酸乙醇胺等。其中，在本发明的核酸转运用载体组合物中优选使用二油酰基磷脂酰乙醇胺。含有该膜融合性脂质时，作为该膜融合性脂质的比例，只要不妨碍本发明的效果即可，没有特殊的限制，可以举出下述比例，即相对于100重量份上述㈧成分及⑶成分的总量，该膜融合性脂质为1 500重量份，优选为10 250重量份，更优选为25 100
重量份。根据使用形态，本发明的核酸转运用载体组合物可以含有等渗剂、赋形剂、稀释齐U、增稠剂、稳定剂、缓冲剂、保存剂等各种添加剂。上述添加剂的配合量，可以根据核酸转运用载体的使用形态适当地设定。本发明的核酸转运用载体组合物通过混合上述(A)成分、(B)成分、及根据需要混合其他成分而制造。核酸转运用组合物本发明的核酸转运用组合物是含有上述核酸转运用载体组合物和核酸的组合物， 在该核酸转运用组合物中，核酸与核酸转运用载体组合物的配合成分通过离子键或疏水键形成复合体，提高核酸向细胞内的转运率。本发明的核酸转运用组合物通过混合上述核酸转运用载体组合物和核酸，或以任意顺序混合核酸及上述核酸转运用载体组合物的配合成分而进行制造。本发明的核酸转运用组合物中，作为核酸和核酸转运用载体组合物的配合比率， 根据使用的核酸或核酸转运用载体的种类或为核酸转运对象的细胞的种类等而不同，例如，可以举出以下比例，即相对于100重量份核酸转运用载体组合物中所含的㈧及⑶成分的总量，核酸为0. 1 300重量份，优选为1 100重量份，更优选为2. 5 50重量份。另外，作为核酸转运用组合物中所含的㈧及⑶成分的总量，相对于该组合物的总量，例如可以举出10 90重量％，优选为30 80重量％，更优选为50 70重量％。根据使用形态，本发明的核酸转运用组合物可以含有等渗剂、赋形剂、稀释剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂、保存剂等多种添加剂。上述添加剂的配合量可以根据核酸转运用组合物的使用形态适当地设定。
本发明中，作为核酸被转运的细胞，可以举出培养细胞、从生物体中提取的细胞 (包含株化的细胞)、生物体内存在的细胞等。作为本发明的核酸转运用组合物的使用状态，只要能使该核酸转运用组合物与作为核酸导入对象的细胞接触即可，没有特殊限制。例如，向生物体内的细胞中转运核酸时， 例如可以举出向组织中直接注入；向静脉、皮下、肌肉、腹腔、眼内、消化器官内、牙内等注射；从鼻腔、口腔、肺等吸入给予；口服给予；通过皮肤的透皮给予；及通过口腔粘膜、阴道粘膜、眼粘膜、直肠粘膜、子宫粘膜的经粘膜给予等。另外，在向培养细胞或从生物体提取的细胞中转运核酸的情况下，可以举出将核酸转运用组合物预先添加到培养基中，在该状态下培养细胞的方法。需要说明的是，向培养细胞或从生物体提取的细胞中转运核酸时，即使在血清存在下也可以将核酸转运至细胞内。实施例以下，根据实施例等详细地说明本发明，但本发明并不限定于此。实施例1制备下述组成的核酸转运用载体组合物。
二曱基二(十八烷基)溴化铵盐0.9(Ig
3β- [Ν-(Ν', N，-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇 0.9|ag 二油酰基磷脂酰乙醇胺0.9pg
丙三醇40.5pg
精制水2μ1
OPTI - MEM培养基(Invitrongen社制)_适量
总量50μ1实施例2首先，制备下述组成的含核酸的液体。siRNA2pmolOPTI-MEM 培养基 GnvitronSen 社制)_适量总量50 μ 1然后，将50 μ 1上述所得的核酸转运用载体组合物和50 μ 1含有核酸的液体混合， 在室温下培养20分钟，由此制备siRNA转运用组合物。实施例3制备下述组成的核酸转运用载体组合物。
权利要求
1.一种核酸转运用载体组合物，其特征在于，含有(A)具有胆固醇骨架的阳离子性脂质、及⑶季铵盐型的阳离子性脂质，其中，相对于100重量份㈧成分，以10 200重量份的比例含有(B)成分，所述季铵盐型的阳离子性脂质为选自下述物质中的至少一种二甲基二(十八烷基)溴化铵盐、二油酰基三甲基铵丙烷、N-(l-(2，3-双(油酰氧基)丙基)_N， N，N-三甲基铵盐酸盐、0，0’ - 二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、0，0，- 二(十四烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、p-{w_(b-羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}_P’ -辛氧基偶氮苯溴化物盐、及0，0’，0”_三(十二烷酰基)-N_(w-三甲基-铵基癸酰基)_三(羟基甲基)氨基甲烷溴化物盐。
2.如权利要求1所述的核酸转运用载体组合物，其中还含有(C)油性基材。
3.如权利要求1所述的核酸转运用载体组合物，其中，(A)成分为3β-[Ν-(Ν’，Ν’- 二甲基氨基乙烷)_氨基甲酰基]胆固醇、及/或3β-[Ν’，Ν’，Ν’ -三甲基氨基乙烷]碘化胆固醇。
4.如权利要求1所述的核酸转运用载体组合物，其中，(B)成分为选自二甲基二(十八烷基)溴化铵盐、二油酰基三甲基铵丙烷、及N-(l-(2，3-双(油酰氧基)丙基)-Ν，Ν，Ν-三甲基铵盐酸盐中的至少1种。
5.如权利要求1所述的核酸转运用载体组合物，其中，还含有(D)膜融合性脂质。
6.如权利要求1所述的核酸转运用载体组合物，其中，相对于100重量份(A)成分，以 30 150重量份的比例含有(B)成分。
7.如权利要求2所述的核酸转运用载体组合物，其中，相对于100重量份(A)成分及 (B)成分的总量，以0. 1 50重量份的比例含有(C)成分。
8.如权利要求5所述的核酸转运用载体组合物，其中，相对于100重量份(A)成分及 ⑶成分的总量，以1 500重量份的比例含有⑶成分。
9.如权利要求1所述的核酸转运用载体组合物，所述组合物为siRNA转运用载体。
10.一种核酸转运用组合物，含有核酸及权利要求1至9中任一项所述的核酸转运用载体组合物。
11.如权利要求10所述的核酸转运用组合物，其中，核酸为SiRNA。
12.一种核酸导入方法，其特征在于，通过使权利要求10所述的核酸转运用组合物与细胞接触，使核酸导入到细胞内，所述细胞为培养细胞或从生物体中提取的细胞。
13.含有(A)具有胆固醇骨架的阳离子性脂质及(B)季铵盐型的阳离子性脂质的组合物在制备核酸转运用载体中的应用，其中，相对于100重量份(A)成分，以10 200重量份的比例含有(B)成分，所述(B)季铵盐型的阳离子性脂质为选自下述物质中的至少一种 二甲基二(十八烷基)溴化铵盐、二油酰基三甲基铵丙烷、N-(l-(2，3-双(油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基铵盐酸盐、0，0’_二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、0，0’_ 二(十四烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、p-{w_(b-羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}_p’ -辛氧基偶氮苯溴化物盐、及0，0’，0”_三(十二烷酰基)-N-(w-三甲基-铵基癸酰基)-三(羟基甲基)氨基甲烷溴化物盐。
14.如权利要求13所述的应用，所述组合物还含有(C)油性基材。
15.如权利要求13所述的应用，其中，㈧成分为3β-[Ν-(Ν’，N’- 二甲基氨基乙烷)_氨基甲酰基]胆固醇、及/或3β-[Ν’，Ν’，Ν’ -三甲基氨基乙烷]碘化胆固醇。
16.如权利要求13所述的应用，其中，(B)成分为选自二甲基二(十八烷基)溴化铵盐、二油酰基三甲基铵丙烷、及N- (1- (2，3-双(油酰氧基)丙基)-N, N, N-三甲基铵盐酸盐中的至少1种。
17.如权利要求13所述的应用，其中，组合物还含有(D)膜融合性脂质。
18.如权利要求13所述的应用，其中，组合物中相对于100重量份(A)成分，以30 150重量份的比例含有⑶成分。
19.如权利要求14所述的应用，其中，组合物中相对于100重量份㈧成分及⑶成分的总量，以0. 1 50重量份的比例含有(C)成分。
20.如权利要求17所述的应用，其中，组合物中相对于100重量份㈧成分及⑶成分的总量，以1 500重量份的比例含有⑶成分。
21.如权利要求13所述的应用，所述核酸转运用载体为siRNA转运用载体。
全文摘要
本发明涉及一种核酸转运用载体组合物。本发明的目的在于提供一种在将siRNA等核酸给予来自动物的细胞或生物时能够保护核酸免于分解并使其高效地转运至细胞内的、低毒性的核酸转运用载体组合物，及含有该载体组合物和核酸的核酸转运用组合物。本发明通过组合(A)具有甾核的阳离子性脂质及(B)季铵盐型的阳离子性脂质，将其配合，制备核酸转运用载体组合物。另外，混合该核酸转运用载体组合物和核酸来制备核酸转运用组合物。
文档编号C12N15/88GK102512689SQ20111046114
公开日2012年6月27日 申请日期2006年10月17日 优先权日2005年10月18日
发明者丰福秀一, 佐藤正子, 关口和生, 宫尾英男 申请人:大塚制药株式会社